Artykuł metodologiczny

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64363

⸱

13 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Podczas mejozy, chromosomy homologiczne muszą się rozpoznawać i przylegać do siebie, aby umożliwić ich prawidłową segregację. Jednym z kluczowych zdarzeń, które zabezpiecza interakcję chromosomów homologicznych, jest złożenie kompleksu synaptonemalnego (SC) w mejotycznej profazie I. Mimo że homologia sekwencji między składnikami białka w obrębie SC jest niewielka wśród różnych gatunków, ogólna struktura SC została wysoce zachowana podczas ewolucji. Na mikrofotografiach elektronowych SC pojawia się jako trójdzielna, przypominająca drabinę struktura złożona z bocznych elementów lub osi, poprzecznych włókien i elementu centralnego.

Jednak precyzyjne określenie lokalizacji poszczególnych składników w kompleksie za pomocą mikroskopii elektronowej w celu określenia struktury molekularnej SC pozostaje wyzwaniem. Natomiast mikroskopia fluorescencyjna pozwala na identyfikację poszczególnych składników białkowych w obrębie kompleksu. Ponieważ jednak SC ma tylko ~100 nm szerokości, jego podstruktura nie może być rozdzielona za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej z ograniczoną dyfrakcją. W związku z tym określenie architektury molekularnej SC wymaga technik mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopia wymuszonej emisji (STED) lub mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM).

Aby utrzymać strukturę i interakcje poszczególnych komponentów w SC, ważne jest obserwowanie kompleksu w środowisku, które jest zbliżone do jego rodzimego środowiska w komórkach rozrodczych. W związku z tym demonstrujemy protokół immunohistochemiczny i obrazowania, który umożliwia badanie podstruktury SC w nienaruszonej, wytłaczanej tkance linii rozrodczej Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii SMLM i STED. Bezpośrednie przymocowanie tkanki do szkiełka nakrywkowego zmniejsza ruch próbek podczas obrazowania i minimalizuje aberracje w próbce, aby osiągnąć wysoką rozdzielczość niezbędną do wizualizacji podbudowy SC w jej kontekście biologicznym.

Wprowadzenie

Zmniejszenie liczby chromosomów o połowę podczas mejozy jest kluczem do generowania zdrowego potomstwa w organizmach rozmnażających się płciowo. Aby osiągnąć to zmniejszenie liczby chromosomów, chromosomy homologiczne muszą łączyć się w pary i segregować podczas mejozy I. Aby zapewnić dokładną segregację chromosomów homologicznych, komórki rozrodcze przechodzą rozszerzoną profazę I, podczas której chromosomy homologiczne łączą się w pary, synapsują i rekombinują, aby wygenerować fizyczne połączenia między homologami1. SC stał się centralną strukturą, która jest kluczowa w regulowaniu prawidłowej progresji przez mejotyczną prophase2.

SC to kompleks, którego ogólna struktura jest ewolucyjnie zachowana, mimo że istnieje niewielka homologia między jego składnikami białkowymi. SC został po raz pierwszy zidentyfikowany na mikrofotografiach elektronowych jako trójdzielna, przypominająca drabinę struktura składająca się z dwóch bocznych elementów lub osi, centralnego obszaru utworzonego przez poprzeczne włókna i elementu centralnego3,4. Określenie organizacji poszczególnych komponentów w kompleksie jest kluczem do pogłębienia naszego zrozumienia roli SC podczas mejotycznej profazy.

Organizm modelowy C. elegans idealnie nadaje się do badania struktury i funkcji SC, ponieważ jego linie zarodkowe zawierają dużą liczbę jąder mejotycznych z w pełni złożonymi SCs5. Badania genetyczne i biochemiczne wykazały, że osie chromosomów są utworzone przez trzy odrębne kompleksy kohezyny6,7 i cztery białka domeny HORMA o nazwach HTP-1/2/3 i HIM-37,8,9,10,11 w C. elegans. W centralnym regionie SC do tej pory zidentyfikowano sześć białek zawierających domeny zwinięte cewki12,13,14,15,16,17. Aby zniwelować odległość między dwiema osiami, SYP-1, -5 i -6 dimeryzują się w sposób head-to-head (Rysunek 1), podczas gdy trzy dodatkowe białka stabilizują swoje oddziaływanie w centralnym elemencie16,17,18,19.

Uzyskanie szczegółowego wglądu w organizację tych białek jest niezbędne do zrozumienia wielu funkcji SC podczas mejozy. Ponieważ szerokość centralnego obszaru SC wynosi tylko ~100 nm, jego podstruktura nie może być rozdzielona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ograniczonej dyfrakcją. Jednak wizualizacja komponentów w strukturze tej wielkości jest łatwo osiągalna za pomocą mikroskopii superrozdzielczej. Rzeczywiście, mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopia ekspandacyjna20, mikroskopia defiscencji emisji wymuszonej (STED) class21 oraz mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)22,23 okazały się niezbędnymi narzędziami do badania architektury molekularnej SC w różnych gatunkach16,24,25,26,27,28,29,30.

Aby pokonać limit rozdzielczości, mikroskopia STED polega na nałożeniu ograniczonej dyfrakcją plamki światła emisyjnego za pomocą wiązki w kształcie pączka z lasera STED, która teoretycznie zwęża funkcję rozproszenia punktów do wymiarów molekularnych31,32. Jednak rozdzielczość, która jest praktycznie osiągalna przez STED w próbkach biologicznych, pozostaje w zakresie kilkudziesięciu nanometrów w xy33.

Jeszcze wyższa rozdzielczość w próbkach biologicznych może być uzyskana za pomocą technik SMLM. SMLM wykorzystuje właściwości określonych fluoroforów do rozpoznawania obiektów na poziomie subdyfrakcyjnym poprzez rozdzielanie przestrzennie nakładających się fluoroforów w czasie. Próbka jest następnie wielokrotnie obrazowana w celu uchwycenia różnych podzbiorów fluoroforów. Położenie fluoroforów w próbce jest następnie określane przez dopasowanie funkcji rozproszenia punktowego (PSF) do uzyskanych sygnałów na wszystkich obrazach, które mogą rozdzielić struktury do 15 nm23,34.

Razem wzięte, zlokalizowane obrazy kodują pozycje wszystkich fluoroforów. Rozdzielczość SMLM zależy od gęstości znakowania i charakterystyki fluoroforu. Zgodnie z kryterium Nyquista-Shannona niemożliwe jest wiarygodne rozpoznawanie obiektów, których odległość jest mniejsza niż dwukrotność średniej odległości między etykietami. W związku z tym do obrazowania w wysokiej rozdzielczości potrzebna jest wysoka gęstość etykietowania. W przypadku SC u C. elegans wysoką gęstość znakowania można osiągnąć za pomocą znaczników epitopowych przyłączonych do określonych miejsc białek endogennych za pomocą edycji genomu. Znaczniki epitopów można następnie wybarwić z dużą gęstością przy użyciu specyficznych przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie19,30. Jednocześnie cykl poszczególnych fluoroforów musi być na tyle krótki, aby zapewnić, że przestrzennie nakładające się fluorofory nie zostaną uchwycone w tym samym czasie35.

