Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64364

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są używane do zastąpienia i zmniejszenia zależności od zwierząt i komórek zwierzęcych w przedklinicznych testach kardiotoksyczności. W dwuwymiarowych formatach jednowarstwowych hiPSC-CM podsumowują strukturę i funkcję komórek mięśnia sercowego dorosłego człowieka podczas hodowli na optymalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ludzka okołoporodowa komórka macierzysta ECM (macierz zewnątrzkomórkowa indukująca dojrzewanie-MECM) dojrzewa strukturę, funkcję i stan metaboliczny hiPSC-CM w ciągu 7 dni po posiewaniu.

Dojrzałe monowarstwy hiPSC-CM również reagują zgodnie z oczekiwaniami na klinicznie istotne leki, ze znanym ryzykiem powodowania arytmii i kardiotoksyczności. Dojrzewanie monowarstw hiPSC-CM było aż do tej pory przeszkodą w powszechnym zastosowaniu tych cennych komórek w naukach regulacyjnych i badaniach przesiewowych pod kątem bezpieczeństwa. W artykule przedstawiono zwalidowane metody posiewu, dojrzewania i wysokoprzepustowego, funkcjonalnego fenotypowania funkcji elektrofizjologicznej i kurczliwej hiPSC-CM. Metody te mają zastosowanie do dostępnych na rynku oczyszczonych kardiomiocytów, a także kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych generowanych we własnym zakresie przy użyciu wysoce wydajnych, specyficznych dla komory protokołów różnicowania.

Wysokoprzepustowa funkcja elektrofizjologiczna jest mierzona za pomocą barwników wrażliwych na napięcie (VSD; emisja: 488 nm), fluoroforów wrażliwych na wapń (CSF) lub genetycznie kodowanych czujników wapnia (GCaMP6). Do optycznego zapisu każdego parametru funkcjonalnego wykorzystywane jest urządzenie do mapowania optycznego o wysokiej przepustowości, a do analizy danych elektrofizjologicznych wykorzystywane jest dedykowane oprogramowanie dostosowane do potrzeb klienta. Protokoły MECM są stosowane do badań przesiewowych leków przy użyciu dodatniego inotropu (izoprenalina) i blokerów kanału specyficznych dla ludzkiego genu Ether-a-go-go (hERG). Zasoby te umożliwią innym badaczom skuteczne wykorzystanie dojrzałych hiPSC-CM do wysokoprzepustowych, przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności, testów skuteczności leków nasercowych i badań sercowo-naczyniowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) zostały zatwierdzone na skalę międzynarodową i są dostępne do badań przesiewowych in vitro pod kątem kardiotoksyczności1. Wysoce czyste hiPSC-CM mogą być generowane w praktycznie nieograniczonej liczbie, kriokonserwowane i rozmrażane. Po ponownym platerowaniu również ożywiają się i zaczynają się kurczyć w rytmie przypominającym ludzkie serce2,3. Co ciekawe, poszczególne hiPSC-CM łączą się ze sobą i tworzą funkcjonalne syncytia, które biją jak pojedyncza tkanka. Obecnie hiPSC są rutynowo uzyskiwane z próbek krwi pacjentów, więc każda osoba może być reprezentowana za pomocą testów przesiewowych kardiotoksyczności hiPSC-CM in vitro4,5. Stwarza to możliwość przeprowadzenia "Badań klinicznych w naczyniu", ze znaczną reprezentacją z różnych populacji6.

Jedną z kluczowych zalet w porównaniu z istniejącymi metodami badań przesiewowych kardiotoksyczności na komórkach zwierzęcych i zwierzęcych jest to, że hiPSC-CM wykorzystują pełny ludzki genom i oferują system in vitro z genetycznymi podobieństwami do ludzkiego serca. Jest to szczególnie atrakcyjne dla farmakogenomiki i medycyny spersonalizowanej - przewiduje się, że stosowanie hiPSC-CM do opracowywania leków i innych terapii zapewni dokładniejsze, bardziej precyzyjne i bezpieczne recepty na leki. Rzeczywiście, dwuwymiarowe (2D) jednowarstwowe testy hiPSC-CM okazały się predykcyjne dla kardiotoksyczności leków, wykorzystując panel klinicznie stosowanych leków o znanym ryzyku wywołania arytmii1,7,8,9. Pomimo ogromnego potencjału hiPSC-CM oraz obietnicy usprawnienia i obniżenia kosztów opracowywania leków, istnieje niechęć do korzystania z tych nowatorskich testów10,11,12.

