Artykuł metodologiczny

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

DOI:

10.3791/64361

⸱

10 lutego 2023

 ,  , 
1Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutacje w genomie mitochondrialnym (mtDNA) zostały powiązane z chorobami genetycznymi dziedziczonymi przez matkę. Jednak zainteresowanie polimorfizmami mtDNA wzrosło w ostatnich latach ze względu na niedawno rozwiniętą zdolność do tworzenia modeli za pomocą mutagenezy mtDNA i nowe zrozumienie związku między mitochondrialnymi aberracjami genetycznymi a powszechnymi chorobami związanymi z wiekiem, takimi jak rak, cukrzyca i demencja. Pirosekwencjonowanie to technika sekwencjonowania przez syntezę, która jest szeroko stosowana w polu mitochondrialnym do rutynowych eksperymentów genotypowania. Jej względna przystępność cenowa w porównaniu z masowymi metodami sekwencjonowania równoległego i łatwość wdrożenia sprawiają, że jest to nieoceniona technika w dziedzinie genetyki mitochondrialnej, pozwalająca na szybką kwantyfikację heteroplazmii ze zwiększoną elastycznością. Pomimo praktyczności tej metody, jej wdrożenie jako metody genotypowania mtDNA wymaga przestrzegania pewnych wytycznych, w szczególności w celu uniknięcia pewnych uprzedzeń pochodzenia biologicznego lub technicznego. Protokół ten określa niezbędne kroki i środki ostrożności w projektowaniu i wdrażaniu testów pirosekwencjonowania do stosowania w kontekście pomiarów heteroplazmatycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom mitochondrialny istnieje w postaci małych (16,5 kb) kolistych cząsteczek (mtDNA) obecnych w najbardziej wewnętrznym przedziale mitochondriów zwanym matrycą i koduje 13 podjednostek mitochondrialnego łańcucha oddechowego, a także tRNA i rRNA niezbędne do ich translacji in situ przez mitochondrialny rybosom1. Genom ten stanowi około 1% wszystkich białek niezbędnych do funkcjonowania mitochondriów, z których pozostała część jest kodowana przez jądrowy DNA (nDNA). Powszechnie przyjmuje się, że mitochondria pochodzą z endosymbiotycznego zdarzenia fuzji między przodkiem alfa-proteobakterów a przodkiem komórki eukariotycznej. Gdy ta hipotetyczna symbioza miała miejsce, informacja genetyczna mitochondriów była stopniowo przenoszona do jądra przez eony, co wyjaśnia wspomnianą wcześniej zwartość mtDNA w porównaniu z genomami współczesnych cyjanobakterii2. O takim transferze genów najsilniej świadczy istnienie długich odcinków nDNA, które są wysoce homologiczne do sekwencji znajdujących się w mtDNA. Te jądrowe sekwencje mitochondrialne (NUMT) są częstym źródłem błędnej interpretacji podczas genotypowania i należy podjąć pewne środki ostrożności, aby uniknąć błędów jądrowych podczas genotypowania mtDNA3 (Rysunek 1A).

Inną charakterystyczną cechą mtDNA jest to, że liczba jego kopii różni się w zależności od typu komórki, licząc od dziesiątek do tysięcy kopii na komórkę4. Ze względu na tę wielokopijną naturę, mtDNA może zawierać szeroki zakres genotypów w pojedynczej komórce, co może skutkować bardziej ciągłą dystrybucją alleli w przeciwieństwie do dyskretnych alleli związanych z genami jądrowymi, biorąc pod uwagę zygotyczność chromosomów. Ta heterogeniczność alleli mitochondrialnych jest określana jako heteroplazmia mitochondrialna, która jest zwykle wyrażana w procentowym rozpowszechnieniu danej mutacji jako proporcji całkowitego mtDNA w danej komórce. Heteroplazmię można przeciwstawić homoplazmii, która odnosi się do unikalnego gatunku mtDNA obecnego w komórce.

