Method Article

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bez wątpienia, mikroskopia sił atomowych (AFM) jest obecnie jedną z najpotężniejszych i najbardziej użytecznych technik oceny mikro, a nawet nano-wskazówek w dziedzinie biologii. Jednak, podobnie jak w przypadku każdego innego podejścia mikroskopowego, mogą pojawić się wyzwania metodologiczne. W szczególności charakterystyka próbki, przygotowanie próbki, rodzaj przyrządu i sondy do wgłębień mogą prowadzić do niepożądanych artefaktów. W tym protokole ilustrujemy te pojawiające się problemy dotyczące zdrowych, a także eksplantatów chrząstki stawowej z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym celu najpierw pokazujemy krok po kroku, jak generować, klasyfikować i wizualnie klasyfikować krążki chrząstki stawowej ex vivo według różnych etapów zwyrodnienia za pomocą dużego obrazowania fluorescencyjnego 2D mozaiki eksplantatów całej tkanki. Główną zaletą modelu ex vivo jest to, że składa się on ze starej, rodzimej ludzkiej chrząstki, która umożliwia badanie zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów od wczesnego początku do progresji. Ponadto przedstawiono również typowe pułapki związane z przygotowaniem tkanek, a także samą procedurę AFM wraz z późniejszą analizą danych. Pokazujemy, jak podstawowe, ale kluczowe kroki, takie jak przygotowanie i przetwarzanie próbki, charakterystyka topograficzna próbki spowodowana zaawansowaną degeneracją oraz interakcja między próbką a końcówką, mogą wpłynąć na pozyskiwanie danych. Poddajemy również analizie najczęstsze problemy w AFM i opisujemy, w miarę możliwości, jak je przezwyciężyć. Wiedza o tych ograniczeniach ma ogromne znaczenie dla prawidłowego pozyskiwania, interpretacji i ostatecznie osadzenia wyników w szerokim kontekście naukowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na stale zmniejszający się rozmiar urządzeń i systemów elektronicznych, szybki rozwój technologii i sprzętu opartego na mikro- i nano nabrał rozpędu. Jednym z takich urządzeń jest mikroskopia sił atomowych (AFM), która może skanować powierzchnie biologiczne i pobierać informacje topograficzne lub biomechaniczne zarówno w skali nano-, jak i mikrometrowej1,2. Wśród jego licznych funkcji, narzędzie to może być używane zarówno jako mikro-, jak i nano-wgłębnik w celu uzyskania informacji o właściwościach mechanicznych różnych systemów biologicznych3,4,5,6. Dane są zbierane przez fizyczny kontakt z powierzchnią za pomocą sondy mechanicznej, która może mieć nawet około 1 nm na końcu7. Wynikowe odkształcenie próbki jest następnie wyświetlane w oparciu o głębokość wcięcia końcówki wspornika i siłę przyłożoną do próbki8.

