Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Ciągłe generowanie neuronów hipokampa w wieku dorosłym, znane również jako neurogeneza dorosłego hipokampa (AHN), jest związane z funkcjami poznawczymi, takimi jak uczenie się, nabywanie/oczyszczanie pamięci i separacja wzorców, i wydaje się być ważnym mechanizmem odporności w starzeniu się i chorobach neurodegeneracyjnych, aby zapobiec deficytom poznawczym^1,2,3. Gryzonie były modelem wybieranym do badania AHN przy użyciu kilku metod, w tym immunocytochemii i metod sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Przełożenie tych wyników na inne gatunki pozostaje kontrowersyjne. Rzeczywiście, AHN zaobserwowano u większości gatunków, ale stopień, w jakim utrzymuje się przez całe życie, szczególnie u ludzi^4,5,6,7,8, jest regularnie dyskutowany.

Do tej pory potwierdzono, że różne wewnętrzne i zewnętrzne ścieżki sygnałowe modulują AHN¹. Jednak wpływ komunikacji międzykomórkowej na AHN dopiero się wyłania⁹. Można to przede wszystkim przypisać niewystarczającej specyficzności obecnie znanych markerów komórkowych do przeprowadzenia analizy in vivo na zwierzętach modyfikowanych genetycznie. Rzeczywiście, wiele badań opierało się na markerach, takich jak podwójna kortyna lub kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), które ulegają ekspresji w wielu typach komórek¹. Po drugie, złożoność i wysoki stopień różnorodności komórek w dorosłej niszy hipokampa¹⁰ stwarza wyzwania techniczne związane z profilowaniem każdego typu komórek. Dotyczy to w szczególności analizy bioinformatycznej z nakładającymi się markerami komórkowymi stosowanymi w potokach analitycznych dla różnych populacji, takich jak NSC lub komórki glejowe, co prowadzi do kontrowersyjnych wniosków podczas oceny AHN^7,11. Po trzecie, ogromna liczba neuronów utrudnia badania nad mniej licznymi populacjami komórek, takimi jak astrocyty, oligodendrocyty czy komórki wyściółkowe, mimo że ich rola w precyzyjnej regulacji AHN staje się coraz bardziej widoczna⁹. Łącznie te ograniczenia wpływają na zdolność do przekładania wyników z gryzoni na inne gatunki. Jest to szczególnie wzmocnione przez trudności w rekapitulacji in vitro złożonej tkanki, takiej jak nisza neurogenna hipokampa, oraz przez wiele przeszkód w dostępie do tkanek wysokiej jakości wraz z brakiem znormalizowanych protokołów przetwarzania tkanek w badaniach z udziałem tkanek ludzkich^12,13. Dlatego tak ważne jest opracowanie nowych podejść do profilowania populacji komórek i identyfikacji nowych markerów komórkowych w obrębie zakrętu zębatego (DG), co ostatecznie doprowadzi do lepszego zrozumienia różnych wkładów każdego typu komórek w regulację AHN.

Aby to osiągnąć, izolacja pojedynczych komórek (sc) i pojedynczych jąder (sn) w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA stała się instrumentalna do badania złożonych tkanek, takich jak klasa DG14. W związku z tym strategie wzbogacania komórek w celu wyizolowania pojedynczych komórek z niszy hipokampa dorosłej myszy zostały przeprowadzone głównie w celu zbadania NSCs^15,16. Interesująca strategia wzbogacania komórek nieneuronalnych z DG została zastosowana poprzez sekwencjonowanie podwójnie ujemnych pojedynczych komórek GluR1/Cd24, co spowodowało sekwencjonowanie 1408 komórek bez wyraźnych klastrów między astrocytami a NSC po analizie bioinformatycznej¹⁷. Może to być spowodowane ostrym trawieniem enzymatycznym wymaganym do przygotowania pojedynczej komórki, które uszkadza integralność komórki i RNA. Aby obejść ten problem techniczny, opracowano kilka metod wykorzystujących izolację pojedynczych jąder, które są szczególnie przydatne w skomplikowanych tkankach^11,18. Jednak przewaga neuronów w obrębie DG lub szerzej w układzie hipokampowo-śródwęchowym generuje błąd próbkowania w celu zbadania całości populacji komórek obecnych w tych obszarach mózgu. Ponadto ograniczona liczba komórek do załadowania w celu przygotowania bibliotek pojedynczych komórek podkreśla obecność głównej populacji komórek w analitycznych potokach sekwencjonowanych pojedynczych jąder. Rzeczywiście, duże skupiska neuronów są często opisywane i analizowane, podczas gdy inne populacje komórek są niedostatecznie reprezentowane lub pomijane^5,11.