Pomiar heteroplazmii mitochondrialnej jest szczególnie interesujący przy ilościowym określaniu proporcji cząsteczek mtDNA zawierających patogenne warianty. Takie warianty występują w postaci polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), małych indeli lub dużych delecji 5. Większość ludzi jest heteroplazmatyczna pod względem wariantów patogennych; jednak nie wykazują żadnych klinicznych fenotypów, które często objawiają się tylko przy wyższych poziomach heteroplazmii patogennego mtDNA w zjawisku określanym jako efekt progowy6. Podczas gdy wartości związane z chorobotwórczością są w dużym stopniu zależne od charakteru patogennej mutacji i tkanki, w której występuje, zwykle leżą powyżej 60% heteroplazmy7.

Istnieje kilka obszarów badawczych, w których genotypowanie mitochondriów jest powszechne. W medycynie testowanie lub ilościowe określanie mutacji mtDNA może służyć jako kryterium diagnostyczne dla chorób mitochondrialnych, z których wiele ma aberracje mtDNA jako swoje pochodzenie5. Oprócz badań nad ludzkimi mutacjami patogennymi, częstość występowania modeli zwierzęcych zawierających patogenne SNP w mtDNA prawdopodobnie wzrośnie, biorąc pod uwagę niedawne pojawienie się edycji zasad mitochondrialnych, która jest możliwa dzięki mitochondrialnie ukierunkowanym edytorom zasad cytozyny pochodzących z DddA (DdCBE)8 i deaminazom opartym na Tale (TALEDs) do edycji zasad adeninowych9. Podejście to będzie miało zasadnicze znaczenie dla zrozumienia wzajemnych zależności między nieprawidłowymi genotypami mitochondrialnymi a wynikającymi z nich dysfunkcjami. Prowadzone są również badania naukowe nad przebudową genomu mitochondrialnego w celu ostatecznego wykorzystania jako strategia terapeutyczna w ludzkich chorobach mitochondrialnych za pomocą podejścia znanego jako przesunięcie heteroplazmii. Ta dziedzina badań polega przede wszystkim na kierowaniu specyficznych dla mutacji nukleaz do macierzy mitochondrialnej; powoduje to preferencyjną degradację patogennego mtDNA, co prowadzi do ratunku w fenotypie10,11,12,13. Wszelkie eksperymenty obejmujące przebudowę genotypu mitochondrialnego wymagają solidnej metody ilościowej do oceny zmian heteroplazmii.

Do genotypowania mtDNA stosuje się wiele różnych metod, które różnią się w zależności od charakteru mutacji. Metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) są bardziej precyzyjne, jeśli chodzi o ilościowe określanie SNP w mtDNA; Jednak metody te pozostają zbyt drogie w rutynowym oznaczaniu ilościowym heteroplazmii mitochondrialnej, szczególnie jeśli liczba próbek jest niewielka. Sekwencjonowanie Sangera może również pozwolić na wykrycie SNP; Jednak to podejście nie jest ilościowe i często nie wykrywa niskich poziomów heteroplazmii lub może być niedokładne przy szacowaniu wysokiej heteroplazmii. Pirosekwencjonowanie, jako test, który wymaga minimalnego przygotowania i umożliwia szybkie określenie ilościowe heteroplazmii dla dowolnej próbki mtDNA, jest proponowane jako trafny kompromis między tymi dwoma skrajnościami. Metoda ta była rutynowo stosowana do ilościowego określania mitochondrialnych SNP przez wielu badaczy w różnych kontekstach, w tym w analizie kryminalistycznej14,15, diagnoza kliniczna16, lub genotypowanie mtDNA z pojedynczych komórek17.