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest długotrwałą chorobą zwyrodnieniową charakteryzującą się pogorszeniem stanu chrząstki stawowej w stawach i otaczających tkankach, co może prowadzić do całkowitego odsłonięcia powierzchni kości. Obciążenie związane z otwartym dostępem jest znaczne; Obecnie połowa wszystkich kobiet i jedna trzecia wszystkich mężczyzn w wieku 65 lat i więcej cierpi na OA9. Urazy, otyłość i wynikająca z nich zmieniona biomechanika stawu10 determinują zwyrodnienie chrząstki stawowej, które jest postrzegane jako powszechny efekt końcowy. Pionierskie badanie Ganza i wsp. zakładało, że wczesne etapy procesu OA mogą obejmować właściwości biomechaniczne chrząstki11, i od tego czasu naukowcy potwierdzili tę hipotezę12. Podobnie, ogólnie przyjmuje się, że właściwości biomechaniczne tkanki są funkcjonalnie koordynowane przez organizację ultrastrukturalną, a także przesłuchy komórka-komórka i komórka-macierz. Wszelkie zmiany mogą mieć dramatyczny wpływ na ogólne funkcjonowanie biomechaniczne tkanki13. Do tej pory rozpoznanie choroby zwyrodnieniowej stawów ma charakter kliniczny i opiera się na zwykłej radiografii filmowej14. Podejście to jest dwustronne: po pierwsze, brak zdefiniowanego progu odcięcia zwyrodnieniowego dla sformułowania diagnozy choroby zwyrodnieniowej stawów utrudnia określenie ilościowe choroby, a po drugie, metody obrazowania nie są czułe i standaryzowane oraz nie są w stanie wykryć zlokalizowanego uszkodzenia chrząstki15,16,17. W tym celu ocena właściwości mechanicznych chrząstki ma tę decydującą zaletę, że opisuje parametr, który zmienia się w przebiegu choroby zwyrodnieniowej stawów niezależnie od etiologii choroby i ma bezpośredni wpływ na funkcjonalność tkanek na bardzo wczesnym etapie. Przyrządy do wgłębień mierzą siłę, z jaką tkanka opiera się wgłębieniu. W rzeczywistości nie jest to nowa koncepcja; Najwcześniejsze badania pochodzą z lat 80. i 90. W tym okresie liczne badania sugerowały, że przyrządy do wgłębień przeznaczone do artroskopowych pomiarów chrząstki stawowej mogą być dobrze przystosowane do wykrywania zmian zwyrodnieniowych chrząstki. Jeszcze 30 lat temu niektóre badania były w stanie wykazać, że przyrządy do wgłębień były w stanie wykryć in vivo zmiany na powierzchni chrząstki podczas zwyrodnienia tkanki, przeprowadzając pomiary sztywności ściskającej podczas artroskopii18,19,20.

AFT, WCIĘCIE (AFM-IT) w chrząstce stawowej dostarcza informacji o kluczowej właściwości mechanicznej tkanki, a mianowicie sztywności. Jest to parametr mechaniczny, który opisuje zależność między przyłożonym, nieniszczącym obciążeniem a wynikowym odkształceniem obszaru tkanki z wcięciem 21. Wykazano, że AFM-IT jest w stanie określić ilościowo zależne od wieku modyfikacje sztywności w makroskopowo niedotkniętych sieciach kolagenowych, różnicując w ten sposób zmiany patologiczne związane z początkiem choroby zwyrodnieniowej stawów (stopień 0 w skali Outerbridge w chrząstce stawowej)22. Wcześniej wykazaliśmy, że AFM-ITs, na podstawie przestrzennej organizacji chondrocytów jako opartego na obrazie biomarkera wczesnej degeneracji chrząstki, pozwalają nie tylko na ilościowe określenie, ale także na faktyczne wskazanie najwcześniejszych zwyrodnieniowych zmian mechanicznych. Wyniki te zostały już potwierdzone przez innych23,24. W związku z tym AFM-IT pełni rolę interesującego narzędzia do diagnozowania i identyfikowania wczesnych zmian zwyrodnieniowych. Zmiany te można już zmierzyć na poziomie komórkowym, co pozwala lepiej zrozumieć proces patofizjologiczny choroby zwyrodnieniowej stawów.

W tym protokole demonstrujemy kompletną procedurę histologicznej i biomechanicznej oceny eksplantatów chrząstki stawowej, od przygotowania rodzimej chrząstki do pozyskiwania i przetwarzania danych AFM. Poprzez podejście krok po kroku pokazujemy, jak generować, klasyfikować i wizualnie klasyfikować tkankę chrząstki stawowej według różnych etapów zwyrodnienia za pomocą obrazowania 2D dużej mozaiki, a następnie wgłębień mikro-AFM.