Do tej pory jednym z głównych ograniczeń powszechnego przyjęcia i akceptacji testów przesiewowych hiPSC-CM jest ich niedojrzały, podobny do płodowego wyglądu, a także ich funkcja. Krytyczna kwestia dojrzewania hiPSC-CM została przejrzana i przedyskutowana w literaturze naukowej do znudzenia13,14,15,16. Podobnie, zastosowano wiele podejść w celu promowania dojrzewania hiPSC-CM, w tym manipulacje macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) w monowarstwach 2D oraz rozwój 3D inżynieryjnych tkanek serca (EHTs)17,18. W chwili obecnej panuje powszechne przekonanie, że zastosowanie EHT 3D zapewni lepsze dojrzewanie w porównaniu z podejściami opartymi na monowarstwach 2D. Jednak monowarstwy 2D zapewniają wyższą efektywność wykorzystania komórek i większy sukces w powlekaniu w porównaniu z EHT 3D; 3D EHT wykorzystują większą liczbę komórek i często wymagają włączenia innych typów komórek, które mogą zakłócić wyniki. Dlatego w tym artykule skupiono się na zastosowaniu prostej metody do dojrzewania hiPSC-CM hodowanych jako monowarstwy 2D elektrycznie i mechanicznie sprzężonych komórek.

Zaawansowane dojrzewanie hiPSC-CM można osiągnąć w monowarstwach 2D za pomocą ECM. Monowarstwy 2D hiPSC-CM mogą być dojrzewane przy użyciu miękkiego, elastycznego szkiełka nakrywkowego z polidimetylosiloksanu, pokrytego macierzą błony podstawnej wydzielaną przez komórkę mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (mysi ECM). W 2016 r. raporty wykazały, że hiPSC-CM hodowane w tym miękkim stanie ECM dojrzewały funkcjonalnie, wykazując prędkości przewodzenia potencjału czynnościowego w pobliżu wartości serca dorosłego (~50 cm/s)18. Co więcej, te dojrzałe hiPSC-CM wykazywały wiele innych cech elektrofizjologicznych przypominających dorosłe serce, w tym hiperspolaryzowany spoczynkowy potencjał błonowy i ekspresję Kir2,1. Niedawne doniesienia zidentyfikowały powłokę ECM pochodzącą z ludzkich okołoporodowych komórek macierzystych, która wspomaga strukturalne dojrzewanie 2D hiPSC-CMs19. W tym miejscu przedstawiono łatwe w użyciu metody tworzenia strukturalnie dojrzałych monowarstw 2D hiPSC-CM do stosowania w wysokoprzepustowych badaniach elektrofizjologicznych. Ponadto zapewniamy walidację przyrządu do mapowania optycznego do automatycznego pozyskiwania i analizy jednowarstwowych funkcji elektrofizjologicznych 2D hiPSC-CM, przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie (VSD) oraz wrażliwych na wapń sond i białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

użycie hiPSC w tym protokole zostało zatwierdzone przez Komitet HPSCRO Uniwersytetu Michigan (Komitet Nadzoru nad Ludzkimi Pluripotencjalnymi Komórkami Macierzystymi). Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z listą materiałów i wyposażenia. W tabeli 1 przedstawiono podłoża i ich składy.

