Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja i analiza komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64344

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy protokół do kwantyfikacji i różnicowania limfocytów B mięśnia sercowego na podstawie ich lokalizacji w przestrzeni wewnątrznaczyniowej lub śródbłonkowej za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Coraz więcej dowodów pokazuje, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w kontekście fizjologii mięśnia sercowego i adaptacji mięśnia sercowego do urazu. Jednak w literaturze pojawiają się sprzeczne dane dotyczące częstości występowania limfocytów B mięśnia sercowego. Doniesiono, że limfocyty B są zarówno jednymi z najbardziej rozpowszechnionych komórek odpornościowych w sercu gryzoni, jak i obecnymi, ale znacznie rzadziej niż komórki szpikowe lub są dość rzadkie. Podobnie kilka grup opisało, że liczba komórek B mięśnia sercowego wzrasta po ostrym niedokrwiennym uszkodzeniu mięśnia sercowego, ale jedna grupa nie zgłosiła żadnych zmian w liczbie komórek B uszkodzonego mięśnia sercowego. Wdrożenie wspólnej, powtarzalnej metody oceny częstości występowania komórek B mięśnia sercowego ma kluczowe znaczenie dla harmonizacji obserwacji z różnych grup badawczych, a tym samym promowania postępu w badaniach nad interakcjami komórek B w mięśniu sercowym. Opierając się na naszym doświadczeniu, pozornie kontrastujące obserwacje przedstawione w literaturze prawdopodobnie wynikają z faktu, że mysie komórki B mięśnia sercowego są w większości wewnątrznaczyniowe i połączone ze śródbłonkiem mikronaczyniowym. Dlatego liczba limfocytów B odzyskanych z mysiego serca jest wyjątkowo wrażliwa na warunki perfuzji stosowane do oczyszczania narządu i na zastosowaną metodę trawienia. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który w określony sposób uwzględnia te dwie krytyczne zmienne. Protokół ten umożliwia powtarzalną, opartą na cytometrii przepływowej analizę liczby mysich komórek B mięśnia sercowego i pozwala naukowcom odróżnić pozanaczyniowe i wewnątrznaczyniowe komórki B mięśnia sercowego.

Wprowadzenie

Limfocyty B to wysoce wyspecjalizowane komórki odpornościowe, które odgrywają ważną rolę zarówno w adaptacyjnych, jak i wrodzonych odpowiedziach immunologicznych1. Istnieją dwie główne populacje komórek B: mniejsza populacja komórek B1, które są w większości wytwarzane podczas życia embrionalnego, oraz przeważająca populacja komórek B2, które są wytwarzane w dorosłym życiu w szpiku kostnym1. Po dojrzewaniu w szpiku kostnym limfocyty B migrują do pierwotnych i wtórnych narządów limfatycznych. Stamtąd nieprzerwanie krążą między narządami limfatycznymi, przemieszczając się przez naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne2. Limfocyty B wyrażają na swojej powierzchni specyficzne przeciwciała, które działają jako receptory. Kiedy limfocyty B napotykają antygen, który wiąże się z ich receptorem, może zostać wyzwolony sygnał aktywujący. Aktywowane limfocyty B albo migrują do tkanki, w której znaleziono antygen, albo wracają do szpiku kostnego, gdzie mogą dojrzeć do komórek plazmatycznych wytwarzających przeciwciała3,4.

Ostatnio doceniono, że w sercu znajduje się spora populacja komórek B. Badania na gryzoniach wykazały, że limfocyty B kolonizują serce we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego5, oraz że komórki B związane z mięśniem sercowym są w większości wewnątrznaczyniowymi, naiwnymi komórkami B2 przylegającymi do śródbłonka6,7, z niewielkim procentem komórek B17. Nadal istnieje wiele obszarów niepewności, ale dostępne dane wskazują, że limfocyty B odgrywają ważną rolę zarówno w nieleczonym sercu, jak i w kontekście adaptacji mięśnia sercowego do urazu.

