Artykuł metodologiczny

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

DOI:

10.3791/64369

⸱

20 października 2022

 ,  ,  ,  , 
1The Francis Crick Institute, 2MSD R&D Innovation Centre

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogeneza dorosłego hipokampa (AHN), która polega na utrzymywaniu przez całe życie proliferacyjnych i spokojnych nerwowych komórek macierzystych (NSC) w strefie subziarnistej (SGZ) zakrętu zębatego (DG) i ich różnicowaniu się od nowo narodzonych neuronów do komórek ziarnistych w warstwie komórek ziarnistych, jest dobrze potwierdzona w licznych badaniach. Wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, w szczególności gryzoni, jest cennym narzędziem do badania szlaków sygnałowych regulujących AHN i badania roli każdego typu komórek, które tworzą niszę neurogenną hipokampa. Aby rozwiązać ten ostatni problem, metody łączące izolację pojedynczych jąder z sekwencjonowaniem nowej generacji wywarły znaczący wpływ w dziedzinie AHN w celu identyfikacji sygnatur genów dla każdej populacji komórek. Konieczne jest jednak dalsze udoskonalenie tych technik w celu profilowania fenotypowego rzadszych populacji komórek w DG. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która wykorzystuje sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) w celu wykluczenia większości populacji neuronów z zawiesiny pojedynczych jąder wyizolowanej ze świeżo wypreparowanego DG, poprzez selekcję niebarwionych jąder dla antygenu NeuN, w celu przeprowadzenia sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (snRNA-seq). Metoda ta jest potencjalnym krokiem naprzód w dalszych badaniach nad międzykomórkową regulacją AHN oraz w odkrywaniu nowych markerów i mechanizmów komórkowych u różnych gatunków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciągłe generowanie neuronów hipokampa w wieku dorosłym, znane również jako neurogeneza dorosłego hipokampa (AHN), jest związane z funkcjami poznawczymi, takimi jak uczenie się, nabywanie/oczyszczanie pamięci i separacja wzorców, i wydaje się być ważnym mechanizmem odporności w starzeniu się i chorobach neurodegeneracyjnych, aby zapobiec deficytom poznawczym1,2,3. Gryzonie były modelem wybieranym do badania AHN przy użyciu kilku metod, w tym immunocytochemii i metod sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Przełożenie tych wyników na inne gatunki pozostaje kontrowersyjne. Rzeczywiście, AHN zaobserwowano u większości gatunków, ale stopień, w jakim utrzymuje się przez całe życie, szczególnie u ludzi4,5,6,7,8, jest regularnie dyskutowany.

Do tej pory potwierdzono, że różne wewnętrzne i zewnętrzne ścieżki sygnałowe modulują AHN1. Jednak wpływ komunikacji międzykomórkowej na AHN dopiero się wyłania9. Można to przede wszystkim przypisać niewystarczającej specyficzności obecnie znanych markerów komórkowych do przeprowadzenia analizy in vivo na zwierzętach modyfikowanych genetycznie. Rzeczywiście, wiele badań opierało się na markerach, takich jak podwójna kortyna lub kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), które ulegają ekspresji w wielu typach komórek1. Po drugie, złożoność i wysoki stopień różnorodności komórek w dorosłej niszy hipokampa10 stwarza wyzwania techniczne związane z profilowaniem każdego typu komórek. Dotyczy to w szczególności analizy bioinformatycznej z nakładającymi się markerami komórkowymi stosowanymi w potokach analitycznych dla różnych populacji, takich jak NSC lub komórki glejowe, co prowadzi do kontrowersyjnych wniosków podczas oceny AHN7,11. Po trzecie, ogromna liczba neuronów utrudnia badania nad mniej licznymi populacjami komórek, takimi jak astrocyty, oligodendrocyty czy komórki wyściółkowe, mimo że ich rola w precyzyjnej regulacji AHN staje się coraz bardziej widoczna9. Łącznie te ograniczenia wpływają na zdolność do przekładania wyników z gryzoni na inne gatunki. Jest to szczególnie wzmocnione przez trudności w rekapitulacji in vitro złożonej tkanki, takiej jak nisza neurogenna hipokampa, oraz przez wiele przeszkód w dostępie do tkanek wysokiej jakości wraz z brakiem znormalizowanych protokołów przetwarzania tkanek w badaniach z udziałem tkanek ludzkich12,13. Dlatego tak ważne jest opracowanie nowych podejść do profilowania populacji komórek i identyfikacji nowych markerów komórkowych w obrębie zakrętu zębatego (DG), co ostatecznie doprowadzi do lepszego zrozumienia różnych wkładów każdego typu komórek w regulację AHN.