W próbie przezwyciężenia tych uprzedzeń i umożliwienia profilowania typów komórek innych niż neurony obecne w DG myszy, w tym badaniu opracowano metodę wykorzystującą zasadę sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS)¹⁸, która wyklucza większość populacji neuronów poprzez negatywną selekcję barwionych pojedynczych jąder za pomocą neuronalnego antygenu jądrowego (NeuN, znany również jako Rbfox3). Przy wyborze antygenu kierowała się literaturą opisującą NeuN jako wiarygodny marker neuronalny¹⁹ oraz koniecznością użycia białka jądrowego w tym podejściu. Komórki posortowane przez NeuN-ujemne FACS przygotowano następnie do sekwencjonowania RNA na platformie 10x Genomics. Wyniki pokazują, że wykluczenie komórek wykazujących ekspresję NeuN pozwala na wysokiej jakości profilowanie transkryptomiczne populacji komórek glejowych i rzadkich dla danego typu komórki.

Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Francisa Cricka, a także wytycznymi i przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

Rysunek 1: Przygotowanie zawiesiny pojedynczego jądra z wypreparowanego DG dorosłych myszy do sekwencji snRNA w populacjach nieneuronalnych. Diagram przepływu opisujący główne etapy protokołu, które obejmują rozbiór myszy DG, przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder, barwienie immunologiczne NeuN i sortowanie ujemnych NeuN-FANS przed przystąpieniem do sekwencjonowania snRNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Sekcja DG (czas: 15 min)

1. Przygotować pożywki do izolacji jąder 1 i 2 (NIM1 i NIM2), bufor homogenizacyjny (HB) i pożywkę do przemywania (WM) (tabela uzupełniająca 1). Umieść wszystkie, pożywki, odczynniki i narzędzia na lodzie, aż będą potrzebne. Umieścić homogenizator Dounce (patrz Tabela Materiałów) na lodzie podczas przygotowania (minimum 1 h przed etapem homogenizacji).
   UWAGA: NIM1 można przygotować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. NIM2, HB i WM powinny być świeżo przygotowane.
   UWAGA: Ostrożnie manipuluj DTT, inhibitorem proteazy i Triton X-100. Związki te działają drażniąco na skórę i oczy, są ostro toksyczne i niebezpieczne dla środowiska wodnego. Podczas używania tych chemikaliów należy nosić rękawice ochronne, odzież, ochronę oczu i twarzy, dokładnie umyć ręce po użyciu i unikać uwolnienia do środowiska.
2. Eutanazja 22-miesięcznego samca myszy C57Bl/6J przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z procedurą Home Office Schedule 1²⁰.
   UWAGA: Zobacz dyskusję na temat uzasadnienia użycia 22-miesięcznej myszy w tym badaniu. Jednak protokół ten może być wykonywany w każdym wieku przez cały okres życia.
3. Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji i przenieś go na 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatym 1x PBS (Ryc. 1). Umieść szalkę Petriego na lodzie. Usuń móżdżek za pomocą skalpela i przetnij mózg na pół między obiema półkulami (wzdłuż osi strzałkowej).
4. Napełnij nową 10-centymetrową szalkę Petriego lodowatym PBS i umieść ją na lodzie. Przenieś jedną połowę mózgu na nową szalkę Petriego. Za pomocą lornetki rozłóż DG na czynniki pierwsze i powtórz ten krok, aby uzyskać drugą DG z drugiej połowy mózgu.
   UWAGA: Te kroki (kroki 1.2-1.4) zostały zaadaptowane z wcześniej opisanej procedury²¹. Na tym etapie ważne jest, aby postępować tak szybko, jak to możliwe, aby zachować integralność komórek.
5. Przenieś dwa DG do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce i dodaj 1 ml zimnego HB.