Mimo że obecnie AFM-IT jest jednym z najbardziej czułych narzędzi do pomiaru zmian biomechanicznych w chrząstce7, jak każda inna technika instrumentalna, ma ograniczenia i praktyczne osobliwości25, które mogą prowadzić do błędnego pozyskiwania danych. W tym celu poddajemy analizie najczęstsze problemy, które pojawiają się podczas pomiarów AFM eksplantatów chrząstki i opisujemy, w miarę możliwości, jak je zminimalizować lub przezwyciężyć. Obejmują one topograficzne aspekty próbek i trudności w ich stabilizacji w środowisku zgodnym z AFM, fizyczne osobliwości powierzchni tkanki i wynikające z tego trudności w wykonywaniu pomiarów AFM na takich powierzchniach. Przedstawiono również przykłady błędnych krzywych siła-odległość, podkreślając warunki, które mogą je powodować. Omówiono również dodatkowe ograniczenia związane z geometrią końcówki wspornika i wykorzystaniem modelu Hertza do analizy danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kłykcie udowe pobrane od pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego w Szpitalu Uniwersyteckim w Tybindze, Niemcy, zostały użyte. Do badania włączono wyłącznie próbki chrząstki stawowej od pacjentów z patologiami zwyrodnieniowymi i pourazowymi stawów. Zgoda wydziałowej, instytucjonalnej, a także lokalnej komisji etycznej została uzyskana przed rozpoczęciem badania (Projekt nr 674/2016BO2). Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.

UWAGA: Schemat blokowy etapów eksperymentu w ich chronologicznej kolejności jest podany w Rysunek 1.

1. Przetwarzanie tkanek i wytwarzanie krążków chrzęstnych

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Po resekcji pooperacyjnej próbki chrząstki należy umieścić w pojemniku wypełnionym zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 5% (v/v) penicyliny-streptomycyny. Upewnij się, że próbki są całkowicie zanurzone w podłożu. Czas między resekcją chirurgiczną a dalszym przetwarzaniem chrząstki nie powinien przekraczać 24 godzin. Upewnij się, że podczas całego procesu próbka jest całkowicie zanurzona w pożywce, aby uniknąć wysuszenia próbki.
    2. Odetnij chrząstkę od kości za pomocą skalpela.
  2. Generowanie krążków chrzęstnych
    1. Wygeneruj krążki chrząstki o średnicy 4 mm za pomocą stempla do biopsji.
      UWAGA: Ważne jest, aby wybrać i wyciąć obszary kłykcia, w których grubość warstwy chrząstki przekracza 1 mm. Może to być problematyczne, zwłaszcza w okolicach stref nośnych, gdzie warstwa chrząstki zazwyczaj traci swoją grubość w wyniku procesów zużycia lub zwyrodnienia.
    2. Umieść wcześniej wygenerowane krążki chrząstki o średnicy 4 mm na specjalnie zaprojektowanym urządzeniu tnącym i stabilnie zamocuj i przytrzymaj krążki chrząstki za pomocą szpatułki. Podczas umieszczania krążków chrząstki na urządzeniu tnącym należy zachować ostrożność. Próbki należy umieścić w taki sposób, aby najwyższa warstwa chrząstki (strefa powierzchowna chrząstki stawowej) nie była skierowana w stronę ostrza
    3. Przetnij krążki chrząstki żyletką. W ten sposób powstają próbki chrząstki w kształcie dysku o wymiarach 4 mm x 1 mm. Aby zapobiec wysuszeniu próbki, należy jak najszybciej wykonać cięcie tkanki.
    4. Zebrać każdy krążek za pomocą szpatułki i umieścić wytworzone krążki chrząstki w probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml DMEM uzupełnionego 5% (v/v) penicyliny-streptomycyny. Umieść około 15 krążków w jednej tubie.
  3. Kriotomiczne cięcie krążków chrząstki (dla plastrów prostopadłych)
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i można go zastosować, jeśli pożądana jest wizualizacja rozkładu wzoru komórkowego w krążkach chrząstki w widoku bocznym. Może być stosowany jako metoda weryfikacji, ponieważ rozkład wzorca komórkowego jest cechą 3D chrząstki stawowej26. Można również zastosować przekrój optyczny i rekonstrukcje 3D całych krążków chrzęstnych za pomocą mikroskopu konfokalnego, eliminując tym samym konieczność cięcia próbek zgodnie z opisem w protokole.
    1. Przykryj krążek chrząstki rozpuszczalnym w wodzie medium do osadzania i umieść go na jego krawędzi na pokrętle kriotomii (z powierzchnią krążka prostopadłą do powierzchni pokrętła). W urządzeniu do kriotomu podłoże zatapiające zamarza w niskich temperaturach.
    2. Za pomocą standardowego kriotomu należy przeciąć tkankę na boki o grubości 60 μm, aż do osiągnięcia środka krążka (tj. gdy kriosekcje osiągną długość 4 mm) i zebrać plastry. Dzieląc eksplantację dysku prostopadle, można uwidocznić wszystkie strefy chrząstki (powierzchowną, środkową i głęboką).
    3. Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym i usunąć rozpuszczalne w wodzie podłoże do zatapiania, przemłukując trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).