1. Rozmrażanie i powlekanie dostępnych na rynku kriokonserwowanych hiPSC-CM do dojrzewania na indukującej dojrzewanie macierzy zewnątrzkomórkowej (MECM)

  1. Podgrzej wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej i ponownie nawodnij płytki MECM zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą wapń i magnez, przez 1 godzinę przed posiewem kardiomiocytów (200 μl buforu na dołek 96-dołkowej płytki).
  2. Umyj płytki MECM 2x HBSS lub PBS zawierającym wapń i magnez przez 1 godzinę przed posiewem kardiomiocytów (200 μl buforu na dołek 96-dołkowej płytki) i utrzymuj studzienki nawodnione.
  3. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 37 °C.
  4. Wyjmij probówki kardiomiocytów ze zbiornika ciekłego azotu, przenieś probówki do suchego lodu i lekko otwórz nakrętki probówek, aby zwolnić ciśnienie.
    UWAGA: Uwolnienie ciśnienia w rurkach jest niezwykle ważne! Jeśli wewnątrz rur wzrośnie zbyt duże ciśnienie, mogą one eksplodować.
  5. Ponownie uszczelnij nakrętki probówek i umieść je w łaźni wodnej do rozmrożenia przez 4 min.
    UWAGA: Pozwól im całkowicie się rozmrozić, aby uniknąć uszkodzenia komórek z powodu częściowego rozmrożenia.
  6. Po rozmrożeniu komórek spryskaj probówki 70% etanolem przed otwarciem. Przenieść komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Powoli wlej 8 ml pożywki galwanicznej, mieszając probówkę za każdym razem, gdy dodaje się 1 ml, aby umożliwić komórkom dostosowanie się do zmian osmolarności.
    1. Umyj kriowial 1 ml podłoża galwanicznego za pomocą szklanej pipety o pojemności 1 ml. Następnie powoli wlej płyn do stożkowej rurki o pojemności 15 ml.
  7. Odwirować probówki o stężeniu ~300 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml podłoża galwanicznego. Usuń podwielokrotność i wykonaj liczenie żywych komórek za pomocą hemocytometru. Dodaj dodatkowe podłoże galwaniczne, aby uzyskać 7,5 × 105 komórek/ml.
    UWAGA: Do przygotowania 96 dołków potrzeba około 10 ml zawiesiny komórek.
  8. Dozować 100 μl zawiesiny komórek na dołek 96-dołkowej płytki pokrytej MECM za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Upewnij się, że unikasz wytrącania się komórek i uzyskaj jednolitą gęstość komórek we wszystkich studzienkach podczas powlekania.
  9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 dni przed zmianą pożywki na pożywkę konserwacyjną (200 μl/basenik). Zmień pożywkę pielęgnacyjną w 5 dniu po rozmrożeniu. Wykonaj testy EP w dniu 7 lub później, zgodnie z wcześniejszym opisem8,9. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, decydując się na przedłużenie hodowli komórkowej.