Ze względu na te dwa wymagania, rozdzielenie struktury dużych kompleksów makromolekularnych, takich jak SC, wymaga zobrazowania wystarczająco dużej liczby obrazów, a zatem może zająć kilka godzin. Pułapką długiego czasu obrazowania jest to, że próbki mają tendencję do dryfowania z powodu ruchu stolika lub małych prądów w buforze próbki; Nawet niewielkie ruchy rzędu 10 nm są szkodliwe przy rozdzielczości nm i muszą być korygowane. Jednak powszechnie stosowane metody korekcji dryfu nie są wystarczająco solidne, aby dokładnie nałożyć obrazy dwóch kanałów obrazowanych sekwencyjnie36. Jest to problematyczne, ponieważ pytania biologiczne często wymagają precyzyjnego wykrywania i lokalizacji wielu celów w tej samej próbce. Aby obejść te problemy, opracowano metody takie jak obrazowanie ratiometryczne. Obrazowanie ratiometryczne pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu fluoroforów z nakładającymi się widmami wzbudzenia i emisji, z późniejszym przypisaniem każdego wykrytego sygnału do odpowiedniego fluoroforu w oparciu o stosunek intensywności w spektralnie różnych kanałach37,38.

Dodatkowo, badanie organizacji kompleksów makromolekularnych, takich jak SC, wymaga trójwymiarowych (3D) informacji. Aby osiągnąć superrozdzielczość w trzech wymiarach (3D-SMLM), w ścieżkę optyczną emitowanego światła wbudowana jest cylindryczna soczewka, która zniekształca kształt PSF fluoroforu w zależności od jego odległości od płaszczyzny ogniskowej. W związku z tym dokładne położenie fluoroforu w płaszczyźnie z można ekstrapolować, analizując kształt jego sygnału emisyjnego35,39. Połączenie tych osiągnięć w SMLM pozwala na obrazowanie 3D organizacji kompleksów makromolekularnych, w tym SC.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i odczynników, oraz Tabelę 1, aby zapoznać się ze składem roztworów używanych w tym protokole.

  1. Szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną
    1. Przygotować 0,01% (m/v) poli-L-lizyny (patrz Tabela 1).
    2. Umyć precyzyjne szkiełko nakrywkowe (o średnicy 24 mm; 0,17 ± 0,005 mm, nr 1,5) w etanolu przez 10-30 minut. Przepłukać szkiełko nakrywkowe za pomocą ddH2O w celu usunięcia etanolu i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
    3. Wyczyść plazmowo szkiełko nakrywkowe za pomocą środka do czyszczenia plazmowego.
      UWAGA: Czyszczenie plazmowe zwiększa hydrofilowość szkiełka nakrywkowego i ułatwia wykonywanie kolejnych kroków. Jeśli środek do czyszczenia plazmowego nie jest dostępny, ten krok można pominąć, chociaż może to wymagać dostosowania objętości i/lub stężenia roztworu poli-L-lizyny. Ta modyfikacja nie została przetestowana.
    4. Umieść jedną kroplę (120 μl) 0,01% (w/v) poli-L-lizyny na szkiełku nakrywkowym. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Po inkubacji wypłukać szkiełko nakrywkowe w ddH2O i wysuszyć w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  2. Fragmenty F(ab')2 sprzężone z fluorescencyjnymi barwnikami organicznymi
    1. Dodać w następującej kolejności do probówki PCR: 10 μl 0,6-0,7 mg/ml fragmentu F(ab')2 w PBS, 1 μl 0,1 MNaHCO3 (pH 8,3) i 1 μL 1 mM reaktywnego fluoroforu sukcynimidylowego (NHS) w DMSO (stosunek molowy F(ab')2:barwnik wynosi ~1:17). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Oddzielić fragment F(ab')2 od pozostałego wolnego barwnika reaktywnego za pomocą kolumny odsalającej (7K MWCO) zgodnie ze specyfikacjami producenta. Użyj 1x PBS do zrównoważenia kolumny i elucji znakowanego fragmentu F(ab')2.
    4. Oznakowany fragment F(ab')2 należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
      UWAGA: Okresy przechowywania dłuższe niż 3 miesiące nie zostały przetestowane.

2. Sekcja i fiksacja

UWAGA: Procedury preparacji i fiksacji są modyfikowane w stosunku do poprzednio zalecanych procedur16,40 w celu uzyskania optymalnych próbek do mikroskopii superrozdzielczej.

  1. Rozwarstwienie
    1. Zbierz robaki C. elegans o dopasowanym wieku (hodowane w temperaturze 20 °C na potrzeby tego badania) do 30 μl kropli EBTT (1x Egg buffer41 z 0,2% detergentem niejonowym, Tabela 1) na szkiełku nakrywkowym (22 mm x 22 mm, nr 1). Umieść szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku, aby ułatwić manipulację. Przemyć 30 μl EBTT, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Usunąć 30 μl roztworu, aby pozostawić 30 μl kropli na szkiełku nakrywkowym.
      UWAGA: Do wszystkich roztworów, w których pipetowane są robaki, należy dodać niewielkie ilości niejonowego detergentu, aby zapobiec przywieraniu robaków do plastikowych końcówek.
    2. Użyj ostrza skalpela, aby odciąć głowy i/lub ogony robaków w celu wyciśnięcia gonady (Rysunek 2A).
  2. Utrwalenie
    1. Odpipetować 30 μl roztworu utrwalającego (Tabela 1) do kropli rozciętych robaków i pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
      UWAGA: Kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół może pomóc w uwolnieniu większej ilości gonad.
    2. Utrwalaj dokładnie przez 1 minutę po dodaniu roztworu utrwalającego.
    3. Przerwać utrwalanie, przenosząc robaki do probówki PCR wypełnionej TBST (Tabela 1). Przenieś robaki w jak najmniejszej objętości (~15 μL).
    4. Zakręć probówkę do PCR na mini wirówce stołowej (2 000 × g, 10 s). Usunąć supernatant i przemyć 2x po 200 μl TBST.
    5. Przemywać 200 μl PBST (tabela 1) przez 5-10 minut. Powtórzyć kroki 2.1.1-2.2.5 dla maksymalnie czterech próbek, trzymając wypreparowane próbki na lodzie.
      UWAGA: W przypadku przetwarzania więcej niż czterech próbek, należy postępować zgodnie z krokami od 2.2.6 do 2.2.7 po każdych czterech próbkach, aby zapewnić spójne utrwalanie próbki we wszystkich próbkach.
    6. Odwirować wypreparowane próbki na mini wirówce stołowej (2 000 × g, 10 s), usunąć PBST i dodać 50-100 μl zimnego metanolu (-20 °C).
      UWAGA: Metanol jest toksyczny. Nosić sprzęt ochronny i unikać wdychania.
    7. Mieszać pipetując w górę i w dół i pozostawić próbki w metanolu na 30-60 s. Przemyć próbki 2x w 200 μl PBST.
      UWAGA: W przypadku przetwarzania więcej niż czterech próbek, należy przystąpić do sekcji pozostałych próbek (kroki 2.1.1 do 2.2.7).
    8. Przemyć próbki po raz trzeci 200 μl PBST.