Badania na naiwnym mysim sercu wykazały, że na początku badania komórki B mięśnia sercowego są głównie zlokalizowane w przestrzeni wewnątrznaczyniowej, przylegającej do śródbłonka (>95% mysich komórek B serca stwierdzono zlokalizowane w przestrzeni wewnątrznaczyniowej). Stwierdzono, że te limfocyty B mają wzorce ekspresji genów inne niż te z krążących komórek B wyizolowanych z krwi obwodowej. Analiza naiwnych serc od zwierząt z niedoborem komórek B i kontroli syngenicznej wykazała, że zwierzęta pozbawione komórek B miały mniejsze serca i wyższą frakcję wyrzutową6. Wszystkie te dowody sugerują, że limfocyty B mogą modulować wzrost mięśnia sercowego i / lub funkcję mięśnia sercowego, i że nie tylko śródmiąższowe, ale także wewnątrznaczyniowe komórki B mogą być odpowiedzialne za takie obserwacje. Stwierdzono również, że limfocyty B modulują fenotyp makrofagów rezydujących w mięśniu sercowym8.

Kilka badań wykazało, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w kontekście adaptacji mięśnia sercowego do urazu8,9,10,11,12,13. Limfocyty B gromadzą się przejściowo w uszkodzonym sercu, prawdopodobnie poprzez mechanizm zależny od CXCL13-CXCR511,13. Stamtąd limfocyty B sprzyjają niekorzystnej przebudowie serca poprzez kilka mechanizmów, które obejmują rekrutację monocytów za pośrednictwem cytokin9,12. Ponadto limfocyty B mogą wytwarzać przeciwciała przeciwko białkom serca, które mogą sprzyjać rozszerzaniu się uszkodzenia serca i niekorzystnej przebudowie serca poprzez kilka mechanizmów14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25. Limfocyty B mogą również wywierać działanie ochronne na uszkodzone serce poprzez wydzielanie IL-1010.

Wraz ze wzrostem liczby grup badających rolę limfocytów B w naiwnym i uszkodzonym sercu, coraz ważniejsze staje się zdefiniowanie wspólnych protokołów, aby prawidłowo określić ilościowo i ocenić komórkę B mięśnia sercowego, a tym samym uniknąć niespójności, które już zaczęły pojawiać się w literaturze. Do tej pory doniesiono, że limfocyty B są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych komórek odpornościowych w sercu gryzoni7 i są obecne znacznie rzadziej niż komórki szpikowe26,27, lub są dość rzadkie28. Podobnie, kilka grup opisało, że liczba komórek B mięśnia sercowego wzrasta po ostrym niedokrwiennym uszkodzeniu mięśnia sercowego7,9,13, ale jedna grupa nie zgłosiła żadnych zmian w liczbie limfocytów B uszkodzonego mięśnia sercowego29. Badania na komórkach odpornościowych serca rzadko podają szczegóły dotyczące warunków perfuzji i nie ma zgody co do warunków trawienia. Ponieważ w sercu gryzoni duża część limfocytów B jest wewnątrznaczyniowa, a ekstrakcja komórek odpornościowych z mięśnia sercowego jest w dużym stopniu zależna od zastosowanej metody trawienia, różnice opisane w literaturze mogą być wynikiem różnic w perfuzji narządowej i trawieniu tkanek.

Przedstawiona tutaj jest szczegółowa metoda ilościowego oznaczania mysich komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej, która maksymalizuje wydajność odzyskiwania komórek B poprzez optymalizację warunków perfuzji i trawienia oraz pozwala na rozróżnienie wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych komórek B mięśnia sercowego6. Ten protokół jest adaptacją i optymalizacją innych podobnych protokołów, które rozróżniają wewnątrznaczyniowe i śródmiąższowe komórki odpornościowe28,30,31.