2. Różnicowanie ukierunkowane na serce hiPSC i oczyszczanie hiPSC-CM

  1. Ciepły 1x dostępny w handlu roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), HBSS bez wapnia i magnezu (HBSS --) i 6-dołkowe płytki pokryte rozpuszczoną macierzą błony podstawnej wydzielaną przez komórkę mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (mysi ECM) do temperatury pokojowej.
  2. Oznacz zróżnicowane kolonie za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym i aspiruj/ablaj. Umyj każdą studzienkę 1 ml HBSS--. Wykonaj dwa płukania w studzienkach zawierających >10 punktów różnicowania.
  3. Odessać HBSS i dodać 1 ml roztworu EDTA do każdej studzienki. Inkubować płytki przez maksymalnie 5 minut w temperaturze 37 °C. Po 3 minutach sprawdzić płytki i poszukać półprzezroczystych, białych, widocznych kolonii.
  4. Odessać roztwór EDTA i dodać 1 ml do pojedynczego dołka. Usunąć komórki za pomocą 2 ml pożywki hiPSC, wielokrotnie pipetując zawiesinę w górę i w dół, używając szklanej pipety o pojemności 10 ml w celu odłączenia wszystkich komórek macierzystych od studzienki i przenosząc zawiesinę komórek do probówki zbiorczej. Powtórz aspirację i przemieszczenie z kolejnymi studzienkami.
    UWAGA: Usuń trudne do podniesienia kolonie za pomocą końcówki szklanej pipety.
  5. Policz komórki macierzyste i dostosuj objętość do płytki 8,0 × 105 komórek/dołek. Hoduj komórki na pożywce hiPSC (2 ml / dołek), aż komórki macierzyste osiągną 90% zbieżności (ten czas jest od teraz określany jako D0).
  6. Przygotować 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego uzupełnionego 4 μM CHIR99021.
  7. Na D0 umyj każdą studzienkę z 6-dołkowej płytki komórek macierzystych 1 ml HBSS na studzienkę. Zastąp HBSS podstawową pożywką różnicującą uzupełnioną 4 μM CHIR99021.
  8. Na D1 nie rób nic.
  9. Na D2 przygotować podłoże do różnicowania podstawowego uzupełnione 4 μM IWP4.
  10. Zastąp pożywkę 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego uzupełnionej IWP4 na dołek.
  11. Na D3 nie rób nic dla różnicowania specyficznego dla komór. W celu różnicowania specyficznego dla przedsionków należy odessać pożywkę i dodać 2 ml podłoża podstawowego uzupełnionego 4 μM roztworu IWP4 i 1 μM kwasu retinowego (RA) na studzienkę.
  12. Na D4 odessać pożywkę i dodać 2 ml podłoża podstawowego na studzienkę w celu różnicowania komór. W celu różnicowania przedsionków należy odessać pożywkę i dodać 2 ml podłoża podstawowego uzupełnionego 1 μM roztworem RA na studzienkę.
  13. Na D5 nie rób nic.
  14. Na D6 odessać pożywkę i dodać 2 ml podłoża podstawowego do dołka (zarówno dla różnicowania przedsionkowego, jak i komorowego).
  15. Na D7 nie rób nic.
  16. Na D8 odessać pożywkę i dodać 2 ml pożywki podtrzymującej kardiomiocyty. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż do separacji komórek lub postępuj zgodnie z planem przewlekłej ekspozycji na leki.

3. Oczyszczanie hiPSC-CM za pomocą MACS (sortowanie komórek aktywowane magnetycznie)

  1. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć każdą studzienkę 1 ml HBSS--. Dysocjuj komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 10 minut. Ponownie zawiesić i wyizolować komórki w każdym dołku za pomocą 2 ml pożywki galwanicznej, aby dezaktywować trypsynę/EDTA.
  2. Zebrać komórki z sześciu dołków do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 70 μm. Następnie umyj sitko 3 ml środka galwanicznego. Policz komórki.
  3. Odwirować zawiesinę o stężeniu ~300 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i przemyć komórki 20 ml lodowatego buforu rozdzielającego MACS. Następnie ponownie odwirować przy ~300 × g przez 5 minut.
  4. Zawiesić osad w 80 μl zimnego buforu separacyjnego MACS na 5 ×10 6 komórek. Dodaj 20 μl zimnego koktajlu zubożającego niekardiomiocyty (ludzkiego) na 5 × 106 komórek. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować na lodzie przez 10 minut.
  5. Przemyć próbkę, dodając 4 ml zimnego buforu rozdzielającego MACS na 5 ×10 6 komórek. Odwirować próbkę o masie ~300 × g przez 5 minut i odessać supernatant.
  6. Zawiesić osad w 80 μl zimnego buforu separacyjnego MACS na 5 ×10 6 komórek. Dodaj 20 μl zimnych mikrogranulek antybiotyny na 5 × 106 komórek. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i inkubuj przez 10 minut na lodzie.
  7. Podczas inkubacji próbek należy umieścić kolumny dodatniego zubożenia (wyposażone w filtry do wstępnej separacji 30 μm) na separatorze MACS i umieścić oznakowane probówki zbiorcze o pojemności 15 ml poniżej kolumn. Jedna kolumna jest potrzebna na każde 5 × 106 komórek.
  8. Zalać każdą kolumnę 3 ml zimnego buforu separacyjnego MACS. Wymieszać zawiesinę komórkową traktowaną przeciwciałem z 2 ml buforu separacyjnego MACS na 5 × 106 komórek i dodać do kolumny.
    UWAGA: Nie odwirowywać! Wirowanie na tym etapie ma szkodliwy wpływ na wydajność kardiomiocytów.
  9. Dodać 2 ml buforu separacyjnego MACS do każdej kolumny i zbierać przepływ, aż do zebrania 12 ml przepływowej zawiesiny kardiomiocytów.
    UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby kolumny całkowicie wyschły.
  10. Odwirować kardiomiocyty w temperaturze ~300 × g przez 5 minut, odrzucić supernatant i zawiesić kardiomiocyty w 1 ml pożywki galwanicznej.
  11. Policz komórki, aby określić stężenie, dostosuj objętość do pożądanej gęstości wysiewu i pokryj komórki płytkami. Umieść oczyszczone kardiomiocyty na 96-dołkowych płytkach MECM, jak opisano powyżej w krokach 1.9-1.11 (7.5 × 105 komórek/dołek).