3. Inkubacje przeciwciał

  1. Blokowanie
    1. Umieścić próbki w 1 roztworze blokującym (Tabela 1) na 45-60 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Czas inkubacji może wynosić od 30 minut w temperaturze pokojowej do kilku dni w temperaturze 4 °C (testy przeprowadzono do 3 dni).
  2. Pierwszorzędowy roztwór przeciwciał
    1. Rozcieńczyć przeciwciała anty-HTP-3 (chicken42) i anty-HA (mysie) (lub przeciwciała z wyboru) do roztworów roboczych (1:250 dla SMLM i 1:1,000 dla próbek mikroskopowych STED) w 1x roztworze blokującym.
      UWAGA: Przeciwciała używane do znakowania próbek SMLM są bardziej skoncentrowane niż w przypadku próbek STED, ponieważ do mikroskopii SMLM zalecana jest wyższa gęstość znakowania.
    2. Odwirować próbki na mini wirówce stołowej (2 000 × g, 10 s), usunąć bufor blokujący i dodać 30-50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (preferowane) lub przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
    3. Po inkubacji przemyć 3 x 5-15 min PBST.
  3. Roztwór roboczy fragmentów F(ab')2 sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym
    1. Rozcieńczyć znakowane fragmenty F(ab')2 (krok 1.2.4) do roztworów roboczych (1:100 dla SMLM i 1:1,000 dla próbek mikroskopowych STED) w 1x roztworze blokującym.
      UWAGA: W przypadku obu technik super-rozdzielczości użyto wcześniej zgłoszonych par fluoroforów, a mianowicie AlexaFluor647/CF680 dla SMLM i AlexaFluor594/Abberior STAR635P dla STED. AlexaFluor647 i STAR645P użyto do znakowania fragmentów anty-mysich (Fab')2 w celu celowania w C-koniec SYP-5, a fragmenty anty-kurczaka (Fab')2 znakowane CF680/AlexaFluor594 do celowania w HTP-3.
    2. Odwirować próbki na mini wirówce stołowej (2 000 × g, 10 s), usunąć PBST i dodać 30-50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez 30 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej (preferowane) lub przez noc w temperaturze 4 °C. Myć 3 x 5-15 minut PBST.

4. Montaż próbek na szkiełku nakrywkowym

  1. Postfiksacja
    UWAGA: Próbki należy przetwarzać indywidualnie, wykonując czynności 4.1.1–4.2.1.
    1. Odwirować poplamione próbki i usunąć supernatant. Dodać 50 μl PBST0,2 i przenieść poplamione robaki na szkiełko nakrywkowe nr 1 o wymiarach 22 mm x 22 mm.
      UWAGA: Na tym etapie użyj świeżego PBST0.2 z 0.2% niejonowym detergentem (Tabela 1), aby zapobiec przywieraniu robaków do szkiełka nakrywkowego.
    2. Odmierzyć pipetą 5,7-6,3 μl roztworu postufiksacyjnego na szkiełko nakrywkowe z poli-L-lizyny.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe z poli-L-lizyny przechowywane w temperaturze 4 °C należy najpierw doprowadzić do temperatury pokojowej.
    3. Odpipetować wypreparowane robaki w tej samej objętości (5,7-6,3 μl) i przenieść do kropli utrwalacza na szkiełku nakrywkowym z poli-L-lizyny (Rysunek 2B).
      UWAGA: W tym i następnym kroku bardzo ważne jest, aby wypreparowana tkanka znajdowała się w środku szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną. Jest to szczególnie ważne w przypadku montażu próbek w niestandardowym uchwycie, aby pasował do specjalnie zbudowanego mikroskopu SMLM użytego tutaj (patrz krok 5.1, Rysunek 2B).
    4. Przykryj próbkę małym szkiełkiem nakrywkowym (średnica 12 mm, Rysunek 2B). Usuń nadmiar płynu za pomocą małego kawałka bibuły filtracyjnej (Rysunek 2B). Fix na 3-5 minut w ciemnej komorze.
  2. "Pękanie mrozowe"
    1. Zamroź próbki, umieszczając je na aluminiowym bloku w suchym lodzie (Rysunek 2B).
      UWAGA: Blok aluminiowy musi być dobrze schłodzony w suchym lodzie przed umieszczeniem na nim próbek. Przystąpić do postfiksacji pozostałych próbek (etapy 4.1.1-4.2.1). Próbka musi znajdować się w suchym lodzie przez co najmniej 20 minut lub do 1 godziny przed następnym etapem (4.2.2).
    2. Usuń mniejsze szkiełko nakrywkowe za pomocą maszynki do golenia (Rysunek 2B).
      UWAGA: W przypadku STED przejdź do kroku 5.2.1. W przypadku SMLM przejdź do kroku 4.2.3.
    3. Zanurz szkiełko nakrywkowe w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej lodowaty PBS (preferowany) lub metanol o temperaturze -20 °C przez około 10 s.
      UWAGA: Temperatura jest bardzo ważnym czynnikiem na tym etapie. Dlatego należy używać PBS, który jest świeżo rozmrożony lub przechowywany w kąpieli lodowo-etanolowej.
    4. Umieścić szkiełko nakrywkowe w studzience na sześciodołkowej płytce wypełnionej buforem PBST. Wyjmij PBST z dołków i dodaj świeży PBS. Pozostawić próbki w PBS na 5 minut
      UWAGA: Odpipetować PBS na bok studzienki, aby uniknąć uszkodzenia i oderwania próbek.
    5. Przemyć świeżymi PBS i pozostawić próbki w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.
      UWAGA: Próbki są stabilne do 2 tygodni, ale najlepsze wyniki osiąga się, jeśli próbki są obrazowane w ciągu 2 dni.
    6. Przed obrazowaniem należy ocenić jakość mocowania próbki pod mikroskopem stereoskopowym.
      UWAGA: Pomyślnie zamontowane linie zarodkowe są stabilnie przymocowane bez zauważalnego ruchu względem szkiełka nakrywkowego. Słabo przyczepione linie zarodkowe będą wpadać do roztworu buforowego.