W tym protokole standaryzujemy perfuzję mięśnia sercowego, aby wyeliminować limfocyty B unoszące się w przestrzeni wewnątrznaczyniowej bez usuwania biologicznie istotnych komórek B przylegających do śródbłonka mikronaczyniowego. Ponadto, opierając się na wcześniejszych protokołach, które opisywały stosowanie dożylnego wstrzykiwania przeciwciał w celu odróżnienia wewnątrznaczyniowych od śródmiąższowych komórek odpornościowych32, i wykorzystując fakt, że limfocyty B wyrażają marker powierzchniowy B22033, pokazujemy, jak odróżnić wewnątrznaczyniowe i zewnątrznaczyniowe komórki B mięśnia sercowego poprzez donaczyniowe wstrzyknięcie przeciwciała specyficznego dla B220 bezpośrednio przed uśmierceniem zwierzęcia i sercem Perfuzji. Protokół ten jest istotny dla badań każdego naukowca zainteresowanego włączeniem analizy limfocytów B mięśnia sercowego w naiwnym i uszkodzonym sercu. Powszechne wdrożenie tego protokołu zmniejszy niespójności między grupami badawczymi, umożliwi analizę zmian w wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych pulach komórek B mięśnia sercowego, a tym samym przyczyni się do postępu odkryć w dziedzinie immunologii serca.

Podsumowując, protokół przedstawia zoptymalizowany przepływ pracy do ilościowego oznaczania i analizy komórek B mięśnia sercowego za pomocą cytometrii przepływowej, a jednocześnie rozróżniania komórek znajdujących się w przestrzeni pozanaczyniowej i wewnątrznaczyniowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone za zgodą IACUC w Johns Hopkins University School of Medicine.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj bufor FACS zgodnie z opisem w Tabeli 1.
  2. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość CO2 do eutanazji zwierząt.
  3. Przygotuj miejsce do preparacji (umieść podkładkę pod ławkę i umieść taśmę i narzędzia do preparowania w pobliżu).
  4. Oznacz probówki o pojemności 15 ml, umieść 3 ml HBSS z wapniem i magnezem w każdej probówce (patrz Tabela materiałów) i umieść je na lodzie (jedna probówka na serce i dodatkowa dla grupy referencyjnej/kontroli cytometrii przepływowej). Napełnij również małe (35 mm) szalki Petriego HBSS.
  5. Włączyć wytrząsarkę z regulowaną temperaturą, ustawić ją na 37 °C i wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  6. Przygotować pompę strzykawkową i ustawić natężenie przepływu na 3 ml/min. Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml HBSS, zalej przewód probówki buforem i usuń wszelkie pęcherzyki.

2. Wewnątrznaczyniowe barwienie komórek B (in vivo)

  1. Zważ 12-tygodniowego samca myszy szczepu C57BL/6J. Załadować strzykawkę insulinową o pojemności 3/10 ml ze 100 μl rozcieńczenia przeciwciała B220 (1:10, w PBS). Przykryć strzykawkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
  2. Znieczul jedną mysz.
    1. Zastosować iniekcję dootrzewnową 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 400 mg/kg i odczekać 10-20 min.
      UWAGA: Monitoruj oddech i ruch myszy. Gdy mysz przestanie się poruszać, stymuluj ból, szczypiąc palec u nogi; Brak odruchu odstawienia wskazuje na odpowiednie znieczulenie.
    2. Jeśli odpowiednie znieczulenie nie zostanie osiągnięte w ciągu 20 minut, można podać dodatkową dawkę środka znieczulającego w dawce 100 mg/kg, a co 5 minut należy dokonywać oceny kinetyki myszy, odruchu odstawienia i oddychania.
  3. Umieść mysz na stole laboratoryjnym na podkładce ławkowej pochylonej w jedną stronę, delikatnie pociągnij skórę pleców i lekko dociśnij ciało do ławki, aby oko wystawało.
  4. Wstrzyknąć rozcieńczone przeciwciało B220 z kroku 2.1 przez wstrzyknięcie zaoczodołowe.
    1. Wprowadzić strzykawkę do oka pod kątem 45° od płaszczyzny strzałkowej głowy myszy. Powoli wstrzykiwać roztwór. Jeśli wyczuwalny jest opór, wyjąć strzykawkę i wprowadzić ją ponownie. Poczekaj 2 min.
      UWAGA: Wydłużony czas inkubacji zagroziłby zdolności do rozróżnienia wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych komórek B, ponieważ dałby czas wstrzykniętemu przeciwciału na dyfuzję poza naczynia krwionośne.
  5. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z przepisami IACUC.
    1. Otwórz przepływ CO2 do komory eutanazyjnej z szybkością 0,5 l/min lub zalecanym natężeniem przepływu w zależności od wielkości komory.
    2. Umieść mysz w komorze na zalecany czas, upewniając się, że już nie oddycha. Usuń go i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną metodę eutanazji.
    3. Gdy mysz zostanie poddana eutanazji, natychmiast przystąp do pobierania narządów i perfuzji.