Ten test obejmuje pierwszy etap wstępnej amplifikacji PCR regionu flankującego SNP w mtDNA, po którym następuje sekwencjonowanie przez syntezę przy użyciu jednej nici wcześniej wygenerowanego amplikonu. Jeden z dwóch starterów stosowanych na etapie preamplifikacji musi zostać poddany biotynylacji na końcu 5', co umożliwi aparatowi pirosekwencjonowania wyizolowanie pojedynczej nici DNA, która ma być użyta jako matryca do reakcji sekwencjonowania. Trzeci starter sekwencjonowania jest następnie wyżarzany na zatrzymaną biotynylowaną nić, co pozwala na powstającą syntezę DNA w postaci deoxynukleotydów dozowanych w określonej kolejności do komory reakcyjnej. Pirosekwencer rejestruje ilość każdej włączonej zasady na podstawie odczytu luminescencyjnego, co pozwala na względną kwantyfikację zmutowanych i dzikich alleli mitochondrialnych po syntezie DNA (Rysunek 1B). Luminescencja jest generowana przez enzym lucyferazy, który emituje światło w obecności ATP, które sulfurylaza ATP syntetyzuje de novo przy każdym zdarzeniu inkorporacji z pirofosforanów uwalnianych przez każdy nukleotyd. Te dwie reakcje można podsumować w następujący sposób:

1. PPi (od inkorporacji nukleotydów) + APS → ATP + siarczan (ATP sulfurylaza)

2. ATP + lucyferyna + O2 → AMP + PPi + oksylucyferyna + CO2 + światło (lucyferaza)

Wykrycie zasad adeninowych przez pirosekwencer bez reakcji krzyżowej ATP z lucyferazy w drugiej reakcji jest wyzwaniem. Można to jednak rozwiązać, stosując analog adeniny do syntezy DNA, a mianowicie dATPαS. Pomimo tego, że nie jest idealnym substratem dla lucyferazy, wytwarza silniejszą luminescencję w porównaniu z trzema innymi nukleotydami, która jest cyfrowo regulowana przez pirosekwencer i ustawiana na współczynnik 0,9. Ze względu na tę nieodłączną zmienność sugeruje się unikanie sekwencjonowania adeniny w pozycji SNP (więcej szczegółów w dyskusji).

Poniższy protokół szczegółowo opisuje metodę oceny heteroplazmii mtDNA za pomocą pirosekwencjonowania i przedstawia niezbędne środki ostrożności przy projektowaniu starterów amplifikacji, aby uniknąć biologicznych lub technicznych błędów podczas genotypowania SNP w mtDNA. Ta ostatnia obejmuje cyfrowe pomiary i wybór zestawów starterów, optymalizację PCR przed amplifikacją, a na koniec sekwencjonowanie i udoskonalanie testu. Zademonstrowano dwa przykładowe testy: po pierwsze, optymalizację najpowszechniejszego wariantu ludzkiego patogenu m.3243A>G18, a po drugie, genotypowanie komórek mysich fibroblastów embrionalnych (MEF), które przeszły heteroplazmatyczne przesunięcie przy użyciu technologii opracowanych w laboratorium Minczuk w Cambridge10,11,12,19,20,21,22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udzielono świadomej zgody na użycie ludzkich komórek cybrydowych 3243A>G oraz unieśmiertelnionych MEFów m.5024C>T użytych w tym badaniu. W tym przypadku nie była wymagana zgoda etyczna, ponieważ komórki pacjenta nie zostały pobrane na Uniwersytecie w Cambridge. Stosowanie ludzkich fibroblastów może jednak wymagać zgody etycznej. Zdecydowanie zaleca się przestrzeganie najlepszych praktyk dotyczących konfiguracji PCR podczas przygotowywania próbki DNA do pirosekwencjonowania. Częsta amplifikacja przy użyciu identycznych starterów może prowadzić do zanieczyszczenia amplikonem i wprowadzać błąd systematyczny w późniejszym genotypowaniu, jeśli nie obserwuje się ścisłego rozdziału między obszarami przed PCR i po PCR. Prezentowany tutaj rurociąg wykorzystuje specjalny sprzęt jednego producenta; szczegóły znajdują się w >Tabeli Materiałów. W razie potrzeby projekt startera do PCR można wykonać ręcznie; Zaleca się jednak korzystanie w tym celu z istniejącego oprogramowania (patrz Spis materiałów).

