Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Summary

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Abstract

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) mogą być uwalniane ze wszystkich typów komórek i przenoszą białka, DNA i RNA. Cząsteczki sygnałowe służą jako wskaźniki fizjologicznego i patologicznego stanu komórki. Nie ma jednak standardowej metody izolacji sEV, która uniemożliwia dalszą identyfikację biomarkerów i badania interwencyjne leków. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji i oczyszczania sEV o długości fali 50-200 nm za pomocą sortera z komórkami przepływowymi. W tym celu wybrano dyszę 50 μm i ciśnienie płynu w osłonie 80 psi, aby uzyskać dobrą szybkość sortowania i stabilny strumień boczny. Do zlokalizowania populacji cząstek o długości 100, 200 i 300 nm użyto mikrosfer polistyrenowych o standardowych rozmiarach. Dzięki dodatkowej optymalizacji progu wyzwalania napięcia, wzmocnienia i rozproszenia do przodu (FSC), sygnał sEV może być oddzielony od szumu tła. Optymalizacje te zapewniają panel krytycznych ustawień sortowania, który umożliwia uzyskanie reprezentatywnej populacji sEV przy użyciu FSC w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC). Metoda izolacji oparta na cytometrii przepływowej nie tylko pozwala na analizę o wysokiej przepustowości, ale także pozwala na synchroniczną klasyfikację lub analizę proteomu sEV w oparciu o ekspresję biomarkerów, otwierając wiele dalszych zastosowań badawczych.

Introduction

Komórka uwalnia pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) o różnych rozmiarach, które skutkują cząsteczkami sygnałowymi i inkluzjami błonowymi, które są ważne dla komunikacji międzykomórkowej¹. EV o różnych rozmiarach odgrywają również różne role biologiczne, przy czym sEV o długości fali 50-200 nm jest w stanie precyzyjnie rozprowadzać RNA, DNA i białka do właściwej lokalizacji zewnątrzkomórkowej. sEV pomaga również określić mechanizmy ich wydzielania, obejmujące nie tylko regulację normalnych procesów fizjologicznych, takich jak nadzór immunologiczny, utrzymanie komórek macierzystych, krzepnięcie krwi i naprawa tkanek, ale także patologię leżącą u po....

Protocol

1. Hodowla komórkowa

1. Przygotuj pożywkę z pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Hodować ludzką komórkę raka trzustki, PANC-1, w kolbie hodowlanej o długości 75^cm2 o gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Subkulturuj komórki, gdy gęstość komórek osiągnie 75% -80% pod obserwacją mikroskopową. Usuń pożywkę i przepłucz 2x 3-5 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Wyrzuć roztwór, dodaj 1-2 ml roztworu trypsyny-EDTA i pozwól komórkom oderwać się, aż staną się zaokr....

Results

Schemat blokowy dla protokołu eksperymentalnego jest pokazany w Rysunek 1. W tej metodzie wykorzystano mikrosfery polistyrenowe o standardowych rozmiarach jako wzorce odniesienia dla rozkładu wielkości cząstek. W specyficznym warunku parametru instrumentalnego sygnał cząstkowy można było wyraźnie odróżnić od szumu tła na wykresie FSC w porównaniu z SSC za pomocą postaci logarytmicznej. Strategie bramkowania są pokazane w Rysunek 2. R4, R5 i R6 odnoszą się do poz.......

Discussion

Protokół ten przedstawia zoptymalizowaną metodę izolowania i oczyszczania sEV o określonej wielkości cząstek 50-200 nm przy użyciu sortera przepływowego, który został zatwierdzony przez NTA. Metoda rozwiązała problem wąskiego gardła polegający na otrzymywaniu sEV o jednolitej wielkości cząstek i wysokiej czystości, unikając interferencji powodowanej przez niepowiązane cząsteczki biologiczne owinięte w duże EV²². Szybkie, wysokoprzepustowe analizy są możliwe dzięki cytometrii przepływowej, która mo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka wirówkowa	Beckman Coulter	344058
Kolby hodowlane	Corning
Dulbecco" s zmodyfikowana pożywka orła	Corning Cellgro	10-013-CV
Płodowa surowica bydlęca	SUER	SUER050QY
Przepływowy sortownik komórek	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Komórka ludzkiego raka trzustki, PANC-1	NA	NA	PANC-1 Komórki zostały przekazane przez profesora Weijun Yanga, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laserowa wielkość cząstek i potencjał zeta Analizator	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	Gibco	C20012500BT
Polistyren Mikrosfery fluorescencyjne	Beckman Coulter	6602336
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	JEOL	JEM-1200EX
Roztwór trypsyny-EDTA	Gibco	1713949
Ultra tęczowe cząstki fluorescencyjne	Beckman Coulter	B28479
Ultrawirówka	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultrawirówka z wirnikiem	Beckman Coulter	SW32TI