5. Obrazowanie

  1. Mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek
    UWAGA: Obrazy zostały uzyskane w Centrum Obrazowania EMBL przy użyciu specjalnie zbudowanego mikroskopu lokalizacyjnego pojedynczej cząsteczki, który został zbudowany wokół niestandardowego ciała, jak wcześniej informowano38,43, z unikalnymi cechami określonymi w Tabeli Materiałów; Zapoznaj się z https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
    1. Kalibracja ściegu 3D
      1. Przygotuj precyzyjne szkiełko nakrywkowe (średnica 24 mm; 0,17 ± 0,005 mm, nr 1,5) z przylegającymi koralikami fluorescencyjnymi 100 nm, jak opisano wcześniej38,44.
      2. Umieścić próbkę kalibracyjną z kroku 5.1.1.1 na uchwycie próbki.
      3. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na czysty obiektyw olejowy 100x/1,5 i zamontuj próbkę kalibracyjną na mikroskopie.
      4. W MicroManager 245,46, określ 15-20 pozycji w próbce kalibracyjnej.
      5. W oknie wtyczki EMU 47 skonfiguruj pobieranie obrazu stosu z dla każdej z pozycji z kroku 5.1.1.5.
        UWAGA: W tym przypadku złożona soczewka cylindryczna zapewnia astygmatyzm wymagany do obrazowania 3D, a dla każdej pozycji uzyskano 201 plasterków z w zakresie od -1 μm do 1 μm, z przyrostem 10 nm. Zastosowano oświetlenie laserowe o mocy 2 kW/cm2 640 nm przez 25 ms dla każdego elementu Z.
      6. Uzyskaj obrazy stosu z koralików fluorescencyjnych 100 nm przez identyczną ścieżkę optyczną, która zostanie użyta do uzyskania przykładowych obrazów w kroku 5.1.11.
      7. Korzystając z platformy analizy mikroskopii superrozdzielczej (SMAP48), wygeneruj model cspline eksperymentalnej funkcji rozproszenia punktów (PSF), który zostanie użyty do dopasowania danych 3D-SMLM w kroku 5.1.13.
    2. Przygotować uchwyt na próbkę. W przypadku użytego tutaj niestandardowego uchwytu, który wykorzystuje pierścień magnetyczny do tworzenia komory obrazowania (Rysunek 2B), owiń pierścień magnetyczny parafilmem.
      UWAGA: Alternatywnie do mocowania próbek do mikroskopów z uchwytami szkiełek można użyć szkiełka mikroskopowego z wklęsłą wgłębieniem.
    3. Przygotować 1 ml buforu do obrazowania44 (Tabela 1).
    4. Weź jedno szkiełko nakrywkowe z kroku 4.2.6 i umieść je w specjalnie przygotowanym uchwycie. Zamocuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie za pomocą pierścienia magnetycznego owiniętego folią parafilmową (krok 5.1.2).
    5. Delikatnie odpipetować bufor obrazowania (krok 5.1.3) w komorze utworzonej przez pierścień magnetyczny na górze próbki (Rysunek 2B). Uszczelnij komorę kawałkiem parafilmu.
    6. Aby zamontować próbkę, dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego na czysty obiektyw olejowy 100x/1,5. Nie wprowadzając powietrza do olejku immersyjnego, delikatnie umieść uchwyt na próbkę z zamontowaną próbką (krok 5.1.5) na stoliku mikroskopu.
      UWAGA: Przed umieszczeniem próbki w mikroskopie należy oczyścić spód szkiełka nakrywkowego chusteczką i 70% etanolem.
    7. Korzystając z wtyczki EMU window47 w MicroManager 245,46, przesuń stolik piezoelektryczny, aż sygnał z lasera blokady ostrości zostanie wykryty w kwadrancie fotodiody (QPD).
      UWAGA: Aby utrzymać stałą ostrość przez cały czas obrazowania, blokada ostrości jest osiągana poprzez całkowite wewnętrzne odbicie lasera sprzężonego ze światłowodem w bliskiej podczerwieni od szkiełka nakrywkowego, a następnie czułe na wysokość wykrywanie na fotodiodzie kwadrantowej (QPD). Sygnał QPD zapewniał sterowanie mocowaniem piezoelektrycznym soczewki obiektywu w pętli zamkniętej.
    8. Uzyskaj obraz tylnej płaszczyzny ogniskowej za pomocą lasera wzbudzającego 640 nm o niskiej mocy (tj. 1-5%), aby potwierdzić brak pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym.
      UWAGA: Usuń próbkę ze stolika, jeśli zostanie wykryty pęcherzyk powietrza. Oczyść spód szkiełka nakrywkowego i obiektyw, a następnie powtórz kroki 5.1.6-5.1.8. W przeciwnym razie przejdź do zablokowania fokusu w oprogramowaniu EMU47.
    9. Zlokalizuj tkankę gonady za pomocą oświetlenia jasnego pola. Korzystając z oświetlenia o niskiej intensywności 640 nm, skup się na sekcji tkanki, która zawiera wiele odcinków SC.
      UWAGA: Nie należy skupiać się na strukturach znajdujących się w odległości większej niż 2 μm od szkiełka nakrywkowego. Nie używaj większej mocy lasera do zlokalizowania próbki, ponieważ może to spowodować przedwczesne przekształcenie niektórych fluoroforów w stan. W tym przypadku 1 kW/cm2 został użyty w trybie narastania z impulsem ustawionym na 1 000.
    10. Kontynuuj naświetlanie próbki przy oświetleniu 640 nm przy wysokim natężeniu promieniowania (27 kW/cm2) przez ~30 s, aż do uzyskania odpowiedniej częstotliwości mrugania (Dodatkowe wideo 1).
    11. Uchwyć 200 000 klatek z czasem naświetlania 20 ms za pomocą narzędzia do akwizycji wielowymiarowej w MicroManager 245,46.
    12. W międzyczasie skonfiguruj aktywację UV za pomocą opcji aktywacji wtyczki EMU38,47, aby utrzymać żądaną częstotliwość.
      UWAGA: Używaj lasera UV przy natężeniu promieniowania 3 kW/cm2 w trybie narastania z maksymalną długością impulsu ustawioną na 10 000.
    13. Wykonaj rekonstrukcję obrazu SMLM i postprocessing.
      UWAGA: Aby zrekonstruować obrazy z nieprzetworzonych danych SMLM, zapoznaj się z opublikowanymi metodami. Przedstawione tutaj dane zostały przetworzone za pomocą oprogramowania SMAP48,49. Superrozdzielcza rekonstrukcja obrazu, przypisywanie kanałów, korekcja dryfu i filtrowanie lokalizacji o słabej precyzji lokalizacji i filtrze maksymalnego prawdopodobieństwa zostały przeprowadzone w oprogramowaniu SMAP48.
  2. Mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji
    UWAGA: Obrazy uzyskano za pomocą zintegrowanego systemu mikroskopowego STED wyposażonego w laser światła białego, impulsowy laser STED o długości fali 775 nm oraz moduł starzenia FALCON Fluorescence Lifetime IM(Tabela Materiałów) w Centrum Obrazowania EMBL (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).
    1. Umieść kroplę 20 μl podłoża montażowego (tabela materiałów) na szkiełku mikroskopowym. Weź jedno szkiełko nakrywkowe z kroku 4.2.2 i delikatnie umieść próbkę na szkiełku skierowanym w stronę podłoża montażowego (Rysunek 2B).
      UWAGA: Unikaj wprowadzania kieszeni powietrznych do medium montażowego.
    2. Pozwól podłożu montażowemu utwardzić się przez noc.
      UWAGA: Próbki należy zobrazować następnego dnia lub przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.
    3. Aby zamontować próbkę, dodać jedną kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe próbki z kroku 5.2.2. Delikatnie umieść próbkę na stoliku mikroskopu za pomocą obiektywu olejowego 100x/1,40.
    4. Skoncentruj się na próbce i zlokalizuj tkankę linii zarodkowej za pomocą oświetlenia jasnego pola.
    5. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, określ obszar zainteresowania, dla którego zostanie uzyskany obraz TauSTED.
    6. Wybierz lasery wzbudzające i ich odpowiednią moc używaną do wzbudzenia fluoroforów użytych w próbce.
      UWAGA: W tym przypadku laser o długości fali 580 nm o mocy 4% został użyty do obrazowania fragmentów przeciwciała F(ab')2 sprzężonych z AlexaFluor 594, a lasera o długości fali 635 nm przy mocy 3% do obrazowania fragmentów F(ab')2 sprzężonych ze wzorem STAR 635P.
    7. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wybierz odpowiednią moc lasera STED i skonfiguruj detekcję obrazu.
      UWAGA: W tym przypadku moc lasera zubożającego STED 775 nm została ustawiona na 40%. Detektor był używany w trybie zliczania z wartością wzmocnienia 10 do detekcji fotonów, z częstotliwością skanowania 100 Hz i rozmiarem piksela 17 nm. Do akwizycji TauSTED wykorzystano akumulację czteroliniową.

Wyniki

Aby obrazować kompleks synaptonemalny (SC) w tkance linii zarodkowej C. elegans za pomocą SMLM, zastosowaliśmy dwukolorową ratiometryczną technikę 3D-SMLM w celu lokalizacji HTP-3, będącego komponentem osi chromosomowych, oraz końca C filamentu poprzecznego SYP-5 endogennie znakowanego tagiem hemaglutyniny (HA). Lokalizacja obu białek w obrębie SC C. elegans została wcześniej określona w innych badaniach16,30.