2. Dysocjacja tkanek, izolacja pojedynczych jąder i immunologiczne barwienie anty-NeuN (Czas trwania: 2 godziny)

1. Homogenizować tkankę za pomocą 10 pociągnięć luźnym tłuczkiem "A", a następnie 15 pociągnięć ciasnym tłuczkiem "B".
   UWAGA: Homogenizację odbitą należy przeprowadzać z zaprawą na lodzie delikatnymi pociągnięciami, aby zmniejszyć ciepło spowodowane tarciem i pienieniem. Wszystkie i sprzęt powinny być wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie podczas zabiegu.
2. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 ml; przepłukać homogenizator Dounce 1 ml zimnego HB i połączyć z tą samą probówką. Dodać 3 ml HB do probówki o pojemności 15 ml i inkubować przez 5 minut na lodzie. Wymieszaj 2x, delikatnie odwracając rurkę.
3. Wstępnie zwilż nasadkę sitka o pojemności 70 μm 0,5 ml HB w probówce o pojemności 50 ml. Odcedzić zawiesinę jąder od kroku 2.2, delikatnie przechylając probówkę o pojemności 15 ml do sitka komórkowego. Umyj sitko do komórek 0,5 ml HB.
4. Wyjąć sitko i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, używając wirówki z odchylanym wiadrem. Odrzucić supernatant.
   UWAGA: Odcedzenie homogenatu pomoże zredukować zanieczyszczenia, co ma kluczowe znaczenie dla cytometrii przepływowej i dalszych etapów sekwencjonowania snRNA.
5. Delikatnie zawiesić osad w 4 ml HB za pomocą pipety P1000. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Wirować w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml WM.
6. Wstępnie zwilż nasadkę sitka 35 μm na probówce o pojemności 15 ml z 0,5 ml WM. Odcedź zawiesinę jąder od kroku 2.5 przez sitko do komórek, delikatnie pipetując po 0,5 ml za pomocą pipety P1000.
7. Umyj nakrętkę sitka 0,5 ml WM i umieść probówkę na lodzie. Przenieść filtrat do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 500 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml WM.
8. Wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml WM z mysim przeciwciałem anty-NeuN, przeciwciałem sprzężonym Alexa Fluor 488 (anty-NeuN-AF488, 1:32 000) i 1 μg/ml DAPI. Inkubować przez 45 minut na lodzie w ciemności.
   UWAGA: Aby zoptymalizować barwienie immunologiczne izolowanych jąder, zaleca się miareczkowanie przeciwciała w celu określenia optymalnego rozcieńczenia do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej. Następnie przeprowadź odpowiednie kontrole, aby potwierdzić, że warunki barwienia są optymalne. Na przykład w przypadku sprzężonego przeciwciała anty-NeuN-AF488 przeprowadzono kontrolę negatywną (tj. Brak dodatku przeciwciała, rysunek uzupełniający 1A) i kontrolę pozytywną (tj. barwienie przeciwciałem, rysunek uzupełniający 1B) w celu oceny segregacji populacji niebarwionych i barwionych. Rozpoczynając pracę z przeciwciałem sprzężonym z AF488, zaleca się przeprowadzenie kontroli izotypu sprzężonego z AF488 w celu oceny swoistości. W przypadku stosowania przeciwciała niesprzężonego konieczne może być dodatkowe kontrole, takie jak dodanie przeciwciała drugorzędowego tylko do preparatu jądrowego, w celu oceny niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego.

3. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) w celu wykluczenia populacji neuronalnych (Czas trwania: 45 min)

1. Zawiesinę jąder wybarwionych immunologicznie przenieść do probówki o pojemności 5 ml i trzymać na lodzie do czasu rozpoczęcia procedury cytometrii przepływowej.
   UWAGA: W przypadku pracy z większymi kawałkami tkanki niż dwa myszy DG, może być wymagane dalsze rozcieńczanie buforem WM, aby uniknąć zatkania FACS, jeśli gęstość jąder w roztworze stanie się wysoka.
2. Wirować próbki przez 3 s z małą prędkością przed umieszczeniem probówek w przyrządzie FACS (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: (Konfiguracja FACS) Maszyny sortujące muszą być wyrównane na początku procedury z cząstkami kalibracyjnymi zgodnie z zaleceniami producenta. Opóźnienie kropli zostało skalibrowane za pomocą kulek lub mikrosfer (patrz tabela materiałów) zgodnie z modelem FACS. Próbki sortowano w temperaturze 4 °C w trybie czystości. Aby zmniejszyć objętość zbierania, jądra posortowano przez dyszę o średnicy 70 μm pod ciśnieniem zalecanym dla cytometru przepływowego. Jądra posortowano do 1,5 ml probówek o niskim stopniu wiązania (patrz tabela materiałów) zawierających 50 μl WM. Wszystkie probówki pobrane zostały pokryte PBS + 5% BSA w temperaturze 4 °C przez noc, aby zmniejszyć ryzyko przywierania jąder do ścianek probówki.
3. Aby uzyskać dane z próbki zawiesiny barwionych jąder, ustaw bramki na wysokości DAPI i obszarze DAPI, aby wykluczyć resztki komórek i zagregowane jądra (Rysunek 2A). Ponadto należy oddzielić pojedyncze jądra od wszelkich pozostałych agregatów barwionych DAPI lub szczątków komórkowych, ustawiając bramki w obszarze logarytmu rozproszonego bocznego (SSC) i obszaru logarytmu rozproszenia do przodu (FCS) (Rysunek 2B).
4. Ustaw bramki dla anty-NeuN-AF488 i obszaru FSC, aby wyizolować populację NeuN-AF488-ujemną, jak pokazano na Rysunek 2C.
5. Po analizie, stosując opisaną powyżej strategię bramkowania, posortuj populację NeuN-AF488-ujemną w 1,5 ml probówki zbiorczej wypełnionej 50 μl WM.
   UWAGA: Zgodnie z opisaną powyżej strategią bramkowania i procedurą preparacji w celu wyizolowania DG z mózgu dorosłej myszy, oczekuje się, że populacja NeuN-AF488-ujemna będzie reprezentować ~14% pojedynczych jąder.

Rysunek 2: Izolacja i profilowanie transkryptomiczne populacji komórek nieneuronalnych z DG. (A-C) Strategia bramkowania w celu wyizolowania pojedynczych jąder NeuN-AF488 ujemnych i wykluczenia szczątków komórkowych. (A) Wykres punktowy FANS reprezentatywnej próbki izolowanych jąder, przedstawiający ustawienie bramki dla wyboru jąder DAPI+ i wykluczenie szczątków i agregatów komórkowych. (B) Dalsza selekcja odpowiednich pojedynczych jąder przy użyciu obszaru FSC i obszaru SSC. (C) Bramki dla NeuN-AF488 w celu wykluczenia populacji dodatniej i sortowania dla ujemnych pojedynczych jąder. (D) Mikrofotografia dobrej zawiesiny pojedynczych jąder z minimalną ilością zanieczyszczeń i wyższym udziałem jąder dobrej jakości (okrągły kształt, strzałka) w porównaniu z jądrami złej jakości (biała strzałka). Podziałka = 50 μm, 10 μm (wstawka). (E,F) Analiza danych sekwencyjnych snRNA i profilowanie odrębnych populacji komórek wyizolowanych z DG 22-miesięcznych samców myszy C57BL/6J. Wykresy UMAP (Uniform Multifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) profili pojedynczych jąder z komórek posortowanych bez FACS i (F) NeuN-ujemnych komórek FACS, pokolorowane według typu komórki. (G) Wykresy kołowe porównujące częstość występowania zidentyfikowanych typów komórek w obu próbkach. (H) Odpowiednie wskaźniki dla sekwencjonowanych próbek: liczba jąder, mediana liczby genów i transkrypty na jądro. (I) Wykresy skrzypcowe przedstawiające rozkład liczby genów i transkryptów wykrytych dla każdego typu komórki w obu próbkach. Astr. = astrocyty, Olig. = oligodendrocyty, Vasc. = komórki naczyniowe, CRC = komórki Cajal-Retzius, Neur. = neurony, Imm. = komórki odpornościowe, OPC = komórki prekursorowe oligodendrocytów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder do przeprowadzenia sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (Czas trwania: 30 min)