2. Sortowanie krążków chrzęstnych jako funkcja komórkowego wzorca przestrzennego

  1. Barwienie próbek chrząstki w kształcie dysku
    1. Umieścić jeden krążek chrząstki (sekcja 1.2) w każdym dołku 96-dołkowej płytki i dodać 130 μl przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego w rozcieńczeniu 1:1,000 do każdego dołka.
    2. Sprawdź wzrokowo całą płytę i upewnij się, że w każdej studzience znajduje się tylko jeden dysk. Inkubować płytkę przez 30 minut w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
  2. Barwienie wycinków chrząstki o grubości 60 μm
    1. Delikatnie umieścić skrawki krążka chrzęstnego (sekcja 1.3) na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą kleszków.
    2. Przykryj skrawki chrząstki podłożem montażowym zawierającym jądrowe barwienie przeciwstawne DAPI i delikatnie umieść szkiełka nakrywkowe, które nadają się do mikroskopii fluorescencyjnej.
    3. Uszczelnij krawędzie każdego szkiełka nakrywkowego zwykłym przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 3 minuty.
  3. Sortowanie i obrazowanie chrząstek z góry i z boku
    UWAGA: Każdy dysk musi być zbadany pod mikroskopem fluorescencyjnym. Celem tego kroku jest posortowanie krążków na podstawie ich dominującego wzorca komórkowego (pojedyncze struny, podwójne struny, małe klastry, duże skupiska lub rozproszone).
    1. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki mikroskopu fluorescencyjnego.
    2. Wybrać odpowiedni filtr fluorescencyjny Em 495 nm/Ex 515 nm (do obrazowania krążków chrząstki z góry z góry przygotowanego w sekcji 2.1.) lub Em 358 nm/Ex 461 nm (do obrazowania z boku skrawków chrząstki przygotowanego w sekcji 2.2) i obiektywu 10x.
      UWAGA: Użycie obiektywu 10x pozwala na zbadanie całego obwodu krążka i wykluczenie próbek z niejednorodnym lub niewłaściwym zabarwieniem. Jednak użycie tylko widoku odgórnego może skutkować percepcją zmian w organizacji komórkowej w wyniku analizy głębszych warstw tkankowych, które stały się widoczne dla obserwacji odgórnej przez powierzchowną erozję. Na przykład rosnący ciąg biegnący wzdłuż arkad kolagenu może być postrzegany jako pojedyncza komórka lub rozproszone komórki (wzór dyfuzyjny)26. W związku z tym obie strony krążków muszą zostać sprawdzone, aby zapewnić prawidłowy wybór wzorca komórkowego.
    3. Określ wizualnie wzór komórkowy wyświetlany w każdym krążku chrząstki. Jest mało prawdopodobne, że dysk będzie miał tylko jeden typ wzorca komórkowego. W przypadku części krążka, w której układ chondrocytów nie pasuje do interesującego wzorca, należy przyjąć próbki tylko wtedy, gdy niepożądany wzór znajduje się na samym obrzeżach, gdzie nie odbywają się pomiary AFM (tj. do 0,5 mm od granicy krążka) i upewnić się, że nie przekracza on 10% całkowitej powierzchni krążka27, 28.
  4. Akwizycja obrazu całych krążków chrzęstnych
    1. Wybierz obiektyw mikroskopu o powiększeniu 10x i umieść go pod wstępnie wybraną studzienką zawierającą pojedynczy krążek chrząstki. Ustaw ostrość na dysku, aby zobaczyć wzór komórkowy.
    2. Wybierz funkcję nawigatora, aby uzyskać przegląd całej studni. Użyj lewego przycisku myszy i przeciągnij, aby przejść do innej pozycji sceny. Za pomocą kółka myszy powiększaj i pomniejszaj.
      UWAGA: W tym momencie podgląd studni z całą próbką można zobaczyć, klikając dwukrotnie kolejno na każdy obszar zainteresowania.
    3. Wybierz kwadrat, który obejmuje obszar zainteresowania do zeskanowania; w tym momencie wszystkie pojedyncze kafelki tworzące mozaikę staną się widoczne.
    4. Dostosuj ekspozycję/intensywność światła, aby komórki były wyraźnie widoczne z tła. W tym momencie jasność/kontrast obrazu został dostosowany dla wszystkich kafelków i nie można go już dostosować indywidualnie dla każdego kafelka.
      UWAGA: Ponieważ komórki w pobliżu krawędzi dysku często emitują wyższy sygnał fluorescencji niż komórki w środku, należy dostosować ustawienia ekspozycji/natężenia światła.
      1. Aby ocenić, czy czas ekspozycji jest odpowiedni dla danego kanału, sprawdź rozkład sygnału na histogramie. Korzystając z mechanizmu automatycznej ekspozycji zawartego w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopu, zwizualizuj wszystkie komórki znajdujące się w dysku.
    5. Wybierz opcję Punkt mapy ostrości oprogramowania, a następnie wybierz każdy kafelek, klikając lewym przyciskiem myszy w jego środku.
    6. Wybierz opcję Mapa ostrości. Zostanie wyświetlone okno ze wszystkimi poprzednio wybranymi kafelkami. Kliknij dwukrotnie kafelek na liście, aby go wyświetlić i ustawić na nim odpowiednią ostrość.
    7. Kliknij przycisk Ustaw Z, aby zapisać plan ogniskowej i przejść do następnego kafelka. Po dostosowaniu planu ogniskowej dla każdego kafelka z osobna rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk Rozpocznij skanowanie.
      1. Jeśli skanowanie wyświetla ciemniejsze poziome i/lub pionowe paski, może to być spowodowane niewłaściwym i nierównomiernym oświetleniem pojedynczych klatek. Rozwiąż ten problem, korzystając z opcji Linked Shading wbudowanej w oprogramowanie przed właściwym skanowaniem.
    8. Zapisuj, eksportuj i poprawnie dodawaj adnotacje do obrazów.