Aby to osiągnąć, izolacja pojedynczych komórek (sc) i pojedynczych jąder (sn) w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA stała się instrumentalna do badania złożonych tkanek, takich jak klasa DG14. W związku z tym strategie wzbogacania komórek w celu wyizolowania pojedynczych komórek z niszy hipokampa dorosłej myszy zostały przeprowadzone głównie w celu zbadania NSCs15,16. Interesująca strategia wzbogacania komórek nieneuronalnych z DG została zastosowana poprzez sekwencjonowanie podwójnie ujemnych pojedynczych komórek GluR1/Cd24, co spowodowało sekwencjonowanie 1408 komórek bez wyraźnych klastrów między astrocytami a NSC po analizie bioinformatycznej17. Może to być spowodowane ostrym trawieniem enzymatycznym wymaganym do przygotowania pojedynczej komórki, które uszkadza integralność komórki i RNA. Aby obejść ten problem techniczny, opracowano kilka metod wykorzystujących izolację pojedynczych jąder, które są szczególnie przydatne w skomplikowanych tkankach11,18. Jednak przewaga neuronów w obrębie DG lub szerzej w układzie hipokampowo-śródwęchowym generuje błąd próbkowania w celu zbadania całości populacji komórek obecnych w tych obszarach mózgu. Ponadto ograniczona liczba komórek do załadowania w celu przygotowania bibliotek pojedynczych komórek podkreśla obecność głównej populacji komórek w analitycznych potokach sekwencjonowanych pojedynczych jąder. Rzeczywiście, duże skupiska neuronów są często opisywane i analizowane, podczas gdy inne populacje komórek są niedostatecznie reprezentowane lub pomijane5,11.

W próbie przezwyciężenia tych uprzedzeń i umożliwienia profilowania typów komórek innych niż neurony obecne w DG myszy, w tym badaniu opracowano metodę wykorzystującą zasadę sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS)18, która wyklucza większość populacji neuronów poprzez negatywną selekcję barwionych pojedynczych jąder za pomocą neuronalnego antygenu jądrowego (NeuN, znany również jako Rbfox3). Przy wyborze antygenu kierowała się literaturą opisującą NeuN jako wiarygodny marker neuronalny19 oraz koniecznością użycia białka jądrowego w tym podejściu. Komórki posortowane przez NeuN-ujemne FACS przygotowano następnie do sekwencjonowania RNA na platformie 10x Genomics. Wyniki pokazują, że wykluczenie komórek wykazujących ekspresję NeuN pozwala na wysokiej jakości profilowanie transkryptomiczne populacji komórek glejowych i rzadkich dla danego typu komórki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Francisa Cricka, a także wytycznymi i przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przygotowanie zawiesiny pojedynczego jądra z wypreparowanego DG dorosłych myszy do sekwencji snRNA w populacjach nieneuronalnych. Diagram przepływu opisujący główne etapy protokołu, które obejmują rozbiór myszy DG, przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder, barwienie immunologiczne NeuN i sortowanie ujemnych NeuN-FANS przed przystąpieniem do sekwencjonowania snRNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Sekcja DG (czas: 15 min)

  1. Przygotować pożywki do izolacji jąder 1 i 2 (NIM1 i NIM2), bufor homogenizacyjny (HB) i pożywkę do przemywania (WM) (tabela uzupełniająca 1). Umieść wszystkie, pożywki, odczynniki i narzędzia na lodzie, aż będą potrzebne. Umieścić homogenizator Dounce (patrz Tabela Materiałów) na lodzie podczas przygotowania (minimum 1 h przed etapem homogenizacji).
    UWAGA: NIM1 można przygotować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. NIM2, HB i WM powinny być świeżo przygotowane.
    UWAGA: Ostrożnie manipuluj DTT, inhibitorem proteazy i Triton X-100. Związki te działają drażniąco na skórę i oczy, są ostro toksyczne i niebezpieczne dla środowiska wodnego. Podczas używania tych chemikaliów należy nosić rękawice ochronne, odzież, ochronę oczu i twarzy, dokładnie umyć ręce po użyciu i unikać uwolnienia do środowiska.
  2. Eutanazja 22-miesięcznego samca myszy C57Bl/6J przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z procedurą Home Office Schedule 120.
    UWAGA: Zobacz dyskusję na temat uzasadnienia użycia 22-miesięcznej myszy w tym badaniu. Jednak protokół ten może być wykonywany w każdym wieku przez cały okres życia.
  3. Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji i przenieś go na 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatym 1x PBS (Ryc. 1). Umieść szalkę Petriego na lodzie. Usuń móżdżek za pomocą skalpela i przetnij mózg na pół między obiema półkulami (wzdłuż osi strzałkowej).
  4. Napełnij nową 10-centymetrową szalkę Petriego lodowatym PBS i umieść ją na lodzie. Przenieś jedną połowę mózgu na nową szalkę Petriego. Za pomocą lornetki rozłóż DG na czynniki pierwsze i powtórz ten krok, aby uzyskać drugą DG z drugiej połowy mózgu.
    UWAGA: Te kroki (kroki 1.2-1.4) zostały zaadaptowane z wcześniej opisanej procedury21. Na tym etapie ważne jest, aby postępować tak szybko, jak to możliwe, aby zachować integralność komórek.
  5. Przenieś dwa DG do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce i dodaj 1 ml zimnego HB.