1. Po sortowaniu dodać 1 ml PBS zawierającego 1% BSA do probówki zbiorczej w celu zebrania kropelek na ściance probówki i wirować z prędkością 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, pozostawiając 50 μl,
   UWAGA: Z odwirowanymi jądrami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ może być trudno zaobserwować jakiekolwiek osadki na dnie probówki. Użycie wirówki z odchylanym wiadrem pomoże usunąć supernatant bez zakłócania osadu.
2. Delikatnie pipetować, aby ponownie zawiesić odwirowane jądra. Dodać 5 μl zawiesiny jąder do 5 μl błękitu trypanowego w mikroprobówce o pojemności 0,5 ml.
   UWAGA: Z błękitem trypanowym należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest on niebezpieczny dla zdrowia, może powodować raka i podejrzewa się, że działa szkodliwie na płodność lub nienarodzone dziecko. Nosić rękawice ochronne, odzież oraz ochronę oczu i twarzy. Nie dotykaj, dopóki wszystkie środki ostrożności nie zostaną przeczytane i zrozumiane.
3. Zmierzyć stężenie i ocenić żywotność zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Wykonaj przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie jąder zgodnie z opisem w kroku 5.
   UWAGA: Próbki, które zostały uznane za dobrej jakości do sekwencjonowania, wykazały pod mikroskopem okrągły i regularny kształt jąder bez resztek komórek (Rysunek 2D). Obecność halo wokół błony jądrowej lub agregacja wielu jąder razem są oznakami uszkodzonych jąder i takie zawiesiny komórek nie powinny być brane pod uwagę przy sekwencjonowaniu snRNA (Rysunek 2D). Zmierzone stężenie jąder mieściło się w zakresie 300-700 jąder/μl.

5. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek

UWAGA: Opis poniższych kroków jest oparty na wewnętrznej platformie sekwencjonowania użytej w tym badaniu (patrz Tabela Materiałów). Dlatego niektóre ustawienia mogą się różnić w przypadku korzystania z innej platformy. Tutaj opisane są tylko kluczowe kroki, a każdy parametr należy określić zgodnie ze wskazówkami i protokołami wybranego producenta, aczkolwiek z optymalizacją przed pierwszym użyciem. Bardzo ważne jest, aby przygotowanie bibliotek odbyło się tak szybko, jak to możliwe po zagęszczeniu posortowanych zawiesin jąder, aby uniknąć degradacji RNA i zapewnić optymalną jakość sekwencjonowania.