3. Kolekcja serc

  1. Otwór na klatkę piersiową.
    1. Przytrzymaj skórę myszy kleszczami w okolicy nadbrzusza. Wykonaj 2 mm otwór w skórze za pomocą nożyczek i użyj kleszczy, aby odkleić skórę, aby odsłonić warstwę powięzi, błyszczącą, półprzezroczystą warstwę klatki piersiowej i brzucha. Przeciąć w epigastrze przez powięź i otrzewną, aby otworzyć ścianę brzucha i odsłonić wyrostek mieczykowaty. Zacisnąć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy hemostatycznych.
    2. Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie przez ścianę klatki piersiowej na poziomie linii środkowej obojczyka z każdej strony i podnieś przednią ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić zawartość śródpiersia, używając kleszczy hemostatycznych jako ciężaru, aby utrzymać otwór.
  2. Perfuzja i ekstrakcja serca.
    1. Za pomocą kleszczy usuń tłuszcz lub tkankę grasicową otaczającą serce.
    2. Trzymaj aortę bezpiecznie od tyłu za pomocą kleszczy. Wprowadzić igłę strzykawki (25 G) do wierzchołka serca. Ukrwić z 3 ml HBSS z szybkością 3 ml/min.
      UWAGA: Monitoruj perfuzję. Wątroba powinna się wypełnić, a krew w naczyniach wieńcowych powinna zostać całkowicie usunięta. Zaleca się stosowanie pompy strzykawkowej skalibrowanej na 1 ml / minutę w celu utrzymania stałego przepływu.
    3. Przetnij aortę nożyczkami i wyjmij serce. Umyj serce na szalce Petriego za pomocą HBSS, aby usunąć pozostałą krew. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń tłuszcz, tkankę łączną i grasicę, a następnie osusz serce. Zważ izolowane serce i zanotuj wagę w miligramach . Zmiel serce w temperaturze pokojowej na małe kawałki (1-2 mm) za pomocą ostrza.
      UWAGA: Serca dorosłych myszy mogą ważyć od 0,090 do 0,210 mg.
    4. Zmierz masę tkanki serca i umieść 60 mg mielonego serca do wytrawienia w probówce o pojemności 15 ml z 3 ml HBSS. Zachować pozostałą tkankę serca i umieścić w probówce z napisem "Referencyjna tkanka kontrolna"; Zostanie to wykorzystane do kontroli kompensacji sygnału żywego i martwego oraz autofluorescencji.