2. Dysocjacja tkanek, izolacja pojedynczych jąder i immunologiczne barwienie anty-NeuN (Czas trwania: 2 godziny)

  1. Homogenizować tkankę za pomocą 10 pociągnięć luźnym tłuczkiem "A", a następnie 15 pociągnięć ciasnym tłuczkiem "B".
    UWAGA: Homogenizację odbitą należy przeprowadzać z zaprawą na lodzie delikatnymi pociągnięciami, aby zmniejszyć ciepło spowodowane tarciem i pienieniem. Wszystkie i sprzęt powinny być wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie podczas zabiegu.
  2. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 ml; przepłukać homogenizator Dounce 1 ml zimnego HB i połączyć z tą samą probówką. Dodać 3 ml HB do probówki o pojemności 15 ml i inkubować przez 5 minut na lodzie. Wymieszaj 2x, delikatnie odwracając rurkę.
  3. Wstępnie zwilż nasadkę sitka o pojemności 70 μm 0,5 ml HB w probówce o pojemności 50 ml. Odcedzić zawiesinę jąder od kroku 2.2, delikatnie przechylając probówkę o pojemności 15 ml do sitka komórkowego. Umyj sitko do komórek 0,5 ml HB.
  4. Wyjąć sitko i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, używając wirówki z odchylanym wiadrem. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Odcedzenie homogenatu pomoże zredukować zanieczyszczenia, co ma kluczowe znaczenie dla cytometrii przepływowej i dalszych etapów sekwencjonowania snRNA.
  5. Delikatnie zawiesić osad w 4 ml HB za pomocą pipety P1000. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Wirować w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml WM.
  6. Wstępnie zwilż nasadkę sitka 35 μm na probówce o pojemności 15 ml z 0,5 ml WM. Odcedź zawiesinę jąder od kroku 2.5 przez sitko do komórek, delikatnie pipetując po 0,5 ml za pomocą pipety P1000.
  7. Umyj nakrętkę sitka 0,5 ml WM i umieść probówkę na lodzie. Przenieść filtrat do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 500 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml WM.
  8. Wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml WM z mysim przeciwciałem anty-NeuN, przeciwciałem sprzężonym Alexa Fluor 488 (anty-NeuN-AF488, 1:32 000) i 1 μg/ml DAPI. Inkubować przez 45 minut na lodzie w ciemności.
    UWAGA: Aby zoptymalizować barwienie immunologiczne izolowanych jąder, zaleca się miareczkowanie przeciwciała w celu określenia optymalnego rozcieńczenia do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej. Następnie przeprowadź odpowiednie kontrole, aby potwierdzić, że warunki barwienia są optymalne. Na przykład w przypadku sprzężonego przeciwciała anty-NeuN-AF488 przeprowadzono kontrolę negatywną (tj. Brak dodatku przeciwciała, rysunek uzupełniający 1A) i kontrolę pozytywną (tj. barwienie przeciwciałem, rysunek uzupełniający 1B) w celu oceny segregacji populacji niebarwionych i barwionych. Rozpoczynając pracę z przeciwciałem sprzężonym z AF488, zaleca się przeprowadzenie kontroli izotypu sprzężonego z AF488 w celu oceny swoistości. W przypadku stosowania przeciwciała niesprzężonego konieczne może być dodatkowe kontrole, takie jak dodanie przeciwciała drugorzędowego tylko do preparatu jądrowego, w celu oceny niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego.

3. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) w celu wykluczenia populacji neuronalnych (Czas trwania: 45 min)