1. Załaduj od 7 000 do 10 000 jąder do mikroprzepływowego układu jednokomórkowego.
2. Jądra załadowane należy podzielić na nanolitrowe kropelki za pomocą dostarczonego sterownika i odczynników od wybranego dostawcy. Lizuj jądra w każdej kropli i dokonuj odwrotnej transkrypcji RNA.
   UWAGA: W kropelce wszystkie powstałe cDNA miały ten sam kod kreskowy komórki.
3. Przygotuj biblioteki do sekwencjonowania snRNA-seq zgodnie z wytycznymi wybranego dostawcy i zapewniając kompatybilność z platformą sekwencjonowania. Sprawdź jakość i stężenie bibliotek końcowych za pomocą elektroforezy, fluorometrii lub metod opartych na qPCR i, jeśli ma to zastosowanie, połącz je równo przed sekwencjonowaniem.
4. Denaturyzacja łączy biblioteki ekspresji genów 3 ʹ i rozcieńcza zgodnie z zaleceniami producenta.
5. Wykonuj sekwencjonowanie z parowanym, pojedynczym lub podwójnym indeksowaniem na platformie sekwencjonowania nowej generacji z głębokością sekwencjonowania 50 000 par odczytu na komórkę.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę przygotowania zawiesiny pojedynczych jąder nieneuronalnych wyizolowanych z DG w celu przeprowadzenia sekwencji snRNA. Z wentylatorami lub bez, grupowanie bioinformatyczne ujawniło dobrze oddzielone grupy jąder odpowiadające znanym typom komórek w DG (Rysunek 2E,F). W próbce niesortowanej przez FACS większość wysokiej jakości jąder, które zostały zsekwencjonowane, składała się z trzech grup neuronów (84,9% wszystkich jąder dla tej próbki, Rysunek 2E,G,H). Takie wyniki są oczekiwane, biorąc pod uwagę, że najbardziej reprezentowanymi populacjami komórek w DG są neurony ziarniste, inne neurony pobudzające (oznaczone jako neurony pobudzające) i neurony hamujące10. Zidentyfikowane klastry nieneuronalne składały się głównie z typów komórek glejowych (11,1%), w tym astrocytów, oligodendrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), komórek odpornościowych (3,3%) i komórek Cajal-Retzius (0,6%). Podczas wykonywania FANS w celu wykluczenia populacji NeuN dodatnich (próbka posortowana przez NeuN-ujemne FACS; Rysunek 2F,G,H), dominowały skupiska komórek glejowych (81,3%). Izolacja większej liczby jąder glejowych pozwala na lepszą segmentację różnych populacji, które skupiałyby się razem bez FANS. Rzeczywiście, po ponownym grupowaniu i analizie określonych genów ulegających ekspresji w NSC lub w astrocytach, oddzieliły się cztery podklastry (rysunek uzupełniający 2A, B). Przyglądając się bardziej specyficznym markerom komórkowym i oceniając poziomy ekspresji genów w różnych typach komórek, wykryto niewielkie skupisko NSC segregujące się oddzielnie od głównych populacji astrocytarnych z wyższą ekspresją Hopx i Notch2 i prawie bez ekspresji Aldh1a1 lub Aqp4 (rysunek uzupełniający 2C). Jednak ze względu na nakładanie się ekspresji genów między astrocytami a NSC, konieczna byłaby dalsza analiza w celu specyficznego profilowania i identyfikacji różnych podtypów komórek. Co więcej, NeuN-ujemna próbka FANS miała dodatkowe klastry oznaczone jako komórki naczyniowe (2,3%), które obejmują komórki śródbłonka, perycyty i naczyniowe komórki oponowo-rdzeniowe po porównaniu pod kątem ekspresji markerów specyficznych dla komórki (dane nie pokazane).