4. Mapowanie optyczne przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie (VSD) i fluoroforów wrażliwych na wapń (CSF)

  1. Przygotować odpowiednią ilość VSD w HBSS z wapniem i magnezem, dodając 1 μl barwnika VSD na ml HBSS i 10 μl adiuwantu nasycającego na ml HBSS.
    UWAGA: Zazwyczaj płytka 96-dołkowa wymaga 10 ml roztworu VSD.
  2. Alternatywnie przygotuj HBSS z wapniem i magnezem uzupełnionym 5 μM płynu mózgowo-rdzeniowego. Odessać pożywkę podtrzymującą kardiomiocyty i zastąpić ją 100 μl VSD lub CSF na dołek 96-dołkowej płytki. Inkubować komórki przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  3. Usuń barwniki i zastąp je pożywką testową lub HBSS. Równoważyć w temperaturze 37 °C w celu uzyskania danych wyjściowych, mapowania optycznego za pomocą urządzenia do mapowania optycznego o wysokiej przepustowości.
  4. Potraktuj komórki lekami do testów ostrej ekspozycji lub zmapuj komórki, które były przewlekle narażone na działanie leków będących przedmiotem zainteresowania.
  5. Do badania kardiotoksyczności na płytkach 96-dołkowych należy użyć czterech dawek związku po co najmniej sześć dołków na dawkę. Należy stosować dawki w zakresie od poniżej do wyższego od efektywnego terapeutycznego stężenia w osoczu, w tym dawkę klinicznie skutecznego terapeutycznego stężenia w osoczu.
  6. Rozcieńczyć leki w dimetylosulfotlenku, przechowywać je w postaci roztworów podstawowych w temperaturze -20 °C, a następnie rozcieńczyć w HBSS do pożądanych stężeń.
  7. Przed zastosowaniem leku należy wykonać podstawowe pomiary elektrofizjologiczne, jak opisano w punkcie 5. Po zastosowaniu leków należy wykonać zapisy elektrofizjologiczne co najmniej 30 minut później w przypadku badań przewlekłych. Zapoznaj się z poniższymi sekcjami, aby zapoznać się z procedurami pozyskiwania i analizy danych mapowania optycznego.