  1. Zawiesinę jąder wybarwionych immunologicznie przenieść do probówki o pojemności 5 ml i trzymać na lodzie do czasu rozpoczęcia procedury cytometrii przepływowej.
    UWAGA: W przypadku pracy z większymi kawałkami tkanki niż dwa myszy DG, może być wymagane dalsze rozcieńczanie buforem WM, aby uniknąć zatkania FACS, jeśli gęstość jąder w roztworze stanie się wysoka.
  2. Wirować próbki przez 3 s z małą prędkością przed umieszczeniem probówek w przyrządzie FACS (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: (Konfiguracja FACS) Maszyny sortujące muszą być wyrównane na początku procedury z cząstkami kalibracyjnymi zgodnie z zaleceniami producenta. Opóźnienie kropli zostało skalibrowane za pomocą kulek lub mikrosfer (patrz tabela materiałów) zgodnie z modelem FACS. Próbki sortowano w temperaturze 4 °C w trybie czystości. Aby zmniejszyć objętość zbierania, jądra posortowano przez dyszę o średnicy 70 μm pod ciśnieniem zalecanym dla cytometru przepływowego. Jądra posortowano do 1,5 ml probówek o niskim stopniu wiązania (patrz tabela materiałów) zawierających 50 μl WM. Wszystkie probówki pobrane zostały pokryte PBS + 5% BSA w temperaturze 4 °C przez noc, aby zmniejszyć ryzyko przywierania jąder do ścianek probówki.
  3. Aby uzyskać dane z próbki zawiesiny barwionych jąder, ustaw bramki na wysokości DAPI i obszarze DAPI, aby wykluczyć resztki komórek i zagregowane jądra (Rysunek 2A). Ponadto należy oddzielić pojedyncze jądra od wszelkich pozostałych agregatów barwionych DAPI lub szczątków komórkowych, ustawiając bramki w obszarze logarytmu rozproszonego bocznego (SSC) i obszaru logarytmu rozproszenia do przodu (FCS) (Rysunek 2B).
  4. Ustaw bramki dla anty-NeuN-AF488 i obszaru FSC, aby wyizolować populację NeuN-AF488-ujemną, jak pokazano na Rysunek 2C.
  5. Po analizie, stosując opisaną powyżej strategię bramkowania, posortuj populację NeuN-AF488-ujemną w 1,5 ml probówki zbiorczej wypełnionej 50 μl WM.
    UWAGA: Zgodnie z opisaną powyżej strategią bramkowania i procedurą preparacji w celu wyizolowania DG z mózgu dorosłej myszy, oczekuje się, że populacja NeuN-AF488-ujemna będzie reprezentować ~14% pojedynczych jąder.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Izolacja i profilowanie transkryptomiczne populacji komórek nieneuronalnych z DG. (A-C) Strategia bramkowania w celu wyizolowania pojedynczych jąder NeuN-AF488 ujemnych i wykluczenia szczątków komórkowych. (A) Wykres punktowy FANS reprezentatywnej próbki izolowanych jąder, przedstawiający ustawienie bramki dla wyboru jąder DAPI+ i wykluczenie szczątków i agregatów komórkowych. (B) Dalsza selekcja odpowiednich pojedynczych jąder przy użyciu obszaru FSC i obszaru SSC. (C) Bramki dla NeuN-AF488 w celu wykluczenia populacji dodatniej i sortowania dla ujemnych pojedynczych jąder. (D) Mikrofotografia dobrej zawiesiny pojedynczych jąder z minimalną ilością zanieczyszczeń i wyższym udziałem jąder dobrej jakości (okrągły kształt, strzałka) w porównaniu z jądrami złej jakości (biała strzałka). Podziałka = 50 μm, 10 μm (wstawka). (E,F) Analiza danych sekwencyjnych snRNA i profilowanie odrębnych populacji komórek wyizolowanych z DG 22-miesięcznych samców myszy C57BL/6J. Wykresy UMAP (Uniform Multifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) profili pojedynczych jąder z komórek posortowanych bez FACS i (F) NeuN-ujemnych komórek FACS, pokolorowane według typu komórki. (G) Wykresy kołowe porównujące częstość występowania zidentyfikowanych typów komórek w obu próbkach. (H) Odpowiednie wskaźniki dla sekwencjonowanych próbek: liczba jąder, mediana liczby genów i transkrypty na jądro. (I) Wykresy skrzypcowe przedstawiające rozkład liczby genów i transkryptów wykrytych dla każdego typu komórki w obu próbkach. Astr. = astrocyty, Olig. = oligodendrocyty, Vasc. = komórki naczyniowe, CRC = komórki Cajal-Retzius, Neur. = neurony, Imm. = komórki odpornościowe, OPC = komórki prekursorowe oligodendrocytów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder do przeprowadzenia sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (Czas trwania: 30 min)

  1. Po sortowaniu dodać 1 ml PBS zawierającego 1% BSA do probówki zbiorczej w celu zebrania kropelek na ściance probówki i wirować z prędkością 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, pozostawiając 50 μl,
    UWAGA: Z odwirowanymi jądrami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ może być trudno zaobserwować jakiekolwiek osadki na dnie probówki. Użycie wirówki z odchylanym wiadrem pomoże usunąć supernatant bez zakłócania osadu.
  2. Delikatnie pipetować, aby ponownie zawiesić odwirowane jądra. Dodać 5 μl zawiesiny jąder do 5 μl błękitu trypanowego w mikroprobówce o pojemności 0,5 ml.
    UWAGA: Z błękitem trypanowym należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest on niebezpieczny dla zdrowia, może powodować raka i podejrzewa się, że działa szkodliwie na płodność lub nienarodzone dziecko. Nosić rękawice ochronne, odzież oraz ochronę oczu i twarzy. Nie dotykaj, dopóki wszystkie środki ostrożności nie zostaną przeczytane i zrozumiane.
  3. Zmierzyć stężenie i ocenić żywotność zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Wykonaj przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie jąder zgodnie z opisem w kroku 5.
    UWAGA: Próbki, które zostały uznane za dobrej jakości do sekwencjonowania, wykazały pod mikroskopem okrągły i regularny kształt jąder bez resztek komórek (Rysunek 2D). Obecność halo wokół błony jądrowej lub agregacja wielu jąder razem są oznakami uszkodzonych jąder i takie zawiesiny komórek nie powinny być brane pod uwagę przy sekwencjonowaniu snRNA (Rysunek 2D). Zmierzone stężenie jąder mieściło się w zakresie 300-700 jąder/μl.

5. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek

UWAGA: Opis poniższych kroków jest oparty na wewnętrznej platformie sekwencjonowania użytej w tym badaniu (patrz Tabela Materiałów). Dlatego niektóre ustawienia mogą się różnić w przypadku korzystania z innej platformy. Tutaj opisane są tylko kluczowe kroki, a każdy parametr należy określić zgodnie ze wskazówkami i protokołami wybranego producenta, aczkolwiek z optymalizacją przed pierwszym użyciem. Bardzo ważne jest, aby przygotowanie bibliotek odbyło się tak szybko, jak to możliwe po zagęszczeniu posortowanych zawiesin jąder, aby uniknąć degradacji RNA i zapewnić optymalną jakość sekwencjonowania.