3. Biomechaniczne podejście eksplantatów chrząstki

  1. Przygotowanie próbki do pomiarów AFM
    1. Utrwalić każdy wstępnie wybrany krążek chrząstki zawierający wzór komórkowy (sekcja 2) na szalkach Petriego za pomocą biokompatybilnego kleju. Dodaj wystarczającą ilość kleju do próbki po górnej, dolnej, lewej i prawej stronie dysku.
    2. Przykryj krążki 2,5 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy. Delikatnie nanieś pożywkę Leibowitza na próbki, aby uniknąć oderwania się próbki od powierzchni z powodu fal wytwarzanych przez podłoże.
  2. Ładowanie próbek do AFM
    1. Umieścić szalkę Petriego w uchwycie na próbkę urządzenia AFM i włączyć podgrzewacz szalki Petriego ustawiony na 37 °C. Odczekać, aż szalka do hodowli tkankowej osiągnie żądaną temperaturę. Ma to na celu wykluczenie możliwych artefaktów spowodowanych zmianami temperatury.
  3. Kalibracja wspornika AFM
    1. Zainicjuj konfigurację oprogramowania zgodnie z wcześniejszym opisem Danalache et al.29.
    2. Wybierz odpowiedni uchwyt wspornikowy pustaka szklanego do pomiarów cieczy i ostrożnie umieść go na głowicy AFM. Mechanizm blokujący zabezpiecza pustak szklany w głowicy AFM. Upewnij się, że powierzchnia odbijająca pustak szklanego jest prosta i równoległa do uchwytu AFM.
    3. Ostrożnie umieść wspornik na powierzchni uchwytu wspornika z pustaka szklanego. Sam wspornik powinien spoczywać na wypolerowanej płaszczyźnie optycznej, pośrodku pustaka szklanego.
    4. Ostrożnie umieść silikonową osłonę (membranę silikonową) na podstawie uchwytu wspornika, aby zapobiec kondensacji medium w głowicy AFM.
    5. Opuszczaj wspornik w krokach co 100 μm za pomocą funkcji silnika krokowego, aż zostanie całkowicie zanurzony w medium.
    6. Uruchom podejście skanera z parametrami podejścia opisanymi przez Danalache et al.29. Cofnąć wspornik o 100 μm po osiągnięciu dna szalki Petriego.
    7. Skalibruj wspornik, wykonując dokładnie te same czynności, i uruchom parametry opisane przez Danalache et al.29. Pod koniec kalibracji odchylenie pionowe jest zapisywane i wyświetlane w niutonowych (N) jednostkach siły, a nie w woltach (V) - jednostce pierwotnej rejestracji przez detektor fotodiody. W eksperymentach tutaj po kalibracji uzyskano nastawę 4,47 nN.
    8. Korzystając z funkcji silnika krokowego, cofnij wspornik do 1,000 μm.
  4. Identyfikacja pożądanego miejsca pomiaru chrząstki w AFM
    UWAGA: Ze względu na grubość krążków chrząstki wynoszącą 1 mm, wspornik nie jest widoczny w polu widzenia podczas poruszania się po próbce.
    1. Użyj kamery CCD mikroskopu, aby zidentyfikować wspornik. Wspornik AFM powinien być umieszczony w obszarze płytki Petriego wolnym od próbek.
    2. Rozpocznij podejście skanera z wspornikiem na czystym, wolnym od próbek obszarze szalki Petriego, używając tych samych parametrów opisanych przez Danalache et al.29.
    3. Dalej cofnij wspornik o 1.5 mm od spodu płyty za pomocą sterownika silnika krokowego. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia bezpośredniej kolizji między wspornikiem a próbką.
    4. Przełącz się z widoku jasnego pola na widok fluorescencji i wizualnie zidentyfikuj górną część dysku.
    5. Przesunąć uchwyt na próbkę AFM dokładnie o 2 mm w kierunku środka krążka. Ten punkt jest uważany za środek krążka chrząstki.
    6. Uruchomić podejście skanera i po osiągnięciu powierzchni krążka chrząstki cofnąć wspornik o 100 μm.
  5. Pomiary krzywej siła-odległość
    1. Skoncentruj się na komórkach umieszczonych w żądanym miejscu pomiaru. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pomiary i generowanie krzywych siła-odległość w docelowym położeniu.