1. Projekt podkładu pirosekwencjonującego i wybór testu

  1. Pozyskiwanie kandydatów na startery za pomocą oprogramowania
    1. Uzyskaj plik sekwencji mtDNA dla gatunku, który ma być genotypowany, i określ pozycję SNP. Należy upewnić się, że zastosowana sekwencja referencyjna wykorzystuje odpowiednią numerację zasad dla badanej mutacji, tak aby można było łatwo zidentyfikować pozycję SNP.
    2. Skopiuj 1,000 par zasad przed i za miejscem SNP i wklej obciętą sekwencję do oprogramowania przeznaczonego do projektowania podkładu pirosekwencjonującego (patrz Tabela materiałów).
    3. Ustaw analizowaną bazę SNP jako cel testu pirosekwencjonowania w oprogramowaniu, podświetlając bazę polimorficzną i klikając prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierając ustaw region docelowy.
    4. Naciśnij ikonę odtwarzania w prawym górnym rogu interfejsu, aby uruchomić wybór podkładu.
    5. Poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie wygeneruje tria starterów: dwa startery do wstępnej amplifikacji matrycy DNA i trzeci starter do sekwencjonowania przez syntezę w maszynie do pirosekwencjonowania. Zachowaj wszystkie zestawy starterów, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję kopiuj wszystkie zestawy starterów.
  2. Wybór optymalnych zestawów podkładów z wygenerowanej listy
    1. Zachowaj zestawy starterów z najwyższym wynikiem jakości na podstawie danych wyjściowych oprogramowania, które udostępnia zestawy starterów w kolejności malejącej na podstawie wyniku jakości. Jeśli to możliwe, pomiń zestawy starterów z wynikiem poniżej 80.
    2. W przypadku zachowanych zestawów starterów zidentyfikuj i skopiuj amplikon wytworzony przez startery amplifikacyjne.
    3. Dopasuj wytworzone amplikony do całego genomu organizmu, który ma być genotypowany za pomocą NCBI Blast, korzystając z internetowego portalu składania wniosków pod adresem https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Z menu rozwijanych podczas przesyłania wybierz następujące opcje:
      1. Wybierz pozycję Baza danych | Bazy danych genomicznych + transkryptów.
      2. Wybierz Człowiek lub Mysz z menu rozwijanego, w zależności od analizowanego SNP.
      3. Wybierz pozycję Optymalizuj dla | Nieco podobne sekwencje (Blastn).
    4. (Opcjonalnie) W przypadku genotypowania organizmu innego niż mysz lub człowiek, podczas przesyłania należy wybrać następujące opcje:
      1. Wybierz pozycję Baza danych | Standardowa baza danych.
      2. Wybierz RefSeq Reprezentatywne genomy z menu rozwijanego
      3. Wybierz pozycję Optymalizuj dla | Nieco podobne sekwencje (Blastn)
    5. Jeśli to możliwe, pomiń wszelkie amplikony, które mają idealną homologię do amplikonu mtDNA, szczególnie jeśli regiony wiążące startery są idealnie homologiczne (patrz dyskusja).
      UWAGA: Narzędzie do wyrównywania BLAST zwróci dowolną sekwencję o znacznej homologii do amplikonów przed amplifikacją. Pozwala to na wykrycie NUMT opisanych we wprowadzeniu, które, jeśli nie zostaną uwzględnione, mogą wywołać odchylenie, ponieważ są one koamplifikowane z mitochondrialnym DNA.
    6. Zamów oligonukleotydy uzyskane za pośrednictwem tego rurociągu. Upewnij się, że modyfikacja biotyny 5' została dodana do właściwego startera amplifikacyjnego podczas kolejności syntezy, tak aby starter sekwencjonujący był komplementarny do biotynylowanej nici.
      UWAGA: Wybór startera sekwencjonującego jest bardziej elastyczny niż starterów wzmacniających i zaleca się, aby co najmniej jedna zasada oddzielała koniec 3' startera sekwencjonującego od pozycji zmiennej.