  1. Załaduj od 7 000 do 10 000 jąder do mikroprzepływowego układu jednokomórkowego.
  2. Jądra załadowane należy podzielić na nanolitrowe kropelki za pomocą dostarczonego sterownika i odczynników od wybranego dostawcy. Lizuj jądra w każdej kropli i dokonuj odwrotnej transkrypcji RNA.
    UWAGA: W kropelce wszystkie powstałe cDNA miały ten sam kod kreskowy komórki.
  3. Przygotuj biblioteki do sekwencjonowania snRNA-seq zgodnie z wytycznymi wybranego dostawcy i zapewniając kompatybilność z platformą sekwencjonowania. Sprawdź jakość i stężenie bibliotek końcowych za pomocą elektroforezy, fluorometrii lub metod opartych na qPCR i, jeśli ma to zastosowanie, połącz je równo przed sekwencjonowaniem.
  4. Denaturyzacja łączy biblioteki ekspresji genów 3 ʹ i rozcieńcza zgodnie z zaleceniami producenta.
  5. Wykonuj sekwencjonowanie z parowanym, pojedynczym lub podwójnym indeksowaniem na platformie sekwencjonowania nowej generacji z głębokością sekwencjonowania 50 000 par odczytu na komórkę.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę przygotowania zawiesiny pojedynczych jąder nieneuronalnych wyizolowanych z DG w celu przeprowadzenia sekwencji snRNA. Z wentylatorami lub bez, grupowanie bioinformatyczne ujawniło dobrze oddzielone grupy jąder odpowiadające znanym typom komórek w DG (Rysunek 2E,F). W próbce niesortowanej przez FACS większość wysokiej jakości jąder, które zostały zsekwencjonowane, składała się z trzech grup neuronów (84,9% wszystkich jąder dla tej próbki, Rysunek 2E,G,H). Takie wyniki są oczekiwane, biorąc pod uwagę, że najbardziej reprezentowanymi populacjami komórek w DG są neurony ziarniste, inne neurony pobudzające (oznaczone jako neurony pobudzające) i neurony hamujące10. Zidentyfikowane klastry nieneuronalne składały się głównie z typów komórek glejowych (11,1%), w tym astrocytów, oligodendrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), komórek odpornościowych (3,3%) i komórek Cajal-Retzius (0,6%). Podczas wykonywania FANS w celu wykluczenia populacji NeuN dodatnich (próbka posortowana przez NeuN-ujemne FACS; Rysunek 2F,G,H), dominowały skupiska komórek glejowych (81,3%). Izolacja większej liczby jąder glejowych pozwala na lepszą segmentację różnych populacji, które skupiałyby się razem bez FANS. Rzeczywiście, po ponownym grupowaniu i analizie określonych genów ulegających ekspresji w NSC lub w astrocytach, oddzieliły się cztery podklastry (rysunek uzupełniający 2A, B). Przyglądając się bardziej specyficznym markerom komórkowym i oceniając poziomy ekspresji genów w różnych typach komórek, wykryto niewielkie skupisko NSC segregujące się oddzielnie od głównych populacji astrocytarnych z wyższą ekspresją Hopx i Notch2 i prawie bez ekspresji Aldh1a1 lub Aqp4 (rysunek uzupełniający 2C). Jednak ze względu na nakładanie się ekspresji genów między astrocytami a NSC, konieczna byłaby dalsza analiza w celu specyficznego profilowania i identyfikacji różnych podtypów komórek. Co więcej, NeuN-ujemna próbka FANS miała dodatkowe klastry oznaczone jako komórki naczyniowe (2,3%), które obejmują komórki śródbłonka, perycyty i naczyniowe komórki oponowo-rdzeniowe po porównaniu pod kątem ekspresji markerów specyficznych dla komórki (dane nie pokazane).

Zgodnie ze wskazówkami dla wybranego protokołu do generowania bibliotek do sekwencjonowania, uzyskano wysokiej jakości profile wyrażeń z FANS lub bez niego. W przypadku próbek sekwencjonowanych z prędkością 50 000 odczytów/jądro, wykryto średnio 2 510 genów na jądro dla próbki niesortowanej przez FACS (5 578 transkryptów, Rysunek 2H) i 1 665,5 genów (3 508 transkryptów) dla próbki FANS NeuN-ujemnych, po odfiltrowaniu jąder niskiej jakości (Rysunek 2H,I). Metryki te potwierdzają, że protokół ten generuje wysokiej jakości profilowanie transkryptomiczne pojedynczych jąder, porównywalne z badaniami przy użyciu różnych podejść22,23 i że proces sortowania FACS nie uszkadza jąder dla późniejszej sekwencji snRNA. Warto zauważyć, że różnica w liczbie genów i transkryptów na jądro między dwiema próbkami nie wynika z niższej jakości danych, ale z wysokiego odsetka neuronów w próbce niesortowanej przez FACS (84,9% w porównaniu do 1,7% w próbce FANS NeuN-ujemnej), które mają wyższą aktywność transkrypcyjną (2660 genów/jądro i 6170 transkryptów/jądro w próbce niesortowanej przez FACS) niż średnia aktywność transkrypcyjna wszystkich typów komórek nieneuronalnych (1090 genów/jądro i 1785 transkrypty/jądro, Rysunek 2I).

Razem, te reprezentatywne wyniki pokazują, że selekcja neu-ujemnych jąder NeuN za pomocą FANS jest potężnym narzędziem do izolowania typów komórek o niskiej obfitości ze świeżo wypreparowanej tkanki mózgowej i wykonywania wysokiej jakości profilowania transkryptomicznego pojedynczych jąder tych odrębnych populacji komórek za pomocą metod sekwencyjnych snRNA.