    2. Uzyskaj pięć krzywych siła-odległość w każdym miejscu pomiaru. Cofnąć wspornik o 500 μm i przesunąć wspornik do następnego miejsca pomiarowego.
      UWAGA: Wycofanie wspornika jest kluczowym krokiem, ponieważ powierzchnia krążka chrzęstnego nie jest jednorodna i ma nierówności. Wysoki pagórek na powierzchni próbki może spowodować dramatyczne zderzenie, prowadzące do niepożądanego uszkodzenia końcówki wspornika/próbki. Zalecamy wybranie co najmniej pięciu różnych miejsc pomiarowych rozmieszczonych na powierzchni dysku i uzyskanie co najmniej pięciu krzywych siła-odległość w każdym miejscu.
    3. Sprawdź krzywe siła-odległość i zapisz je.
  6. Estymacja modułów Younga za pomocą modelu dopasowania Hertza
    1. Otwórz wygenerowane krzywe siła-odległość do analizy (plik .jpk) w oprogramowaniu do analizy danych za pomocą opcji Otwórz partię krzywych spektroskopowych.
    2. Wybierz model dopasowania Hertz, a następnie wybierz opcję Dopasowanie elastyczne.
      1. Opcja dopasowania sprężystości automatycznie wykonuje następujące obliczenia na wybranej krzywej siła-odległość: oblicza linię bazową i odejmuje od całej krzywej, aby usunąć przesunięcie linii bazowej (linia bazowa jest przywracana do zera na osi y); określa punkt kontaktu, wykrywając punkt, w którym krzywa siła-odległość przecina linię siły zerowej (punkt kontaktu jest ustawiony na zero na osi x); oblicza separację końcówka-próbka (sygnał wysokości piezoelektrycznego uwzględnianie zginania wspornika jest odejmowane); i automatycznie dopasowuje krzywą siła-odległość do wybranego modelu. W razie potrzeby każdy z tych kroków można również wykonać niezależnie.
    3. Dostosuj przy użyciu następujących parametrów dopasowania: współczynnik Poissona 0,5 i odpowiedni promień końcówki wspornika.
      UWAGA: W przypadku stosowania wspornika z kulistą końcówką wspornikową należy użyć modelu Hertz fit. Wspornik zastosowany w tym badaniu miał kulistą końcówkę o promieniu 5 μm. Zalecamy dopasowanie krzywej siła-odległość do momentu osiągnięcia maksymalnej przyłożonej siły (wartości zadanej).
    4. Sprawdź wizualnie dopasowanie krzywej siła-odległość, aby upewnić się, że jest poprawna. Ten krok należy wykonać dla każdej z analizowanych krzywych siła-odległość.
  7. Określanie głębokości wgłębienia
    UWAGA: W zależności od używanego narzędzia do analizy danych proces ten może się różnić. Eksperymentator może łatwo odczytać głębokość wcięcia, wykonując szereg kroków, które są zawarte w programie do analizy danych.
    1. Otwórz każdą z wygenerowanych krzywych siła-odległość w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz model dopasowania Hertza jako proces analizy.
    2. Zastosuj opcję Odejmij odsunięcie linii bazowej, aby wyzerować oś odchylenia w pionie (oś y) i wybierz funkcję Przesunięcie + pochylenie.
    3. Użyj funkcji Znajdź punkt kontaktowy, aby automatycznie zidentyfikować punkt kontaktowy, który jest automatycznie ustawiany na współrzędną x równą zero.
    4. Odejmij odległość, biorąc pod uwagę wyłącznie ugięcie wspornika od surowej wysokości piezoelektrycznego podczas wcięcia, korzystając z funkcji pionowej pozycji końcówki.
    5. Wybierz opcję Dopasowanie sprężystości, aby wyświetlić przetworzoną krzywą siła-odległość, a następnie wybierz obszar wykresu tak, aby pokrywał się z najbardziej ujemną wartością na osi pionowego położenia końcówki (oś x).
    6. Przeczytaj i udokumentuj wcięcie z pola X Min w zakładce parametrów. Zapisz i udokumentuj wyniki.