Aby zminimalizować rozpraszanie światła i aberracje optyczne nieodłącznie związane z grubymi próbkami biologicznymi, obrazowano najniższą sekcję z jąder meiotycznych zawierających kompleksy synaptonemalne SC (Rysunek 3, żółte linie). Dla każdego pozyskanego obrazu zaznaczono pozycję stołu piezoelektrycznego w płaszczyźnie obrazowania względem pozycji stołu piezoelektrycznego w momencie, gdy obiektyw był ustawiony w ostrości na szkiełko nakrywkowe. Pozwoliło to na obliczenie odległości piezoelektrycznej od szkiełka nakrywkowego. Prawidłowo zamontowane próbki są stabilnie przytwierdzone blisko szkiełka nakrywkowego i zachowują kształt gonady (tj. tkanka nie zostaje zmiażdżona między dwoma szkiełkami nakrywkowymi podczas etapu postfiksacji). Jakość montażu próbki można łatwo ocenić pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ dobrze przytwierdzone gonady nie wykazują żadnego ruchu w roztworze (krok 4.2.6). Niemniej jednak, ze względu na stochastyczny charakter procesu montażu, tkanka gonady niekoniecznie będzie rozłożona całkowicie płasko na szkiełku nakrywkowym. W związku z tym dolna płaszczyzna jąder zawierających SC może znajdować się w różnych odległościach od szkiełka nakrywkowego w obrębie tej samej gonady.

Aby zilustrować, jak rozdzielczość zmienia się w zależności od przylegania tkanki do szkiełka podstawowego, wykonano obrazy w różnych odległościach piezoelektrycznych od szkiełka. W celu oceny jakości pojedynczego obrazu obliczono krzywe korelacji pierścieniowej Fouriera (FRC)50,51, a rozdzielczość określono za pomocą wtyczki FRCResolution w oprogramowaniu SMAP48. Na Rysunku 4 przedstawiono dwa reprezentatywne jądra wyodrębnione z dwóch oddzielnych obrazów 3D-SMLM, wykonanych w różnych odległościach od szkiełka podstawowego. W komórkach SC znajdujących się blisko szkiełka podstawowego, osie chromosomów oraz koniec C-końcowy SYP-5::HA są dobrze rozdzielone we wszystkich trzech wymiarach (Rysunek 4A, 0,8 µm od szkiełka podstawowego). Aby rozdzielić dwie struktury oddzielone określoną odległością, uzyskana rozdzielczość FRC musi być zazwyczaj mniejsza niż połowa tej odległości w rozdzielczości osiowej.

Aby rozdzielić te same struktury w płaszczyźnie bocznej, konieczne jest osiągnięcie jeszcze niższych wartości rozdzielczości FRC. Rzeczywiście, w próbkach znajdujących się w bliskim sąsiedztwie szkiełka podstawowego rozdzielczość FRC wynosi 38 nm dla kanału AlexaFluor 647 oraz 34 nm dla kanału CF680, co znajduje się znacznie poniżej oczekiwanej odległości 84 nm między końcami C- SYP-516. Taka rozdzielczość pozwala zatem z łatwością rozdzielić organizację SC nie tylko w widoku czołowym, ale również bocznym (Rysunek 4B i,ii). Z kolei rozdzielczość pogarsza się w SC znajdujących się w odległości 5 µm od szkiełka podstawowego z powodu rozpraszania światła i aberracji sferycznych (Rysunek 4B). Rozdzielczości FRC w tej odległości spadają do 47 nm (AlexaFluor 647) i 41 nm (CF680), co uniemożliwia pełne rozdzielenie końców C- SYP-5. Ponieważ aberracje optyczne pogarszają rozdzielczość boczną silniej niż osiową, prążki HTP-3 i SYP-5 nie są już wyraźnie rozdzielone w przekroju widoku bocznego w próbkach znajdujących się w odległości 5 µm od szkiełka podstawowego (Rysunek 4B ii). Porównanie rozdzielczości FRC obrazów pozyskanych w różnych odległościach piezo od szkiełka podstawowego wykazało, że obrazowana tkanka nie powinna znajdować się dalej niż 2 µm od szkiełka (Rysunek 5). Wynik ten podkreśla znaczenie prawidłowego wykonania etapu postfiksacji, podczas którego tkanka musi zostać skutecznie sieciowana z powłoką z poli-L-lizyny na szkiełku podstawowym.

Aby zademonstrować rozdzielczość osiągalną za pomocą innej techniki nadrozdzielczej, obrazowano również SC w utrwalonej, nienaruszonej tkance linii zarodkowej przy użyciu mikroskopii TauSTED. Rysunek 6A przedstawia obrazy TauSTED o najwyższej i najniższej rozdzielczości osiągniętej w niniejszym badaniu, oszacowanej na podstawie profilów liniowych SC w widoku czołowym (Rysunek 6B). W obu jądrach udało się rozdzielić dwa pasma lokalizacji HTP-3 w osiach chromosomów oraz końce C-terminalne SYP-5 w regionie centralnym, co dowodzi, że rozdzielczość osiągalna w technice TauSTED przy zastosowaniu tego zoptymalizowanego protokołu wynosi poniżej 84 nm. W warunkach optymalnych (Rysunek 6A, góra) udało się rozdzielić końce C-terminalne w lekko nachylonych widokach SC, które były oddzielone od siebie zaledwie o 50 nm (Rysunek 6A, żółty prostokąt oraz 6C).