Rysunek uzupełniający 1: Walidacja barwienia immunologicznego dla FANS. Zawiesinę jąder inkubowano (A) bez przeciwciała anty-NeuN-AF 488 jako kontroli ujemnej lub (B) z przeciwciałem i przepuszczano przez sorter FACS w celu walidacji warunków barwienia immunologicznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Analiza ekspresji genów i ponowne grupowanie gromady astrocytów. (A) Wykres UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) przedstawiający grupowanie 4968 jąder w oparciu o profile ekspresji całego genomu z Rysunek 2F. Wywołania typu komórkowego zostały wykonane na podstawie znaczników typu komórki. (B) Klaster astrocytów składający się z 2579 jąder wybranych z (A) w celu dalszego podzbioru w celu zbadania potencjalnych podtypów komórkowych. Cztery podtypy zostały wykryte przez grupowanie Seurat (0-3), pokazane różnymi kolorami. (C) Poziomy ekspresji genów specyficznych markerów komórkowych w czterech typach komórek. Wszystkie działki uzyskano przy użyciu pakietu Seurat R24. Krótko mówiąc, liczby sekwencji RNA zostały znormalizowane dla każdej komórki przez całkowitą ekspresję i pomnożone przez współczynnik skali (10 000). Wynik ten został następnie przekształcony w logarytm. Przekształcone wartości zostały przeskalowane (wariancja przeskalowana do jednego) i wyśrodkowana (średnia ustawiona na zero) w każdej komórce przed zastosowaniem UMAP do obliczenia osadzeń, które zostały użyte jako wartości na osiach x i y. Wykresy reprezentują wynik techniki redukcji wymiarów na wykresie punktowym 2D, gdzie każdy punkt reprezentuje komórkę o odpowiednich współrzędnych x i y na podstawie osadzeń komórek określonych przez technikę redukcji. Komórki o podobnych sygnaturach genów są umieszczane blisko siebie przez osadzania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Analiza ekspresji genu NeuN w linii neurogennej. (A) Wykres UMAP przedstawiający grupowanie linii neurogennej z publicznie dostępnego zestawu danych15. Moduły UMAP zostały wygenerowane tak, jak na rysunku uzupełniającym 2. (B) Poziomy ekspresji genów specyficznych markerów komórkowych w całej linii neurogennej pokazujące astrocyty (akwaporyna 4 = Aqp4), NSC (białko tylko homeodomena = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC i pośrednie komórki progenitorowe [IPC]) i komórki cykliczne (kinaza zależna od cykliny 6 = Cdk6). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Składy pożywek i użytych w badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby pomyślnie wykonać ten protokół, rozbiór DG jest pierwszym krytycznym krokiem, który wymaga pewnej praktyki, aby utrzymać go w stanie nieuszkodzonym i ograniczyć zanieczyszczenie otaczającymi tkankami. Z doświadczenia wynika, że oddzielenie DG od hipokampa może być bardzo szybko nabyte przez wykwalifikowanego badacza, który może następnie pracować nad udoskonaleniem swojej techniki w celu zwiększenia szybkości sekcji, a tym samym poprawy świeżości tkanki w celu uzyskania wysokiej jakości danych. W podobnym duchu, przygotowanie i ponowne zawieszenie pojedynczych jąder wymaga spójności w różnych warunkach użytych w jednym eksperymencie, ale także unikania nadmiernego pipetowania, które mogłoby zakłócić błonę jądrową uwalniającą otaczające RNA, co zniekształci wyniki sekwencjonowania. Oprócz wspomnianych wcześniej zaleceń dotyczących przygotowania jąder o wysokiej jakości, przed przystąpieniem do sekwencjonowania należy również wziąć pod uwagę stężenie zawiesiny pojedynczych jąder. Rzeczywiście, zgodnie z wytycznymi producenta, preparat o stężeniu wyższym niż 1200 nuc/μl powinien być rozcieńczony, ponieważ taki poziom stężenia jąder będzie wiązał się z większym ryzykiem powstania multipletów wpływających na dalsze analizy bioinformatyczne. Warto zauważyć, że sekwencjonowanie próbek o stężeniach jąder poniżej 500 nuc/μl może nie być opłacalne ze względu na związane z tym koszty. Zaleca się również postępowanie zgodnie z zaleceniami zaawansowanego użytkownika FACS w celu skonfigurowania wszystkich bramkowania i zachowania spójności z ustawieniami dla próbek i kontrprób biologicznych. Podobnie, przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania RNA wiąże się z pewnym szkoleniem w celu osiągnięcia wysokiej jakości wyników, a większość dostawców ma doskonałe wsparcie, aby skutecznie to osiągnąć. W tym badaniu metoda ta została przetestowana tylko na świeżej tkance; jednak FANS przeprowadzono również z zamrożoną tkanką25. Uzasadnione jest zatem założenie, że protokół ten można wykonać z zamrożoną tkanką, aczkolwiek z niewielką optymalizacją.