5. Mapowanie optyczne z wykorzystaniem genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI)

  1. Płytki dostępne na rynku lub oczyszczone przez MAC hiPSC-CM, jak opisano powyżej, przy użyciu 96-dołkowych płytek powlekanych MECM w celu uzyskania dojrzałych hiPSC-CM. Aby utworzyć zlewające się monowarstwy, płytka 7,5 × 104 CM na dołek każdej płytki 96-dołkowej. Użyj podłoża galwanicznego.
  2. Po 48 godzinach w pożywce galwacyjnej zmienić na pożywkę do konserwacji kardiomiocytów.
  3. W 4 dniu po rozmrożeniu i ponownym posianiu dodać rekombinowanego adenowirusa do ekspresji GCaMP6m (AdGCaMP6m) do komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) = 5. Dodaj wirusa za pomocą pożywki testowej CM.
    UWAGA: W tym przypadku eksperymenty z użyciem GCaMP6m zostały przeprowadzone na kardiomiocytach iCell2 od komercyjnego dostawcy.
  4. W 5 dniu usuń pożywkę adGCaMP6m i zastąp ją świeżym RPMI+B27 (pożywka podtrzymująca kardiomiocyty).
  5. W dniu 7 obserwuj CM za pomocą mikroskopii lub obrazowania optycznego, aby uwidocznić spontaniczne skurcze i odpowiadające im stany przejściowe wapnia.
  6. W dniu 7 lub później, w celu badań przesiewowych leków, należy bezpośrednio przenieść 96-dołkowe płytki dojrzałych monowarstw hiPSC-CM wykazujących ekspresję GCaMP6m do optycznego obrazowania mapowania z inkubatora w celu uzyskania danych wyjściowych.
  7. Po pobraniu danych elektrofizjologicznych należy umieścić płytki CM z powrotem w inkubatorze hodowli tkankowych w celu wykonania pomiarów w kolejnym punkcie czasowym.
  8. Po zapisach wyjściowych należy zastosować leki, stosując co najmniej cztery dawki każdego leku i co najmniej sześć dołków na dawkę. Zrównoważ leki na komórkach przez co najmniej 30 minut przed zebraniem danych. Podgrzej temperaturę odwiertu do ~37 °C przed i w trakcie pozyskiwania danych.
  9. Po zapisach wyjściowych całej płytki, dodaj izoproterenol (500 nM) do każdego dołka, aby uzyskać wiarygodne dane dotyczące odpowiedzi na lek. Określ ilościowo wpływ izoproterenolu na szybkość dudnień jednowarstwowych, amplitudę skurczu (amplitudę przejściową wapnia) i czas trwania przejściowego wapnia (patrz Rysunek 6), jak opisano w sekcji 5.