4. Analiza statystyczna

  1. Otwórz oprogramowanie statystyczne. Wybierz pozycję Nowy zestaw danych z menu rozwijanego.
  2. Otwórz zakładkę Widok zmiennych po wybraniu pliku DataSet. Zdefiniuj zmienne numeryczne dla każdej kategorii wzorca komórkowego: pojedyncze struny = SS, podwójne struny = DS, małe klastry = SC, duże klastry = BC, dyfuzja i moduły Younga.
  3. Na karcie widoku danych wprowadź zmierzone dane modułów Younga dla każdej z odpowiednich kategorii wzorca komórkowego. Analizuj rozkład danych, wybierając pozycję Analizuj na pasku menu, a następnie pozycję Eksploracyjna analiza danych.
  4. Wybierz Moduły Younga jako zmienną zależną i Wzorzec komórkowy jako listę czynników. Wykres skrzynkowy używany w sekcji wyników jest wyświetlany wśród wyników w pliku wyjściowym.
  5. Aby przeprowadzić analizę statystyczną, wybierz opcję Próbki zależne w sekcji testu nieparametrycznego na karcie paska menu analizy. Wybierz Moduły Younga jako Pola testowe i Wzorzec komórkowy jako Grupy na karcie pól. Naciśnij Uruchom.
    UWAGA: Wyniki są wyświetlane w pliku wyjściowym. Do analizy statystycznej wykonywany jest test Friedmana.
  6. Uwzględnij wartości p testu nieparametrycznego na wykresie pudełkowym, który został utworzony w kroku 4.4. Zapisz wyniki, klikając Plik na pasku menu i wybierając Zapisz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z samodzielnie wykonanego urządzenia do cięcia, byliśmy w stanie eksplantować i generować małe (4 mm x 1 mm) krążki chrzęstne ze świeżych kłykci ludzkich zawierających pojedynczy komórkowy wzór przestrzenny30 pojedynczych ciągów (SS, Rysunek 2A), podwójne struny (DS), małe klastry (SC), duże klastry (BC; Rysunek 2A) i rozproszony (Rysunek 2B). Reprezentatywny explant chrząstki jest przedstawiony na Rysunek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako choroba postępująca i wieloczynnikowa choroba zwyrodnieniowa stawów wywołuje zmiany strukturalne i czynnościowe w chrząstce stawowej. Przez cały przebieg choroby zwyrodnieniowej stawów upośledzeniu cech mechanicznych towarzyszą zmiany strukturalne i biochemiczne na powierzchni chrząstki stawowej27,31. Najwcześniejszymi zdarzeniami patologicznymi występującymi w chorobie zwyrodnieniowej stawów są zubożenie proteoglikanów połączone z przerwaniem sieci kolageno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy chirurgom ortopedom z Oddziału Chirurgii Ortopedycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze za dostarczenie próbek tkanek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amfoterycyna BMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1397-89-3
Głowica mikroskopu sił atomowych (AFM) CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, NiemcyJPK00518
Biokompatybilny klej do próbek Bruker Nano GmbH, Berlin, NiemcyH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, USA14948Barwnik przepuszczalny przez błonę komórkową, stosowany do sortowania krążków chrząstki - obrazowanie w widoku z góry
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, NiemcySAA-SPH-5UMCzęstotliwość Nom: 30 KHz, k: 0,2 N / m, długość nom: 115 i mu; m, szerokość nom: 40μ m,  geometria: prostokątna, cylindryczna końcówka z 5μ m promień końcowy