Protokół ten został opracowany z myślą o szczególnym zastosowaniu końcowym, jakim jest badanie populacji komórek innych niż neurony w niszy neurogennej hipokampa. Rzeczywiście, coraz więcej dowodów wskazuje, że upośledzenie AHN w procesie starzenia się można przypisać otaczającym komórkom w niszy 1,2,3,9. W szczególności astrocyty i oligodendrocyty stają się kluczowymi regulatorami AHN; jednak ich izolacja od DG w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA przyniosła mieszane wyniki, co sprawia, że hipoteza ta jest trudna do oceny za pomocą tej techniki 1,17. To podejście polegające na sortowaniu jąder NeuN-ujemnych przez FACS pozwoliło na wyizolowanie większej liczby astrocytów i oligodendrocytów w porównaniu z próbkami, które nie były sortowane metodą FACS, co umożliwia lepszą analizę bioinformatyczną. Protokół ten ma zastosowanie we wszystkich grupach wiekowych przez całe życie, a przedstawione tutaj reprezentatywne dane dotyczące tkanek starych zwierząt dostarczają dowodu na to, że metoda ta jest solidna w badaniu starzejącej się niszy neurogennej hipokampa. Aby rozszerzyć zastosowanie tej metody i dostosować ją do różnych zagadnień biologicznych, ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że inne antygeny błony jądrowej neuronów mogą być testowane razem z dokładnym miareczkowaniem najlepiej zwalidowanych przeciwciał dla tych markerów. Na przykład, podczas badania procesu różnicowania neuronów od NSC w DG, niektóre typy komórek, takie jak komórki typu 2 lub neuroblasty, zaczynają wyrażać NeuN (rysunek uzupełniający 3). Dlatego potrzebny byłby inny antygen do szczegółowego zbadania tych typów komórek. I odwrotnie, niektóre neurony zostały nadal zidentyfikowane w tym badaniu po sortowaniu NeuN-ujemnym FACS, prawdopodobnie z powodu niskiej lub zerowej ekspresji NeuN w tych populacjach (np. Korowe neurony Cajal-Retzius19). Ponadto donoszono, że NeuN ulega ekspresji w subpopulacjach oligodendrocytów26, co może dawać stronnicze wyniki, jeśli te subpopulacje są interesujące. W związku z tym wybór antygenu przed rozpoczęciem stosowania FANS powinien być starannie przemyślany, aby uniknąć włączenia lub wykluczenia populacji komórek, które uniemożliwiałyby dokładną odpowiedź na określone pytanie biologiczne. W związku z tym zaleca się również, aby każdy wynik sekwencjonowania był dalej walidowany za pomocą testów ortogonalnych (np. immunohistochemii lub zakresu RNA) przed walidacją lub obaleniem testowanej hipotezy za pomocą tego protokołu. Wreszcie, etap z udziałem FANS może być dalej rozwijany, aby objąć więcej niż jedno przeciwciało z bardziej rozbudowaną strategią sortowania w celu wykluczenia i/lub uwzględnienia pożądanych populacji komórek.

Ostatecznie technologie opisane w tym protokole mogą mieć pewne ograniczenia, gdy są stosowane w odniesieniu do innych gatunków. Na przykład nisza jest bardzo dobrze zdefiniowana u gryzoni z obecnością proliferacyjnych i spoczynkowych NSC lub nowo narodzonych neuronów ograniczonych w określonych podregionach DG, ale nadal nie jest jasne, w jaki sposób nisza neurogenna hipokampa powinna być wyznaczona u innych gatunków. Rzeczywiście, komórki proliferacyjne nie są ustawione w ciągłej strefie DG u naczelnych i ludzi, ale są raczej rozproszone wokół niej i mogą być również obecne w ciele migdałowatym7. W związku z tym wnikliwa analiza i izolacja obszarów szerszych niż w przypadku DG w przypadku innych gatunków potencjalnie wpłynęłaby na stosowanie tego protokołu. W szczególności etapy dysocjacji i rozcierania w celu przygotowania tkanki będą musiały zostać zoptymalizowane podczas pracy z większymi fragmentami tkanki27,28. Jeśli chodzi o analizę bioinformatyczną, podczas gdy gryzonie trzymane w chowu wsobnym mają bardzo jednorodny i bardzo dobrze opisany genom, zmienność genetyczna ludzkiego genomu w połączeniu z niewystarczającą liczbą markerów komórkowych do wyraźnego rozróżnienia różnych populacji komórek (np. NSC i astrocytów) wymaga dużej normalizacji analizy, która może prowadzić do różnych wniosków w przypadku zidentyfikowania małego skupiska komórek7. Rozdział 11. W takich sytuacjach wzbogacanie komórek może być nadal preferowaną opcją lub powinno być stosowane wraz z innymi strategiami w celu zwiększenia mocy analitycznej.

Niemniej jednak obecne podejście może umożliwić zbadanie roli niedostatecznie zbadanych, choć potencjalnie ważnych populacji komórek w regulacji AHN. Może to być szczególnie widoczne w przypadku populacji astrocytów, które odgrywają kluczową rolę w powstawaniu i progresji chorób neurodegeneracyjnych29,30. Badanie to wykazało, że astrocyty i inne rzadkie populacje komórek można zidentyfikować i sprofilować po prostu wykluczając zdecydowaną większość neuronów obecnych w DG. Inne badania wykorzystujące różne podejścia nie były w stanie osiągnąć podobnego odzyskiwania jąder z tego samego zakresu populacji komórek 5,11,17. Co więcej, wyniki tego badania pokazują, że przy użyciu tego podejścia możliwe jest wyizolowanie klastra NSC bez specyficznego wzbogacania tej populacji komórek15.