2. Optymalizacja PCR przed amplifikacją

  1. Przygotować próbki DNA, ekstrahując całkowite genomowe DNA przy użyciu odpowiedniej metody.
    UWAGA: Będzie to w dużej mierze zależało od liczby genotypowanych komórek i ich pochodzenia. W przypadku izolowania DNA z pojedynczych komórek przy użyciu buforu do lizy zawierającego proteinazę K, próbkę należy poddać denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 minut, aby nie zakłócić działania polimerazy podczas kolejnej reakcji PCR.
  2. Konfiguracja PCR i ustawienia bloku termicznego
    1. Skonfiguruj PCR z wybraną polimerazą o wysokiej wierności. Przygotuj Master Mix dla czterech reakcji. Ponieważ do pirosekwencjonowania wymagane jest tylko 10 μl reakcji PCR, należy przygotować 25 μl reakcji PCR (aby w razie potrzeby umożliwić techniczne powtórzenie). Użyć 40 cykli PCR z około 10 ng genomowego DNA jako materiału wyjściowego z 1 μM zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu.
    2. Ustaw czas przedłużenia zgodnie ze specyfikacją producenta dla zastosowanej polimerazy, biorąc pod uwagę długość wybranych starterów preamplifikacyjnych.
    3. Użyj termocyklera ze zmiennymi ustawieniami temperatury wyżarzania. Ponieważ temperatura wyżarzania może się różnić w zależności od sekwencji startera, zawartości soli w buforze polimerazy i innych czynników, zaprogramuj cztery różne temperatury wyżarzania w programie cykli termicznych.
      UWAGA: W przykładzie roboczym w reprezentatywnych wynikach zastosowano następujące temperatury: 55 °C, 60 °C, 65 °C i 70 °C.
    4. Podziel Master Mix na cztery probówki PCR o pojemności 200 μl i ustaw je tak, aby działały w każdej z czterech wybranych temperatur wyżarzania w termocyklerze przez 40 cykli.
  3. Wizualizacja pasma przedwzmacniacza
    1. Podczas cyklu PCR przygotuj 2% (w/v) żel agarozowy w 1x TBE z SYBR Safe lub bromkiem etydyny jako środkiem wizualizującym.
      UWAGA: Do wizualizacji zalecany jest żel o wyższym procencie, ponieważ amplifikowane fragmenty są zwykle krótkie, zwykle w zakresie od 100 do 500 par zasad.
    2. Po zakończeniu PCR w kroku 2.2 zmieszać 10 μl reakcji z odpowiednią ilością buforu ładującego DNA i pracować na 2% żelu agarozowym przy 7 V/cm przez około 45 minut.
    3. Wizualizacja powstałych fragmentów DNA na transiluminatorze UV.
      UWAGA: Warunki cykli termicznych wybrane dla przedwzmacniacza krok powinny wytworzyć pojedyncze czyste pasmo o oczekiwanym rozmiarze. Niższe temperatury wyżarzania mogą czasami powodować wzmocnienie poza celem, co może wprowadzać odchylenia do późniejszego pirosekwencjonowania.
    4. Wybierz najniższą temperaturę wyżarzania, która daje czyste pasmo o odpowiednim rozmiarze dla kolejnych wzmocnień.
    5. (Opcjonalnie) Wyciąć pasmo o oczekiwanym rozmiarze, oczyścić za pomocą wybranego zestawu do ekstrakcji żelu i przeanalizować za pomocą sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić przybliżoną heteroplazmię próbki jako odniesienie.