4. Trawienie serca i barwienie komórek

  1. Dodać enzymy do każdej probówki zawierającej tkankę mieloną (patrz Tabela 1). Dodać 0,5 μl / mg DNazy 1 (300 jednostek na 60 mg tkanki serca), 0,5 μl / mg kolagenazy II (625 jednostek na 60 mg tkanki serca) i 0,2 μl / mg hialuronidazy (50 jednostek na 60 mg tkanki serca) do probówki.
  2. Umieścić reakcję trawienia w wytrząsarce na 30 minut przy 300 obr./min. Ustaw ruszt wytrząsarki pod kątem około 25°.
  3. Dodać 7 ml HBSS do każdej z 15 ml probówek reakcyjnych i wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C z przyspieszeniem i łamaniem ustawionym na umiarkowane lub wolne. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 5 ml buforu do lizy ACK w celu usunięcia czerwonych krwinek. Inkubować w buforze do lizy ACK przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodaj 10 ml PBS do każdej probówki, wymieszaj, a następnie przefiltruj do probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 40 μm. Upewnij się, że wszystkie zanieczyszczenia znajdują się w komorze filtra. Rozbij wszelkie zanieczyszczenia na filtrze za pomocą tłoka strzykawki, aż zostanie całkowicie zawieszony w komorze filtra.
  5. Dodawać PBS przez filtr, aż objętość osiągnie 25 ml na serce; umożliwi to przejście zawieszonych komórek przez filtr. Dodać dodatkowe 25 ml PBS do referencyjnej probówki z tkankami kontrolnymi i podzielić objętość na różne probówki (po 25 ml każda). Oznacz jedną z probówek jako "Niepoplamioną", a drugą jako "Żywe-martwe". Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym momencie przygotuj rozcieńczenie do żywej martwej plamy (rozcieńczenie: 1:500 w 1x PBS).
  6. Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić osad w niebarwionej probówce w 100 μl PBS, a każdy z pozostałych granulek w 100 μl rozcieńczonej żywej martwej plamy. Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności, przykrywając wiadro z lodem folią aluminiową.
  7. Dodać 500 μl buforu FACS do każdej próbki i przenieść ją do oznakowanej probówki FACS przez filtr 40 μm. Odwirować probówki FACS o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 μl buforu FACS.
  8. Dodać 50 μl roztworu blokującego Fc (patrz Tabela 1) do każdej probówki, z wyjątkiem probówek niebarwionych i żywych. Wymieszać i inkubować przez 5 minut.
  9. Dodać 50 μl roztworu mieszaniny przeciwciał (patrz tabela 1) do każdej probówki, z wyjątkiem probówek niebarwionych i żywych trupów, i inkubować przez 30 minut w ciemności, przykrywając wiadro z lodem folią aluminiową.
  10. Dodać 2 ml buforu FACS do każdej probówki i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 300-500 μl buforu FACS.