Schemat struktury chromosomów homologicznych; widoki z przodu, z boku i w przekroju poprzecznym z filamentami poprzecznymi.
Rysunek 1: Schemat organizacji kompleksu synaptonemalnego u Caenorhabditis elegans. Rysunek przedstawia uproszczoną strukturę SC u C. elegans łączącą dwa chromosomy homologiczne (szare). Struktura jest pokazana w widoku z przodu, z boku i w przekroju poprzecznym. Osie chromosomów przedstawiono jako czerwone paski, natomiast filamenty poprzeczne zaznaczono kolorem cyjanowym. Białka filamentów poprzecznych (SYP-1, 5, 6 u C. elegans) są zorientowane głową do głowy (cyjanowe grafiki kulkowo-pręcikowe) w regionie centralnym, aby pokonać odległość między dwiema osiami. Wskazano przewidywane odległości między osiami a końcami C filamentów poprzecznych. Skrót: SC = kompleks synaptonemalny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do sekcji i obrazowania C. elegans; mikroskopia, przeciwciała, STED, SMLM i przygotowanie preparatu.
Rysunek 2: Ilustracja przygotowania próbki zastosowanego w badaniu. (A) Młode dorosłe osobniki C. elegans są sekcjonowane w obrębie głowy lub ogona (zielone, przerywane linie) i przetwarzane zgodnie z opisem w protokole. (B>) Poszczególne etapy metody są zaznaczone grafikami połączonymi szarymi strzałkami. Skróty: STED = mikroskopia z wygaszaniem emisji stymulowanej; SMLM = mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyrównanie chromosomów; obraz mikroskopii fluorescencyjnej; lokalizacja białek w procesie podziału komórki.
Rysunek 3: Lokalizacja przekroju tkanki, który można obserwować za pomocą mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. MIP obrazu konfokalnego z dyskiem wirującym całej gonady C. elegans. Tkankę barwiono w kierunku HTP-3 oraz końca C-końcowego SYP-5 (SYP-5::HA), a połączony sygnał przedstawiono w kolorze szarym. Pojedyncze obrazy konfokalne zostały zszyte przy użyciu wtyczki Grid/Collection stitching w programie Fiji52 w celu utworzenia obrazu całej gonady. Wstawka przedstawia widok xy najniższej płaszczyzny z zawierającej SCs. Lokalizacja tej płaszczyzny jest pokazana w widokach ortogonalnych przekroju tkanki zaznaczonego prostokątem na obrazie MIP gonady (żółte linie). Paski skali = 10 µm. Skróty: MIP = maksymalna projekcja intensywności; SCs = kompleksy synaptonemalnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces obrazowania mikroskopowego; schematy markerów białkowych; widoki frontalne i boczne; analiza naukowa.
Rycina 4: Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek HTP-3 oraz końców C-terminalnych SYP-5. (A,B) Lewo: Obrazy SMLM przedstawiające jądra w stadium pachytenu barwione na HTP-3 (czerwony) i koniec C-terminalny SYP-5 (SYP-5::HA, cyjan) (pasek skali = 1 µm). Środek: Powiększone obrazy obszarów zainteresowania wskazanych w punktach A i B z odpowiadającymi im przekrojami poprzecznymi wyświetlanymi pod każdym obrazem (i, ii; pasek skali = 100 nm). Odcinki SC na powiększonych obrazach zostały obrócone tak, aby osie chromosomów były równoległe do osi y. Prawo: Graficzne przedstawienie lokalizacji badanych białek w obrębie SC, obrazujące orientację SC w powiększonych regionach pokazanych w środkowej części ryciny. Skróty: SMLM = mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek; SC = kompleks synaptonemalny. Surowe dane do rekonstrukcji obrazów SMLM są dostępne w bazie danych BioStudies60 (Accession ID: S-BIAD504). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres FRC w funkcji częstotliwości przestrzennej, AlexaFluor647 i CF680, dane dotyczące odległości piezoelektrycznej, dopasowanie widmowe.
Rycina 5: Rozdzielczość określona metodą korelacji pierścieni Fouriera (FRC) dla obrazów z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek zależy od odległości obrazowanej płaszczyzny z od płaszczyzny szkiełka podstawowego. Kolorowe linie przedstawiają krzywe FRC dla obrazów pozyskanych w różnych odległościach od szkiełka podstawowego (zgodnie z paskiem kolorów). Próg 1/7 użyty do wyznaczenia rozdzielczości FRC jest zaznaczony czarną poziomą linią. Wstawki pokazują zależność rozdzielczości FRC od odległości piezoelektrycznej od szkiełka podstawowego. Wykresy zostały wykonane za pomocą autorskiego skryptu w języku R (wersja 4.1.2, Plik uzupełniający 1), w którym oryginalne krzywe zostały wygładzone za pomocą funkcji z pakietu „ggplot2”. Skróty: FRC = korelacja pierścieni Fouriera; SMLM = mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek; SC = kompleks synaptonemalny. Dane dla krzywych FRC oraz dane SMLM są dostępne w bazie BioStudies60 (numer dostępu: S-BIAD504). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, analiza HTP-3 SYP-5:HA, wykresy rozkładu intensywności.
Rycina 6: Mikroskopia z ugaszaniem emisji stymulowanej wspomagana informacjami o czasie życia fluorescencji (TauSTED) rozróżnia dwa pasma lokalizacji dla HTP-3 oraz dla końców C-terminalnych SYP-5. (A) Dwa reprezentatywne obrazy TauSTED przedstawiają jądra w stadium pachytenu barwione na HTP-3 (czerwony) i końców C-terminalnych SYP-5 (SYP-5::HA, cyjan) z wyższą (góra) i niższą (dół) definicją strukturalną (pasek skali = 1 µm). Prostokąty wyznaczają obszary z rozdzielonymi końcami C-terminalnymi SYP-5 w widoku czołowym (biały) i lekko pochylonym (żółty) kompleksu synaptonemalnego (SC). (B,C) Rozkład sygnału HTP-3 (czerwony) i końców C-terminalnych SYP-5 (cyjan) rozdzielony metodą TauSTED. Profile liniowe obszarów zainteresowania zawierających SC w widokach czołowych (B) lub lekko pochylonych (C) przedstawiono jako linie ciągłe z intensywnością znormalizowaną do wartości maksymalnej. Profile liniowe zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania Fiji ImageJ. Linie przerywane w B przedstawiają uśrednione dane dla każdego białka. Gruba cyjanowa linia w C odpowiada profilowi liniowemu z najkrótszą rozdzieloną odległością między końcami C-terminalnymi SYP-5. Aby określić odległości między przeciwciałami celującymi w konkretne białka, profile liniowe (n = 9 (B), n = 7 (C)) dopasowano do funkcji podwójnego rozkładu Gaussa za pomocą skryptu R napisanego na potrzeby badania (wersja 4.1.2, Plik uzupełniający 1). Na górze każdego wykresu wskazano odpowiednio średnią odległość ± odchylenie standardowe (B) oraz zakres z wyróżnioną pogrubioną czcionką wartością minimalną (C). Skróty: STED = mikroskopia z ugaszaniem emisji stymulowanej; SC = kompleks synaptonemalny. Prezentowane obrazy i punkty danych z wykreślonych profili liniowych są dostępne w bazie danych BioStudies60 (Accession ID: S-BIAD504). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Skład buforów i roztworów użytych w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wideo uzupełniające 1: Akwizycja obrazów w mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Film przedstawiający mruganie fluoroforów z odpowiednią częstotliwością (pokazano 50 klatek, pasek skali = 5 µm, 20 ms/klatka). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Skrypt do analizy danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Drabinkowata organizacja SC, która jest niezbędna do prawidłowej rekombinacji i segregacji chromosomów homologicznych, została po raz pierwszy zaobserwowana prawie 70 lat temu w mikroskopii elektronowej 3,4. Podczas gdy ogólna organizacja SC jest łatwo rozwiązana w mikroskopii elektronowej, lokalizacja poszczególnych składników w tym kompleksie wymaga bardziej ukierunkowanego podejścia. Przy szerokości zaledwie ~100 nm, podstruktura SC nie może być rozdzielona za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak mikroskopia superrozdzielcza stała się główną siłą napędową nowych odkryć dotyczących struktury i funkcji kompleksu synaptonemalnego 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Aby ułatwić te badania, zademonstrowaliśmy procedurę mocowania, która umożliwia badanie architektury SC w tkance gonady C. elegans za pomocą mikroskopii SMLM i STED.

Kluczowym krokiem w celu optymalizacji rozdzielczości w obrazowaniu SMLM jest bezpośrednie usieciowanie tkanki linii zarodkowej z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną (krok 4). Kowalencyjne przyleganie tkanki do szkiełka nakrywkowego jest niezbędne do zmniejszenia ruchów w próbce, które skutkowałyby dużymi dryftami i uniemożliwiłyby obrazowanie przez długi czas w kierunku SMLM. Dodatkowo, nawet nieoptymalne przyłączenie, które pozostawia jądra zawierające SC w pewnej odległości od szkiełka nakrywkowego, prowadzi do znacznego spadku osiągalnej rozdzielczości wynikającego z aberracji sferycznych (ryc. 4). Alternatywnie do zastosowanego tutaj mocowania kowalencyjnego, wybarwiona tkanka linii rozrodczej może być również unieruchomiona między dwoma uszczelnionymi szkiełkami nakrywkowymi w małej kropli buforu obrazowego19,30. Jednak ta metoda immobilizacji znacznie zmniejsza objętość buforu obrazowania w próbce z 1 ml zastosowanego w zoptymalizowanym protokole do zaledwie kilku μl, co spowoduje zakwaszenie buforu obrazowania i znacznie skróci czas, w którym próbka może być obrazowana 38,53,54.