Urządzenie do czyszczenia chrząstki Wykonane samodzielnie Nie dotyczyUrządzenie do cięcia z tworzywa sztucznego zawierające predefiniowane części kamery CDD 4mmx1mm
zintegrowanej z AFMImaging Source Europe GmbH, Brema, NiemcyDFK 31BF03
zintegrowana z mikroskopem fluorescencyjnymLeica Biosystems, Wetzlar, NiemcyDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, NiemcyCM3050S 
Oprogramowanie do przetwarzania danych dla AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Niemcynie dotyczywersji 5.0.86,  można pobrać bezpłatnie z następującej strony internetowej https://customers.jpk.com
zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Niemcy41966052
Mikroskop fluorescencyjny (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy11889113
Uchwyt na kantyflorę do pustaków szklanychBruker Nano GmbH, Berlin, NiemcySP-90-05Bardzo długi pustak szklany z kątowymi powierzchniami, zaprojektowany specjalnie do użytku z podgrzewaczem JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami (zintegrowany z AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, NiemcyL201306_03
pożywka L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyF1315
Szkiełka mikroskopoweSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS294775X50
Medium montażowe Z DAPIibidi GmbH, Grä felfing, Niemcy50011Podłoże montażowe z jądrowym barwieniem przeciwstawnym DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindole) do krążków chrząstek  obrazowanie z boku
Penicylina-StreptomycynaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Podgrzewacz szalki Petriego związany z AFM (podgrzewacz szalek Petriego)Bruker Nano GmbH, Berlin, NiemcyT-05-0117
SkalpelFeather Medical Products, Osaka, Japonia2023-01
Spódnica silikonowaBruker Nano GmbH, Berlin, Niemcynie dotyczyOchronna membrana silikonowa (D55x0,25), którą umieszcza się na podstawie podstawy bloku szklanego, aby zapobiec średniej kondensacji pary wodnej w głowicy AFM.
Program statystyczny - SPSSIBM, Armonk, Nowy Jork, USASPSS Statistics 22Wersja 280.0.0.0 (190)
Naczynia do hodowli tkankowych TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SzwajcariaTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, HolandiaSA6255012Rozpuszczalne w wodzie podłoże do zatapiania 
Kamera CDD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102(2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955(2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247(2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116(2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783(2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041(2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409(2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467(2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267(2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001(2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851(2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyMicro IndentationArticular Cartilage ExplantsOsteoarthritis ProgressionCartilage Mechanical PropertiesFluorescence ImagingYoung s ModulusForce Distance CurvesSample PreparationCantilever Calibration

Related Articles