5. Cytometria przepływowa

  1. Konfiguracja ustawień sterowania instrumentem.
    UWAGA: W tym protokole próbka jest analizowana za pomocą 4-laserowego cytometru przepływowego Cytek Aurora. Inny odpowiedni cytometr przepływowy może być użyty do wykrycia markerów będących przedmiotem zainteresowania.
    1. Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (patrz Tabela materiałów). W górnej części okna wybierz zakładkę Przejęcie i kliknij Nowy +. Zostanie wyświetlone okno o nazwie Utwórz nowy eksperyment.
    2. W sekcji Biblioteka, w polu Typ do filtrowania wpisz PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 i Zombie Aqua, klikając przycisk Dodaj po wpisaniu każdego z nich. Nazwy fluoroforów powinny być widoczne po prawej stronie. Następnie kliknij przycisk Dalej, aby przejść do zakładki Grupa.
    3. Na karcie Grupa kliknij symbol z rurą, aby dodać serce do analizy.
    4. Kliknij grupę + Referencja, a wyświetli się okno. W kolumnie znacznika fluorescencyjnego wybierz Zombie Aqua, a w kolumnie typu kontrolki wybierz Komórki, a następnie kliknij przycisk Zapisz.
    5. Kliknij Dalej> zakładkę Znaczniki; zostanie wyświetlona tabela z nazwami fluoroforów. Wpisz odpowiedni marker komórkowy w pierwszym wierszu każdej kolumny fluoroforowej i wpisz Enter: CD45 dla PerCP-Cy5.5; CD19 dla BV421; CD11b dla Alexa Fluor 700; B220 dla PE; i żywe trupy dla Zombie Aqua.
    6. Kliknij dwukrotnie przycisk Dalej, aby przejść do karty Pozyskiwanie. W polu Zdarzenia do zarejestrowania grupy eksperymentalnej wpisz 10 000 000, a w tym samym polu dla grupy referencyjnej wpisz wiersz 200 000. Kliknij Zapisz i otwórz. Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne: Czas zatrzymania do 10 000 i Zatrzymanie głośności do 3 000.
    7. W lewym dolnym rogu kliknij Sterowanie instrumentem. Ustaw napięcie na FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Następnie wybierz kontrolkę Pozyskiwanie. W przypadku opcji Natężenie przepływu wybierz opcję Wysokie z menu rozwijanego.
  2. Pobrać próbki referencyjne za pomocą cytometru i rozmieszać w oprogramowaniu.
    1. Spłukać niezabarwioną rurkę serca i umieścić ją bezpiecznie na porcie do wstrzykiwania próbki (SIP). Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę, a następnie kliknij przycisk Start w panelu sterowania akwizycją oprogramowania cytometru i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane. Zrób to samo z żywą martwą tkanką serca.
    2. Wybierz menu Unmix i ustaw następujące elementy sterujące:
      1. Zaznacz pola wyboru PE, PerCP-Cy5.5, BV421 i Alexa Fluor 700 w kolumnie z biblioteki. Upewnij się, że pole Zombie Aqua nie jest zaznaczone w tej samej kolumnie. Na dole zaznacz opcję Autofluorescencja jako znacznik fluorescencyjny.
      2. Kliknij przycisk Dalej, aby przejść do karty Identyfikuj populacje pozytywne/negatywne. W tej zakładce zostanie wyświetlony wykres FSC-A vs. SSC-B-A. Kliknij i przeciągnij punkty wielokąta, aby zaznaczyć obszar o wysokości od 1,0 m do 4,0 m na osi FSC-A oraz od 0,2 m do 3,0 m na osi SSC-B-A.
      3. Na następnym wykresie po prawej stronie V5-A zostanie wyświetlony na osi X. Przesuń bramki, aby wybrać połowę piku po prawej stronie jako dodatnią, a region po lewej stronie wykresu jako ujemny. Na wykresie zatytułowanym Grupa odniesienia — niebarwiona wybierz populację w podobnym zakresie. W tym celu nie trzeba ustawiać niezabarwionego dodatnio-ujemnego.
  3. Pobieranie próbek eksperymentalnych.