3. Konfiguracja i uruchomienie instrumentu

UWAGA: Po zoptymalizowaniu kroku PCR w poprzedniej sekcji, następnym krokiem jest zaprogramowanie pirosekwencera z odpowiednią sekwencją nukleotydów do analizy pod kątem konkretnego SNP. Polega to na wprowadzeniu 10 zasad bezpośrednio za końcem 3' startera sekwencjonowania. Zostało to szczegółowo opisane w poniższej sekcji.

  1. Konfiguracja testu
    1. Otwórz oprogramowanie uruchamiające dostarczone z pyrosequencerem i wybierz Nowy test w lewym górnym rogu interfejsu.
    2. Wybierz szablon testu kwantyfikacji alleli
      3. .
    3. Wprowadź sekwencję do analizy w odpowiednim polu, wpisując nukleotydy, które mają być włączone bezpośrednio za starterem sekwencjonowania, który powinien znajdować się przed SNP będącym przedmiotem zainteresowania. W przypadku zmiennej position należy oznaczyć dwie możliwe podstawy oddzielone ukośnikiem (np. A/T).
    4. Naciśnij przycisk Generuj kolejność dozowania i pozwól oprogramowaniu automatycznie określić odpowiednią kolejność nukleotydów, które mają być dozowane w reakcji sekwencjonowania przez syntezę.
    5. Zapisz i podaj nazwę testu.
  2. Przygotowanie i przechowywanie odczynników
    1. Rozcieńczyć starter sekwencjonowania uporządkowany do 4 μM w buforze wyżarzającym dostarczonym w zestawie odczynników pirosekwencera.
      UWAGA: Starter sekwencyjny można najpierw rozcieńczyć w wodzie do 100 μM jako roztwór podstawowy, a następnie w razie potrzeby rozcieńczyć w buforze do wyżarzania do 4 μM.
    2. Przygotowanie i postępowanie z enzymami i substratami
      1. Podczas pierwszego rozpakowywania należy ponownie rozpuścić liofilizowany enzym i substrat zgodnie z zaleceniami producenta. Przechowywać w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany.
      2. Po kolejnym użyciu rozmrozić fiolki z enzymem i substratem od -20 °C.
        UWAGA: Wszystkie inne odczynniki w dostarczonym zestawie można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C. Rozcieńczone startery do sekwencjonowania można również przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Umieść wymaganą ilość każdego odczynnika na lodzie.
    4. Pozostałe wymagane składniki, a mianowicie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną, paski absorbujące i krążki pirosekwencyjne, należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Uruchom execution
    UWAGA: Gdy test jest projektowany po raz pierwszy, musi być skalibrowany przy użyciu produktów PCR o znanej heteroplazmii, co zapewnia, że test może dokładnie rozróżnić heteroplazmie. Naukowcy mogą używać mieszanin produktów PCR o znanej heteroplazmii jako wzorców. Próbki można również weryfikować za pomocą innych metod wymienionych we wstępie i omówieniu, w szczególności NGS.
    1. Rozcieńczyć DNA, które ma być analizowane, do 5 ng/μl. Szczególnie w pierwszym cyklu należy pamiętać o dołączeniu próbek o znanej heteroplazmii jako próbek referencyjnych i/lub próbek typu dzikiego.
    2. Przeprowadzić sekwencjonowanie PCR z 5 μl rozcieńczonego DNA w reakcjach 25 μl, używając starterów amplifikacyjnych i parametrów określonych w sekcji 1 i 2. Wykonać techniczne powtórzenia PCR dla każdej próbki.