6. Akwizycja danych i analiza map optycznych

  1. Upewnij się, że kamera urządzenia do mapowania optycznego, transiluminator i grzałka płytowa są włączone.
  2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i określ lokalizację zapisywania plików.
  3. Otwórz przednią szufladę i umieść płytkę na grzejniku płytowym.
  4. Uzyskaj ciemną ramkę, klikając przycisk Ciemna ramka.
  5. Wybierz Czas trwania (10-30 s) i częstotliwość odświeżania (np. 100 kl./s; 250 kl./s, aby uzyskać wyższą rozdzielczość czasową), a następnie kliknij przycisk Rozpocznij akwizycję.
  6. Otwórz oprogramowanie analityczne i na karcie Importuj/Filtruj wybierz opcję Przeglądaj w poszukiwaniu pojedynczego pliku lub Sąsiaduj wielokrotnie, aby zrekonstruować płytę.
  7. Wybierz tryb parametrów (APD lub CaTD), wprowadź Odległość na piksel i użyj Kreatora odwiertów, aby określić położenie studni na obrazie. Kliknij Zapisz proces, aby przejść do następnej karty.
  8. Otwórz zakładkę ROI (regiony zainteresowania) i wybierz, czy chcesz narysować ROI ręcznie, automatycznie lub w ogóle nie używać ROI, co następnie uwzględni całość do analizy. Po wybraniu ROI kliknij przycisk Proces/Zapisz, aby przejść do następnego kroku. Zaznacz pola Ukryj studnie i Pokaż tylko filtrowane, aby zwizualizować zwrot z inwestycji.
  9. Otwórz kartę Analiza i w prawym górnym rogu ekranu wybierz każdą studnię lub zwrot z inwestycji, aby potwierdzić dokładność automatycznego wykrywania dudnień. Dodaj lub usuń bity ze ścieżek, naciskając Dodaj bity/ Zapisz bity lub zaznaczając pojedyncze uderzenia i naciskając Delete na klawiaturze.
  10. Opcjonalnie można użyć funkcji Mapy średnich skupień, aby utworzyć mapy cieplne wybranych parametrów dla blachy.
  11. Kliknij przycisk Wykres czasoprzestrzenny w zakładce Analiza, aby wyświetlić dane dla każdego odwiertu lub zwrotu z inwestycji. Po upewnieniu się, że wykrywanie dudnienia jest dokładne, przejdź do zakładki Eksport i wybierz Format pliku. Naciśnij przycisk Eksportuj i utwórz folder, do którego chcesz wyeksportować dane. Przejdź do otwierania plików danych i uruchom wybraną procedurę analizy statystycznej.
    UWAGA: Preferowane są pliki .xlxs, ponieważ wszystkie parametry są eksportowane w jednym pliku; Inne formaty (.csv lub .tsv) generują jeden plik na parametr.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hiPSC-CM Dojrzewanie charakteryzujące się kontrastem fazowym i immunofluorescencyjnym obrazowaniem konfokalnym
Oś czasu dojrzewania za pośrednictwem ECM dostępnych na rynku hiPSC-CM przy użyciu 96-dołkowych płytek pokrytych MECM przedstawiono w Rysunek 1A. Dane te są zbierane za pomocą dostępnych na rynku kardiomiocytów, które docierają do laboratorium w postaci kriokonserwowanych fiolek z komórkami. Każda fiolka zawiera >5 × 106 żywotnych kardiomiocytów. Komórki są ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka różnych podejść do badań przesiewowych kardiotoksyczności in vitro z wykorzystaniem hiPSC-CM. W niedawnym artykule "Best Practices" na temat stosowania hiPSC-CM przedstawiono różne testy in vitro , ich podstawowe odczyty i, co ważne, szczegółowość każdego testu w celu ilościowego określenia funkcji elektrofizjologicznych ludzkiego serca20. Oprócz stosowania elektrod przebijających błonę, najbardziej bezpośrednim pomiarem funkcji elektrofizjologicznych ludzkiego ser...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH jest konsultantem i doradcą naukowym firmy StemBioSys, Inc. TB jest pracownikiem firmy StemBioSys, Inc. AMR i JC są byłymi konsultantami firmy StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR i JC są udziałowcami StemBioSys, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez granty NIH HL148068-04 i R44ES027703-02 (TJH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna EDTAGibco25200-056
0,5 mg/ml BSA (7,5 &mikro; mol/L)Millipore SigmaA3294
2,9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumina ludzkaSigmaA9731-1G
alfa aktyninyThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/A
https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Przezroczyste podłoże testowe (fluorobryt)ThermoFisherA1896701Dla adenowirusa transdukcja
DAPIThermoFisher62248
DMEM: F12Gibco11330-032
FBS (płodowa surowica bydlęca)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
Nośnik konserwacyjny iCell CMFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat SigmaA8960-5g
L-glutaminaGibcoA2916801
Kolumny LSMiltenyii Biotec130-042-401
Bufor MACS (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Mapowanie optyczne CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Mikroskop konfokalny Nikon A1RNikon
Aminokwasy endogenneGibco11140-050
filtr wstępnej separacjiMiltenyii Biotec130-041-407
Zestaw do izolacji kardiomiocytów pochodzących z PSC, człowiekMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro Separator MACS (magnes)Miltenyii Biotec130-091-051
Kwas retinowySigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-glutamina)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
Przeciwciało TnI (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (kwas etylenodiaminotetraoctowy - roztwór EDTA)Gibco15040-066
Y-27632 dichlorowodorekTocris1254
β-merkaptoetanolGibco21985023
przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834(2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638(2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071(2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941(2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368(2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kardiomiocyty pochodz ce z HiPSChodowla monowarstwowamacierz zewn trzkom rkowamapowanie optyczneanaliza elektrofizjologicznaobrazowanie wapniamagnetyczna separacja kom rektestowanie odpowiedzi na lekipomiar potencja u czynno ciowego

Powiązane artykuły