Podsumowując, podążanie za tą metodą i ulepszanie jej byłoby krokiem naprzód w kierunku odpowiedzi na nierozstrzygnięte pytania związane z kontekstową rolą niszy neurogennej hipokampa w modulacji AHN. W szczególności może dostarczyć nowych informacji na temat poziomów ekspresji genów w starzejących się i chorych mózgach w populacjach komórek związanych z regulacją AHN9, pomóc w identyfikacji potencjalnej heterogenicznościNSC1 lub zająć się rolą układu naczyniowego w AHN. Ostatecznie metoda ta może zostać zaadaptowana do innych nisz związanych z dorosłymi komórkami macierzystymi, które borykają się z podobnymi pytaniami i problemami.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SG, TL i SK są pracownikami Merck Sharp & Dohme LLC, spółki zależnej Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA, znanej jako MSD poza Stanami Zjednoczonymi i Kanadą. SG jest udziałowcem Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Lachlanowi Harrisowi i Piero Rigo za wsparcie techniczne oraz Jasonowi M. Uslanerowi i Ditte Lovatt za opinie na temat rękopisu. Prace te zostały wsparte grantem z MRC oraz przedkonkurencyjną współpracą badawczą z MSD, Instytutem Francisa Cricka, który otrzymuje finansowanie od Cancer Research UK (FC0010089), UK Medical Research Council (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) oraz przez Wellcome Trust Investigator Award dla FG (106187/Z/14/Z). Przepraszamy wielu autorów, których prac nie mogliśmy omówić i zacytować z powodu braku miejsca.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5ml mikroprobówkaEppendorf30124537
10.00µ m Flouresbrite YG Karboksylan MikrosferyPolysciences15700-10
15 ml polipropylenowe probówki wirówkoweCorning430052
2 pary sterylnych kleszczyków Dumont #5Fine Science Tools11252-30
4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Sigma AldrichD9564-10MG
4150 TapeStation SystemAgilentNie dotyczy
5 ml probówka polipropylenowa z okrągłym dnem i wysoką przejrzystością z zatrzaskiemFalcon352063
ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem z zatrzaskiem352235
50 ml polipropylenowe probówkiCorning430829
70 µ m Filtr siatkowy do komórekFalcon352350
8-szczytowe SPHERO Tęczowe cząstki kalibracyjneBD BiosciencesRCP-30-5A
Koraliki AccudropBD BiosciencesN/A
Wirówka Allegra X-30RBeckman CoulterN/A Przeciwciało
anty-NeuN, klon A60, Alexa Fluor 488 sprzężonyMilliporeMAB377X
  BD FACSAria Cytometr przepływowy fuzyjnyBD BiosciencesN/A
Beckman Coulter MoFlo XDPBeckman CoulterN/A
Kontroler chromu10x GenomicsN/A
Chromium Next GEM Zestawy odczynników jednokomórkowych 3' v3.110x GenomicsPN-1000121; PN-1000120; PN-1000213
BSA 7,5%Gibco15260037
Ditiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0861
Zestaw młynków do chusteczek higienicznych: moździerz, tłuczek luźny (A) i tłuczek ciasny (B)KIMBLED8938-1SET
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1,5mlEppendorf30108116
  Halt, 100x inhibitor proteazyThermoFisher78429
HiSeq 4000 System sekwencjonowaniaIlluminaN/AKonfiguracja sekwencjonowania: 28-8-0-91
KClDowolny dostawcaWykonane
laboratoryjnie LUNA-FX7 Automatyczny licznik komórekLogos BiosystemsN/A
MgCl2Dowolny dostawcaWykonane laboratoryjnie
N° 10 strzeżonych sterylnych jednorazowych skalpeliSwann-Morton6601
Woda bez nukleazSigma AldrichW4502-1L
Para sterylnych studenckich nożyczek chirurgicznychFine Science Tools91401-12
PBSDowolny dostawca
Laboratoryjny inhibitor RNazy 40 U i mikro; l-1AmbionAM2684
RNasin 40 U & mikro; l-1PromegaN211A
Sterylna szalka PetriegoCorning430167
SacharozaSigma Aldrich59378-500G
Bufor Tris, pH 8,0Dowolny dostawcaLaboratoryjnie
wykonany Triton X-100 10% (v/v)Sigma AldrichT8787-250ML
Trypan niebieskiInvitrogenT10282
5 sitkowym Falcon wirówkowe chemikaliów chemikaliów chemiczny chemiczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447(2021).
  2. Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  3. Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
  4. Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
  5. Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
  6. Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
  7. Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
  8. Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
  9. Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548(2020).
  10. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
  11. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  12. Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
  13. Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
  14. Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633(2022).
  15. Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
  16. Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  17. Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
  18. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  19. Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
  20. Guidance on the Operation of ASPA. , Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022).
  21. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543(2009).
  22. Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
  23. Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
  24. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  25. Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405(2021).
  26. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  27. Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
  28. Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17(2009).
  29. Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
  30. Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sortowanie j der aktywowane fluorescencjneurogeneza w hipokampie doros ychneuralne kom rki macierzystezakr t z batysortowanie NeuN ujemneprofilowanie kom rek glejowychcytometria przep ywowaprofilowanie transkrypcyjne

Powiązane artykuły