    1. Dla każdej probówki zawierającej próbkę dla pojedynczej myszy, należy wymieszać rurkę i umieścić ją bezpiecznie na SIP. Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę, a następnie kliknij przycisk Start w panelu sterowania akwizycją oprogramowania cytometru i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane.
  4. Strategia bramkowania.
    1. Wybierz kartę Domyślny arkusz niemieszany. Utwórz wykres FSC-A i SSC-A za pomocą narzędzia Wykres punktowy na górze. Wybierz zdarzenia wyższe niż 0,4 m na osi FSC-A i wyższe niż 0,8 m na osi SSC-A za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów. Kliknij dwukrotnie w tym zaznaczeniu, a zostanie wyświetlony nowy wykres.
    2. Na nowo utworzonym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi X i wybierz AF-A; kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi Y i wybierz opcję Żywa plama. Kliknij narzędzie do zaznaczania prostokąta u góry i zaznacz wszystkie zdarzenia poniżej 105 na osi żywe-martwe, które odpowiadają dolnemu sygnałowi żywe-martwe. Kliknij dwukrotnie w tym zaznaczeniu, a zostanie wyświetlony nowy wykres.
    3. Na nowym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać PerCP-Cy5.5-A dla osi X i SSC-A dla osi Y. Korzystając z narzędzia Zaznaczanie prostokąta, zaznacz zdarzenia wyższe niż 104 na osi PerCP-Cy5.5-A, które odpowiadają dodatnim komórkom CD45. Kliknij dwukrotnie na zaznaczenie, a wyświetli się nowy wykres.
    4. Na nowym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać FSC-A dla osi X i FSC-H dla osi Y. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów wybierz zdarzenia, które podążają za trendem, w których wartość FSC-A i wartość SSC-A są takie same; Dzięki temu dublety komórkowe zostaną usunięte, a populacja w zaznaczeniu będzie określana jako populacja CD45+. Kliknij dwukrotnie zaznaczenie, aby wyświetlić nową działkę z populacją CD45+.
    5. Na wykresie populacji CD45+ kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać BV421 na osi X vs. SSC-A na osi Y. Za pomocą narzędzia Wybór wielokąta wybierz populację po prawej stronie osi BV421. To jest populacja komórek B. Kliknij dwukrotnie dwukrotnie w tej populacji, aby utworzyć dwa nowe wykresy z populacją komórek B.
      1. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby skonfigurować pierwszy wykres komórek B z PE-A na osi X i BV421-A na osi Y. Populacja po prawej stronie odpowiada wewnątrznaczyniowym komórkom B, a populacja po lewej reprezentuje śródmiąższowe komórki B. Użyj narzędzia Zaznaczanie wielokątów, aby zaznaczyć oba te elementy.
      2. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby skonfigurować drugi wykres komórek B z Alexa Fluor 700-A na osi X i SSC-A na osi Y. Populacja po lewej odpowiada komórkom CD11b, a zdarzenia po prawej (jeśli występują) odpowiadają komórkom CD11b +.
      3. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy wybór, a następnie kliknij Właściwości bramy. Kliknij pozycję Liczba i % elementu nadrzędnego, aby wyświetlić rozmiary i wartości procentowe. Rejestruj liczbę zdarzeń i wartości procentowe w celu dalszej analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zakończeniu akwizycji i zebraniu wszystkich zdarzeń, dane powinny być analizowane zgodnie ze standardową praktyką cytometrii przepływowej. Punkt ciężkości analizy będzie się różnić w zależności od indywidualnego celu każdego eksperymentu. W tym przypadku kontynuowano kwantyfikację wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych komórek B, wyrażoną jako liczba komórek na mg tkanki.