Zgodnie ze wskazówkami dla wybranego protokołu do generowania bibliotek do sekwencjonowania, uzyskano wysokiej jakości profile wyrażeń z FANS lub bez niego. W przypadku próbek sekwencjonowanych z prędkością 50 000 odczytów/jądro, wykryto średnio 2 510 genów na jądro dla próbki niesortowanej przez FACS (5 578 transkryptów, Rysunek 2H) i 1 665,5 genów (3 508 transkryptów) dla próbki FANS NeuN-ujemnych, po odfiltrowaniu jąder niskiej jakości (Rysunek 2H,I). Metryki te potwierdzają, że protokół ten generuje wysokiej jakości profilowanie transkryptomiczne pojedynczych jąder, porównywalne z badaniami przy użyciu różnych podejść22,23 i że proces sortowania FACS nie uszkadza jąder dla późniejszej sekwencji snRNA. Warto zauważyć, że różnica w liczbie genów i transkryptów na jądro między dwiema próbkami nie wynika z niższej jakości danych, ale z wysokiego odsetka neuronów w próbce niesortowanej przez FACS (84,9% w porównaniu do 1,7% w próbce FANS NeuN-ujemnej), które mają wyższą aktywność transkrypcyjną (2660 genów/jądro i 6170 transkryptów/jądro w próbce niesortowanej przez FACS) niż średnia aktywność transkrypcyjna wszystkich typów komórek nieneuronalnych (1090 genów/jądro i 1785 transkrypty/jądro, Rysunek 2I).

Razem, te reprezentatywne wyniki pokazują, że selekcja neu-ujemnych jąder NeuN za pomocą FANS jest potężnym narzędziem do izolowania typów komórek o niskiej obfitości ze świeżo wypreparowanej tkanki mózgowej i wykonywania wysokiej jakości profilowania transkryptomicznego pojedynczych jąder tych odrębnych populacji komórek za pomocą metod sekwencyjnych snRNA.

Rysunek uzupełniający 1: Walidacja barwienia immunologicznego dla FANS. Zawiesinę jąder inkubowano (A) bez przeciwciała anty-NeuN-AF 488 jako kontroli ujemnej lub (B) z przeciwciałem i przepuszczano przez sorter FACS w celu walidacji warunków barwienia immunologicznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Analiza ekspresji genów i ponowne grupowanie gromady astrocytów. (A) Wykres UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) przedstawiający grupowanie 4968 jąder w oparciu o profile ekspresji całego genomu z Rysunek 2F. Wywołania typu komórkowego zostały wykonane na podstawie znaczników typu komórki. (B) Klaster astrocytów składający się z 2579 jąder wybranych z (A) w celu dalszego podzbioru w celu zbadania potencjalnych podtypów komórkowych. Cztery podtypy zostały wykryte przez grupowanie Seurat (0-3), pokazane różnymi kolorami. (C) Poziomy ekspresji genów specyficznych markerów komórkowych w czterech typach komórek. Wszystkie działki uzyskano przy użyciu pakietu Seurat R24. Krótko mówiąc, liczby sekwencji RNA zostały znormalizowane dla każdej komórki przez całkowitą ekspresję i pomnożone przez współczynnik skali (10 000). Wynik ten został następnie przekształcony w logarytm. Przekształcone wartości zostały przeskalowane (wariancja przeskalowana do jednego) i wyśrodkowana (średnia ustawiona na zero) w każdej komórce przed zastosowaniem UMAP do obliczenia osadzeń, które zostały użyte jako wartości na osiach x i y. Wykresy reprezentują wynik techniki redukcji wymiarów na wykresie punktowym 2D, gdzie każdy punkt reprezentuje komórkę o odpowiednich współrzędnych x i y na podstawie osadzeń komórek określonych przez technikę redukcji. Komórki o podobnych sygnaturach genów są umieszczane blisko siebie przez osadzania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Analiza ekspresji genu NeuN w linii neurogennej. (A) Wykres UMAP przedstawiający grupowanie linii neurogennej z publicznie dostępnego zestawu danych15. Moduły UMAP zostały wygenerowane tak, jak na rysunku uzupełniającym 2. (B) Poziomy ekspresji genów specyficznych markerów komórkowych w całej linii neurogennej pokazujące astrocyty (akwaporyna 4 = Aqp4), NSC (białko tylko homeodomena = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC i pośrednie komórki progenitorowe [IPC]) i komórki cykliczne (kinaza zależna od cykliny 6 = Cdk6). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Składy pożywek i użytych w badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

SG, TL i SK są pracownikami Merck Sharp & Dohme LLC, spółki zależnej Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA, znanej jako MSD poza Stanami Zjednoczonymi i Kanadą. SG jest udziałowcem Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.