      UWAGA: PCR przed amplifikacją może być przechowywany krótkotrwale w temperaturze 4 °C lub długotrwale w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do sekwencjonowania.
    3. Uruchom konfigurację pliku
      1. Wybierz opcję New Run (Nowy przebieg) w lewym górnym rogu oprogramowania pyrosequencera.
      2. Pirosekwencer może jednocześnie sekwencjonować 48 oddzielnych wstępnie amplifikowanych reakcji, z pustym kwadratem reprezentującym pojedynczy dołek sekwencjonowania na dysku pirosekwencjonowania. Załaduj testy skonfigurowane w sekcji 3.1, klikając prawym przyciskiem myszy kwadrat i wybierając test obciążenia. W razie potrzeby zsekwencjonuj do czterech oddzielnych testów z różnymi starterami sekwencjonowania.
      3. Ustaw tryb dozowania startera na Automatyczny, aby automatycznie przypisać komorę wtryskową do każdego startera sekwencjonującego używanego w serii.
      4. Ustaw tryb uruchamiania na Standardowy, chyba że uruchamiasz cztery różne typy testów na jednym dysku sekwencjonowania.
      5. Upewnij się, że liczba testów w pliku szablonu przebiegu jest zgodna z liczbą amplifikowanych reakcji PCR.
        UWAGA: Jeśli uruchamianych jest więcej niż 48 próbek, konieczne będzie skonfigurowanie dodatkowych plików uruchamiania.
      6. Zapisz pliki uruchamiania na dysku USB.
    4. Gruntowanie pirosekwencera
      1. Naciśnij przycisk Czyszczenie na głównym ekranie dotykowym urządzenia i wyczyść wszystkie wtryskiwacze wodą o wysokiej czystości, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Podczas wkładania paska absorbera do maszyny upewnij się, że końce spotykają się w pozycji "godzina 9" (bezpośrednio na lewo od środka).
      2. Podłącz pamięć USB z przebiegami skonfigurowanymi w kroku 3.3.3 i załaduj pliki uruchamiania zdefiniowane w kroku 3.3.3.
        UWAGA: Pliki uruchamiania muszą być zapisane poza jakimkolwiek katalogiem lub folderem na USB, w przeciwnym razie nie mogą być odczytane przez urządzenie.
      3. Postępuj zgodnie z instrukcjami na urządzeniu, aby załadować i zalać odczynniki zgodnie z wymaganiami do odpowiednich wtryskiwaczy w maszynie.
    5. Przygotowanie dysku z próbką i uruchomienie testu
      1. Pozwól, aby kulki magnetyczne pokryte streptawidyną osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej.
        UWAGA: Te kulki umożliwią urządzeniu wychwycenie biotynylowanej nici z etapu PCR przed amplifikacją. Należy je zakupić oddzielnie od zestawu.
      2. Załaduj 3 μl kulek do studzienek zdefiniowanych w pliku uruchomienia z kroku 3.3.3.
      3. Załadować 10 μl każdej reakcji PCR, która ma zostać zsekwencjonowana w odpowiedniej próbce, i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać próbkę z kulkami magnetycznymi. Jeśli to możliwe, unikaj bąbelków.
      4. Poszukaj wskazania w zalanym pirosekwencerze, że dysk można załadować do maszyny. Odkręć nakrętkę mocującą płytkę przed wyrównaniem załadowanej płytki próbki z metalowym kołkiem w komorze dysku.
      5. Po mocnym wkręceniu płytki w komorę na płytę, uruchom sekwencjonowanie, naciskając przycisk start na interfejsie ekranu dotykowego.