Podczas korzystania z cytometru spektralnego, zaleca się rozpoczęcie analizy od początkowego bramkowania w celu usu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Coraz więcej dowodów wskazuje, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w kontekście fizjologii mięśnia sercowego i przebudowy/adaptacji mięśnia sercowegodo urazu 7,8,9,10,11,12,13,36. Cytometria przepływowa jest doskonałym narzędziem do badania populacji komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Luigi Adamo jest współzałożycielem i-Cordis, LLC, firmy zajmującej się opracowywaniem cząsteczek immunomodulujących do leczenia niewydolności serca, ze szczególnym zainteresowaniem pochodnymi pirfenidonu, leku modulującego limfocyty B. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z grantów NHLBI 5K08HLO145108-03 i 1R01HL160716-01 przyznanych Luigiemu Adamo.

Cytometr przepływowy Aurora użyty do opracowania tego badania został sfinansowany przez NIH Grant S10OD026859. Dziękujemy za wsparcie rdzenia cytometrii przepływowej JHU Ross.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 700 przeciwciało przeciw myszy/ludzkiemu CD11b101222BioLegend100 µ G 200 &MIKRO; L
(CellTreat 29481) Sitko do komórek, 40 & mikro; m, NiebieskieQBIAP303Southern Labware
0,5 ml Naturalna probówka do mikrowirówek1605-0000SealRite, USA Scientific
0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań, USP114-055-101Jakość Biologiczna0,90%
1,5 ml Naturalna probówka do mikrowirówek1615-5500SealRite, USA Scientific
10 µ l Końcówki filtrujące TipOne z podziałką11213810USA Scientific
1000 i mikro; L Końcówki filtra z podziałką TipOne11267810USA Scientific
15 mL Probówka wirówkowa, zatyczka uszczelniająca, polipropylen, 1-drogowy zawór odcinający Corning bez RNaz/DNaz430052
L Końcówki filtra TipOne z podziałką11208810USA Scientific
3-drogowy zawór odcinający, poliwęglanSVPT953ECT Produkcja
5 ml probówka z okrągłym dnem z polistyrenu, 12 x 75 mm 352054wirówkowa marki
o pojemności 50 ml, zatyczka uszczelniająca, polipropylen, bez RNaz/DNaz430290Corning
ACK ( Bufor lizujący chlorek amonu i potasu118-156-101Jakość Biologicznaosmolalność: 290 + lub -5% mOsm/kg H20
Adapter 4x50ml, do wiadra prostokątnego 250 mL w rotorze A-4-635810759005Eppendorf
Adapter do probówek wirówkowych 15 mL, 9 probówek w adapterze, stożkowe dno do użytku z wirnikiem Model A-4-6222638289Eppendorf
Adapter do 15 rur okrągłodennych 2,6 – 7 ml, do prostokątnego wiadra 250 ml w Rotor A-4-6222638246Folia aluminiowa Eppendorf
Rolka 12 cali x 75' .0007UPC 109153Reynolds Wrap
- MyszRWD-AICMV-100Strzykawka Conduct Science
BD Luer z dołączoną igłą 25 G x 5/8 cala, sterylna, jednorazowego użytku, 1 ml309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulina Strzykawki 29G 1cc 1/2" 100-PackCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 Przeciwciało przeciw myszom CD19115537BioLegend50 µ g/mL
CAPS do rurek przepływowych z siatką siatkową 35 i mikro; m, Dwupozycyjny do probówek 12 x 75 mm, sterylnyT9009Southern Labware
Dwutlenek węgla USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Zlewka o niskiej formie, szkło, 500 mlUX-34502-46Cole-Parmer
Collagenase 2LS004176Sigma-Aldrich
mosiądz chromowany 1/4" żeński NPT x 1/4" zadziorY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora CytometrCytek Biosciences
Diss 1080 Nypel 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet  3 - Elektroniczny kontroler pipet4430000018Elektroniczna waga Eppendorf
, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Wirówka Eppendorf 5810R5810REppendorf Eppendorf
Research plus 1-kanałoweEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, miska do lodu o potrójnej gęstości (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HialuronidazaH3506Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight13018-14Fine Science Tools
Luer Slip Strzykawka sterylna, jednorazowa, 20 ml302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Underpads, Umiarkowany4033- CS150McKesson
Navigator Wielofunkcyjna przenośna wagaNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7,4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
przeciw myszy/ludzkiemu CD45R/B220103208BioLegend200 &mikro; g/ml
PerCP/cyjanina 5,5 Przeciwciało przeciw mysim CD45103132BioLegend100 i mikro; g 500 uL
szalka Petriego, sterylny polistyren 35 mm x 10 mmFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nakrętka/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Potężny 6-watowy podwójny oświetlacz LED na gęsiej szyiLED-6WIgła AmScope
PrecisionGlide 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson i spółka
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (mysi blok BD Fc) klon 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0,5 mg / ml
R 4.1.1Fundacji R
9501250000Accutec Blades Inc
Regulator analityczny dwustopniowy dopływ 0-25 psi CGA320 3500 psi wlotY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, z 4 x 250 ml prostokątne wiadraRotor A-4-62Eppendorf
Pipeta serologiczna, zatkana, 10 mL, sterylna, niepirogenna/bez endotoksyn, niecytotoksyczna, 1 szt./blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Taśma etykietowa SigmaL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Złączka, PP, Prosta, Męska Luer Lock x 1/8" Króciec węża; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Ścienne rurki laboratoryjne, rozmiar S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Ścianka x 50' DługaCG-730-003Laboratorium Excelon
Strzykawka PP/PE bez igły, 3 mlZ683566Millipore Sigma
Pompa strzykawkowa55-1199 (95-240)Aparat
Thomas 3-kanałowy zegar alarmowy TM105009371W13
Stojak na probówki, 12  pozycje, 6 dla 5.0  ml oraz 15  probówki ml i 6 na 25  mL oraz 50  Probówki mL, polipropylenowe, pozycje numerowane, do autoklawowania30119835Eppendorf
Tube Rack, 12  stanowiska, dla 5.0  ml oraz 15  Probówki mL, polipropylenowe, pozycje numerowane, autoklawowalne30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Rurki laboratoryjne, ID & czasy; Średnica zewnętrzna 1/4 cala i razy; 3/8 calaT8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
Kleszcze preparacyjne VWR z trzpieniem prowadzącym z zakrzywionymi końcówkami89259-946Avantor, firmy VWR
Nożyczki preparacyjne VWR, ostra końcówka, 4½ "82027-578Avantor, firmy VWR
Wytrząsarka orbitalna do inkubacji VWR, model 3500I12620-946Avantor, firmy VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend
, poliwęglanowy SVPT951 ECT Produkcja 2,2,2-tribromoetanolu T48402 Sigma-Aldrich 200 µ Falcon, probówka Corning Komora indukcyjna anestezjologiczna Złącze przepływowy pipety zmienne PE przeciwciało Żyletki Harvard Thomas Scientific

Bibliografia

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie limfocyt w Bizolacja kom rek odporno ciowychtrawienie sercabarwienie przeciwcia amiwewn trznaczyniowe limfocyty Br dmi szowe limfocyty Bkom rki CD45 dodatnieprzeciwcia o B220

Powiązane artykuły