Długie czasy akwizycji zarówno w przypadku mikroskopii SMLM, jak i STED ograniczają stosowanie tych metod do obrazowania próbek utrwalonych chemicznie. W tym przypadku utrwalanie paraformaldehydu zapewnia, że struktura SC jest zachowana podczas przygotowywania próbki i obrazowania. Jednak pomimo podjętych tutaj środków ostrożności w celu zobrazowania SC w nienaruszonej tkance, wynikowa struktura SC po utrwaleniu niekoniecznie jest identyczna ze strukturą w stanie naturalnym w żywym organizmie. Co więcej, ponieważ pojedynczy obraz stałego SC stanowi pojedynczą "migawkę" struktury biologicznej, podejście to pozostaje ślepe na dynamikę struktury natywnej in vivo.

Jednak informacje na temat dynamiki i zmienności struktur makromolekularnych można również uzyskać, uzyskując nie tylko jedną, ale wiele "migawek". Chociaż takie podejście może rozwiązać zmiany w strukturze SC podczas pachytenu19, istnieje kilka czynników, które ograniczają liczbę obrazów, które można uzyskać z pojedynczej próbki przygotowanej przy użyciu tego protokołu. Po pierwsze, wysokie moce lasera używane podczas akwizycji obrazu prowadzą do trwałego wybielenia fluoroforów i uniemożliwiają obrazowanie sąsiednich obszarów zainteresowania lub wielu płaszczyzn z, co znacznie zmniejsza liczbę obrazów, które można uzyskać z pojedynczej próbki. Po drugie, gęstość próbki/tkanki na szkiełku nakrywkowym przygotowanym tą metodą jest niska, co znacznie ogranicza liczbę obrazów, które można uzyskać z pojedynczego szkiełka nakrywkowego. Niska gęstość próbki uniemożliwia również korzystanie z automatycznych potoków pozyskiwania obrazów, które pomogły rzucić światło na inne pytania biologiczne 34,55,56,57,58,59. Jednak gęstość próbki może zostać nieznacznie zwiększona przez doświadczonego użytkownika.

Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem uzyskania wysokiej gęstości etykietowania, która jest niezbędna do osiągnięcia optymalnej rozdzielczości w SMLM35. Podczas gdy poprzednie protokoły kowalencyjnie przyczepiały tkankę do szkiełka nakrywkowego przed barwieniem immunologicznym16, ten nowy protokół łączy tkankę ze szkiełkiem nakrywkowym dopiero po zabarwieniu próbek w roztworze. Modyfikacja ta umożliwia przeciwciałom używanym do znakowania immunologicznego swobodny dostęp do tkanki ze wszystkich stron, podczas gdy kowalencyjne przyłączenie tkanki do szkiełka nakrywkowego może ograniczać dotarcie przeciwciał do jąder znajdujących się najbliżej szkiełka nakrywkowego, zmniejszając w ten sposób stopień znakowania. Opisane tutaj modyfikacje łącznie poprawiają rozdzielczość z 40-50 nm (rozdzielczość FRC)16 do 30-40 nm (ten protokół).