4. Pozyskiwanie wyników

  1. Po zakończeniu działania odłącz dysk USB od komputera i podłącz go z powrotem do komputera, na którym działa oprogramowanie pirosekwencera. Wykonując następujące kroki, przystąp do czyszczenia pirosekwencera zgodnie z instrukcjami, jeśli jest to ostatni bieg dnia.
  2. Poczekaj, aż nowo wygenerowany plik uruchamiania pojawi się na dysku USB, a następnie kliknij dwukrotnie plik wynikowy uruchomienia. To automatycznie analizuje wyjście lucyferazy z każdej studzienki po włączeniu nukleotydu i określa ilościowo interesujący allel mitochondrialny zdefiniowany podczas konfiguracji testu w sekcji 3.1.
  3. Poszukaj następujących wyników kolorów wyświetlanych przez oprogramowanie w oparciu o jakość odczytów. Kolor niebieski oznacza optymalny przebieg, żółty przebieg z ostrzeżeniem, a czerwony przebieg zakończony niepowodzeniem. Aby zapisać wyniki, wybierz Raporty w górnym oknie | Pełny raport do wygenerowania pliku .pdf zawierającego pirogramy i wyniki z każdego odwiertu w przebiegu. Możesz też pobrać wyniki w innych formatach na karcie Raporty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja przedstawia przykładową optymalizację testu pirosekwencjonowania dla ludzkiej patogennej mutacji mtDNA, a także dane sekwencjonowania z genotypowania heteroplazmatycznych (m.5024C>T) mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) traktowanych mitochondrialnymi nukleazami palca cynkowego (mtZFNs). Optymalizacja testu dla komórek ludzkich i porównanie dwóch różnych testów pokazuje, jak wybrać najdokładniejszy z nich, podczas gdy genotypowanie genetycznie zmodyfikowanych komórek MEF w drugim przykładzie służy jako sto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym aspektem dla powodzenia protokołu jest unikanie zanieczyszczeń, szczególnie w przypadku stosowania niewielkich ilości materiału wyjściowego. Zaleca się, aby podczas przygotowywania próbek, o ile to możliwe, używać osłony UV i końcówek pipet z filtrem, a także oddzielać obszary przed i po amplifikacji. Ślepe pomiary i próbki znanej heteroplazmii (takie jak DNA typu dzikiego) powinny być zawsze uwzględniane w celu wykorzystania ich jako punktów odniesienia w celu sprawdzenia błędu technicznego lub biologicznego. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.M. jest współzałożycielem, udziałowcem i członkiem Naukowej Rady Doradczej Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. i P.A.N. świadczą usługi konsultingowe dla Pretzel Therapeutics, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Silvii Marchet i Constanzie Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Mediolan) za przygotowanie i dostarczenie komórek cybridowych m.3243A>G, które zostały użyte jako przykłady ilustracyjne dla tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować członkom Grupy Genetyki Mitochondrialnej (MRC-MBU, University of Cambridge) za przydatną dyskusję w trakcie tych badań. Prace te były wspierane przez podstawowe fundusze z Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 i MC_UU_00028/3). P.A.N. oraz P.S.-P. są dodatkowo wspierane odpowiednio przez The Lily Foundation i The Champ Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KOD Hot Start Polimeraza DNASigma-Aldrich71086
Projekt testu PyroMark  2.0QIAGEN
Pyromark Q48 QIAGEN974912
PyroMark Q48 Zaawansowane odczynniki CpG (4 x 48)QIAGEN974022
Pyromark Q48 Autoprep QIAGEN9002470
PyroMark Q48 Zestaw kartridżyQIAGEN9024321
Dyski Pyromark Q48QIAGEN974901
Pyromark Q48 Koraliki magnetyczne na oprogramowanie QIAGEN974203
PyroMark Q48 (1)QIAGEN9024325
Paski absorbujące Licencja

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
  3. Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
  4. Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
  5. Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
  6. Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
  7. Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
  8. Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
  9. Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
  10. Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
  11. Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
  12. Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
  13. Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
  14. Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
  15. Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
  16. Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
  17. Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
  18. El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
  19. Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
  20. Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
  21. Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
  22. Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
  23. Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
  24. Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
  25. Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
  26. Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrial DNASingle Nucleotide PolymorphismsPyrosequencing AssayHeteroplasmy MeasurementPrimer DesignSequencing By SynthesisAllele QuantificationPCR AmplificationAgarose Gel ElectrophoresisCybrid Clones

Powiązane artykuły