Co ważne, podczas gdy wysoka gęstość znakowania i wysokie stężenie przeciwciał są niezbędne dla SMLM, stwierdziliśmy, że lepsze obrazy mikroskopowe STED uzyskuje się przy użyciu niższych stężeń przeciwciał (krok 3). Przy rozdzielczości dziesiątek nanometrów coraz ważniejsze staje się wielkość cząsteczek używanych do oznaczania białka będącego przedmiotem zainteresowania. W związku z tym zastosowaliśmy fragmenty F(ab')2, które są o połowę mniejsze niż przeciwciała o pełnej długości. Poprawa lokalnego kontrastu spowodowana mniejszym źródłem sygnału, a tym samym rozdzielczość uzyskana przez tę modyfikację w porównaniu z użyciem przeciwciał drugorzędowych o pełnej długości, pozwoliła na rozdzielczość dwóch C-końców SYP-5 w regionie centralnym przez TauSTED, które nie są rozpoznawane przez konwencjonalny STED przy użyciu przeciwciał o pełnej długości (16 i dane nie pokazane). Przewidujemy, że ten zoptymalizowany protokół obrazowania SC w nienaruszonych liniach zarodkowych C. eleganułatwi badanie relacji struktura-funkcja SC podczas mejozy.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Jonasowi Riesowi i laboratorium Riesa za udostępnienie obrazowania SMLM. Dziękujemy również Yumi Kim za szczep C. elegans użyty w tym protokole oraz Abby F. Dernburg za przeciwciało anty-HTP-3 kurczaka. Dziękujemy Marko Lampe i Stefanowi Terjungowi z Zakładu Zaawansowanej Mikroskopii Świetlnej w EMBL Heidelberg za wsparcie w korzystaniu z mikroskopu konfokalnego Olympus iXplore SPIN SR. Prace te były wspierane przez Europejskie Laboratorium Biologii Molekularnej oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza - 452616889, SK). Doceniamy dostęp i usługi świadczone przez Centrum Obrazowania w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL IC), hojnie wspierane przez Fundację Boehringer Ingelheim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x/1,5 obiektyw olejowyOlympusUPLAPO100XOHRUPLAPO100XOHR
2-merkaptoetyloamina (MEA)Sigma-Aldrich30070-10GRozpuszczony w wodzie MilliQ do 5 M roztworu, pH   8,7 skorygowany HCl. Porcjowany do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 & stopni C.
Dodatkowy laser wspomagający 640 nmTopticaIBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, ester NHSThermoFischer ScientificA37572Rozpuszczony w DMSO do roztworu 1 mM, podany do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 & stopni; C
AlexaFluor 647, ester NHSThermoFischer ScientificA37573Rozpuszczony w DMSO do 1 mM roztworu, podany do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 °; C
anty-HAThermo Fisher Scientific2-2.2.14Mysz monoklonalna, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anty-HTP-3prezent od Abby F. DernburgMacQueen et al., 2005Kurczak poliklonalny, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans szczep  YKM349prezent od Yumi KimHurlock et al., 2020syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS esterBiotium92139Rozpuszczony w DMSO do roztworu 1mM, podzielony na objętość do jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 ° C
Szklana osłona okrągła 12 mm nr 1Menzel-Glä ser; VWR631-0713
Okrągłe szkło osłonowe 24 mm nr 1.5Carl RothPK26.1
Soczewki cylindryczneThorlabsLJ1516RM-A, LK1002RM-A
Bufor do jaj (10x)Edgar 1995250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Etanol (bezwzględny do analizy)Merck64-17-5
F(ab')2 fragment anty-kurczaka IgYJackson ImmunoresearchAB_2340347Osioł poliklonalny, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (mikroskopia STED)
F(ab')2-fragmentowy anty-mysi IgGJackson ImmunoresearchAB_2340761Osioł poliklonalny, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand T/F Grunt o grubości 0,8-1,0 mmFisher scientific7107
Gauge Worm Pick 30 średnica 0,254 mm - Iridium 10%Kisker789265
Mieszanka oksydazy glukozowo-enzymatycznej katalazy (GlOX/Cat )prezent od Jonasa RiesaHoess, Mund, Reitberger i Ries, 201820x, 1916 U/ml oksydazy glukozowej (Sigma G7141), 42350 U/ml katalazy (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8,0, 51% glicerol, woda MilliQ. Przechowywany w temperaturze -20 & st. C.
Baza bufora obrazowaniaprezent od Jonasa RiesaHoessa, Munda, Reitbergera i Ries, 201850 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 10% D-glukozy.
Podawane na objętość jednorazowego użytku (950 μ L), zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Invitrogen ProLong GlassAntiblade Mountant ThermoFischer ScientificP36982
Leica Stellaris 8 STED FALCONLeicaN/AMikroskop wyposażony jest w najnowszej generacji laser światła białego, impulsowy laser STED 775 nm, moduł FALCON Fluorescence Lifetime IMaging, Obiektyw olejowy HC PL APO CS2 100x/1.40 i detektor Leica HyD X. System jest zdolny do modułu FLIM wzmocnionego Tau-STED, który mierzy określony czas trwania fluorescencji barwnika, a zatem jest w stanie usunąć sygnał tła w oparciu o różnice w czasie życia fluorescencji barwników i warunkach barwnika w próbce. Dodatkowo rozdzielczość jest zwiększana poprzez uwzględnienie zmienności czasów życia fluorescencji w różnych obszarach pączka zubożenia.
Filtr emisyjny kanału długofalowegoAHF AnalysentechnikF47-702700/100 nm pasmo przepustowe
Metanol (bezwzględny do analizy)Merck67-56-1
NaHCO3Sigma-Aldrich/MerckS5761-500G100 mM NaHCO3, pH 8,3
Laser światłowodowy w bliskiej podczerwieniTopticaIBEAM-SMART-PT-CDNiestandardowy projekt, 808 nm - 75mW
Soczewka obiektywu z mocowaniem piezoelektrycznym (PIFOC)Physik InstrumenteP-726.1.CD100 µ m zasięg podróży
Orca Fusion BT sCMOS ProbówkiHamamatsuC15440-20UP
PCRGreiner Bio-One6732830,2 ml
buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS 10x)Nie dotyczy137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Pierce 16% formaldehyd (w/v), bez metanoluThermoFischer Scientific2890616% formaldehyd przenosi się z oryginalnej szklanej ampułki do probówki o pojemności 1,5 ml i utrzymuje w temperaturze pokojowej.
Środek do czyszczenia plazmy PlasmaPrep2GaLa Instrumente GmbHN/A
Bromowodorek poli-L-lizynySigma-Aldrich/MerckP2636-25MG0,1% w/v roztwór został przygotowany w wodzie Milli-Q i przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 stopni C.
Pierwotny dichroiczny (odbijający światło)AHF AnalysentechnikF73-866Spoczwórny pasmowoprzepustowy @ 405, 488, 561, 640
Filtr czterowskazowyAHF AnalysentechnikF40-072405/488/561/640 nm
Fotodioda kwadrantowa (QPD)Komponenty laseroweSD197-23-21-041, LC301DQD-PV
ŻyletkiApollo Herkenrath SolingerN/A
Kształtownik wiązki refrakcyjnejAdlOpticaPiShaper 6_6_VIS
Roche Odczynnik blokującyRoche1109617600110x roztwór został przygotowany zgodnie z zaleceniami. Zamrożone porcje przechowywano w temperaturze -20 °C.
Ostrze skalpela (marka Feather #11, nr 3)Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110911
Pudełko do usuwania skalpelaFisher scientific10002-50
Wtórny dichroiczny (odbijający emisję)AHF AnalysentechnikF38-785S750 nm długoprzepustowy
Filtr krótkoprzepustowySemrockBSP01-785R-25  750 nm
Filtr emisyjny kanału krótkofalowegoAHF AnalysentechnikF37-677  Pasmo przepustowe 676/37 nm
Mikroskop lokalizacji pojedynczej cząsteczkiCentrum Obrazowania EMBLDiekmann i wsp., 2020 z modyfikacjamiMikroskop zapewnia szerokokątne oświetlenie epi za pomocą jednomodowego silnika laserowego sprzężonego ze światłowodem, dodatkowego lasera wspomagającego i kształtownika wiązki refrakcyjnej, aby zapewnić równomierne pole oświetlenia (Stehr i in., 2019). Obrazy szerokokątne są rejestrowane kamerą sCMOS  oraz odpowiedni przekaźnikowy układ optyczny dla powiększenia systemu 61x i rozmiaru piksela 106 nm.
W przypadku ratiometrycznego spektralnie nakładających się na siebie barwników dalekiej czerwieni, rozdzielacz obrazu wytwarza dwa widmowo odrębne obrazy w kamerze (dichroiczny podział: długi przepustowy 665 nm, filtr emisji kanału krótkofalowego: pasmowoprzepustowy 676/37 nm, długofalowy filtr emisyjny: pasmowoprzepustowy 700/100 nm. Dodatkowy filtr czworokątny 405/488/561/640 nm i filtr krótkoprzepustowy 750 nm są wspólne dla obu ścieżek i zapewniają dodatkowe blokowanie laserowe).
Złożona soczewka cylindryczna zapewnia astygmatyzm wymagany do obrazowania 3D.
Aby utrzymać stałą ostrość podczas akwizycji trwających dłużej niż 2 godziny (obejmujących 200 000 - 250 000 obrazów), Blokada ostrości uzyskuje się poprzez całkowite wewnętrzne odbicie lasera sprzężonego ze światłowodem w bliskiej podczerwieni  z szkiełka nakrywkowego, a następnie czuła na wysokość detekcja na fotodiodzie kwadrantowej (QPD). Sygnał QPD zapewniał sterowanie mocowaniem piezoelektrycznym soczewki obiektywu w pętli zamkniętej.
Aby uzyskać dostęp do tego mikroskopu, zapoznaj się z https://www.embl.org/about/info/imaging-centre lub skontaktuj się z ic-contact@embl.de
Jednomodowy silnik wielolaserowy sprzężony ze światłowodamiTopticaiCHROME MLE-LFA-HPZapewnia szerokokątne oświetlenie epi 100 mW przy 405, 488, 561, 640 nm
Rozdzielanie dichroiczneAHF AnalysentechnikF48-665SG665 nm długie przejście
Kwadratowa szklanka osłonowa 22 x 22 mm nr 1Menzel-Glä ser; VWR630-2882
STAR 635P, NHS esterAbberiorST635P-0002-1MGRozpuszczony w DMSO do 1 mM roztworu, podany w porcji do objętości jednorazowego użytku, zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 & stopni; C
Mikroskop stereoskopowy Stemi 305 Stand K LABZeissN/A
Chlorowodorek tetraizoluSigma-Aldrich/MerckT1512-2G% (w/v) roztwór został przygotowany w wodzie Milli-Q. Zamrożone porcje przechowywano w temperaturze -20 °C.
Rozmrożone porcje przechowywano w temperaturze 4 ° ° C; C i używany przez kilka miesięcy.
TetraSpeck MicrospheresThermoFischer ScientificT7279  0,1 &mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwony
Tris Saline Buffer (TBS 10x)N/A200 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5
TWEEN 20Sigma-Aldrich/MerckP9416-50MLPrzechowywać w temperaturze pokojowej w oryginalnym opakowaniu.
Pickik do robakówWormStuff Kisker789277
stolik mikroskopowy XY  SmaractN/ANiestandardowa
konstrukcja Kolumna odsalająca Zeba Micro SpinThermoFischer Scientific89877  7K MWCO, 75 i mikro; L
1

Bibliografia

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603(1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669(2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982(2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909(2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10(2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lokalizacja pojedynczych cząsteczekmikroskopia STED (deplecji emisji stymulowanej)mikroskopia iluminacji strukturalnejobrazowanie tkanek linii zarodkowejprotokół immunohistochemiiosie chromosomówprofaza mejozy
Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.