Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Summary

Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.

Abstract

Bez wątpienia, mikroskopia sił atomowych (AFM) jest obecnie jedną z najpotężniejszych i najbardziej użytecznych technik oceny mikro, a nawet nano-wskazówek w dziedzinie biologii. Jednak, podobnie jak w przypadku każdego innego podejścia mikroskopowego, mogą pojawić się wyzwania metodologiczne. W szczególności charakterystyka próbki, przygotowanie próbki, rodzaj przyrządu i sondy do wgłębień mogą prowadzić do niepożądanych artefaktów. W tym protokole ilustrujemy te pojawiające się problemy dotyczące zdrowych, a także eksplantatów chrząstki stawowej z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym celu najpierw pokazujemy krok po kroku, jak generować, klasyfikować i wizualnie klasyfikować krążki chrząstki stawowej ex vivo według różnych etapów zwyrodnienia za pomocą dużego obrazowania fluorescencyjnego 2D mozaiki eksplantatów całej tkanki. Główną zaletą modelu ex vivo jest to, że składa się on ze starej, rodzimej ludzkiej chrząstki, która umożliwia badanie zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów od wczesnego początku do progresji. Ponadto przedstawiono również typowe pułapki związane z przygotowaniem tkanek, a także samą procedurę AFM wraz z późniejszą analizą danych. Pokazujemy, jak podstawowe, ale kluczowe kroki, takie jak przygotowanie i przetwarzanie próbki, charakterystyka topograficzna próbki spowodowana zaawansowaną degeneracją oraz interakcja między próbką a końcówką, mogą wpłynąć na pozyskiwanie danych. Poddajemy również analizie najczęstsze problemy w AFM i opisujemy, w miarę możliwości, jak je przezwyciężyć. Wiedza o tych ograniczeniach ma ogromne znaczenie dla prawidłowego pozyskiwania, interpretacji i ostatecznie osadzenia wyników w szerokim kontekście naukowym.

Introduction

Ze względu na stale zmniejszający się rozmiar urządzeń i systemów elektronicznych, szybki rozwój technologii i sprzętu opartego na mikro- i nano nabrał rozpędu. Jednym z takich urządzeń jest mikroskopia sił atomowych (AFM), która może skanować powierzchnie biologiczne i pobierać informacje topograficzne lub biomechaniczne zarówno w skali nano-, jak i mikrometrowej^1,2. Wśród jego licznych funkcji, narzędzie to może być używane zarówno jako mikro-, jak i nano-wgłębnik w celu uzyskania informacji o właściwościach mechanicznych różnych systemów biologicznych^3,4<....

Protocol

Kłykcie udowe pobrane od pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego w Szpitalu Uniwersyteckim w Tybindze, Niemcy, zostały użyte. Do badania włączono wyłącznie próbki chrząstki stawowej od pacjentów z patologiami zwyrodnieniowymi i pourazowymi stawów. Zgoda wydziałowej, instytucjonalnej, a także lokalnej komisji etycznej została uzyskana przed rozpoczęciem badania (Projekt nr 674/2016BO2). Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.

UWAGA: Schemat blokowy etapów eksperymentu w ich chronologicznej kolejności jest podany w Rysunek 1.

Results

Korzystając z samodzielnie wykonanego urządzenia do cięcia, byliśmy w stanie eksplantować i generować małe (4 mm x 1 mm) krążki chrzęstne ze świeżych kłykci ludzkich zawierających pojedynczy komórkowy wzór przestrzenny³⁰ pojedynczych ciągów (SS, Rysunek 2A), podwójne struny (DS), małe klastry (SC), duże klastry (BC; Rysunek 2A) i rozproszony (Rysunek 2B). Reprezentatywny explant chrząstki jest przedstawiony na Rysunek.......

Discussion

Jako choroba postępująca i wieloczynnikowa choroba zwyrodnieniowa stawów wywołuje zmiany strukturalne i czynnościowe w chrząstce stawowej. Przez cały przebieg choroby zwyrodnieniowej stawów upośledzeniu cech mechanicznych towarzyszą zmiany strukturalne i biochemiczne na powierzchni chrząstki stawowej^27,31. Najwcześniejszymi zdarzeniami patologicznymi występującymi w chorobie zwyrodnieniowej stawów są zubożenie proteoglikanów połączone z przerwaniem sieci kolageno.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfoterycyna B	Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	1397-89-3
Głowica mikroskopu sił atomowych (AFM)	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	JPK00518
Biokompatybilny klej do próbek	Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Barwnik przepuszczalny przez błonę komórkową, stosowany do sortowania krążków chrząstki - obrazowanie w widoku z góry
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	SAA-SPH-5UM	Częstotliwość Nom: 30 KHz, k: 0,2 N / m, długość nom: 115 i mu; m, szerokość nom: 40μ m,  geometria: prostokątna, cylindryczna końcówka z 5μ m promień końcowy
Urządzenie do czyszczenia chrząstki	Wykonane samodzielnie	Nie dotyczy	Urządzenie do cięcia z tworzywa sztucznego zawierające predefiniowane części kamery CDD 4mmx1mm
zintegrowanej z AFM	Imaging Source Europe GmbH, Brema, Niemcy	DFK 31BF03
zintegrowana z mikroskopem fluorescencyjnym	Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy	CM3050S
Oprogramowanie do przetwarzania danych dla AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	nie dotyczy	wersji 5.0.86,  można pobrać bezpłatnie z następującej strony internetowej https://customers.jpk.com
zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Niemcy	41966052
Mikroskop fluorescencyjny (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy	11889113
Uchwyt na kantyflorę do pustaków szklanych	Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	SP-90-05	Bardzo długi pustak szklany z kątowymi powierzchniami, zaprojektowany specjalnie do użytku z podgrzewaczem JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami (zintegrowany z AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Niemcy	L201306_03
pożywka L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy	Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	F1315
Szkiełka mikroskopowe	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Medium montażowe Z DAPI	ibidi GmbH, Grä felfing, Niemcy	50011	Podłoże montażowe z jądrowym barwieniem przeciwstawnym DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindole) do krążków chrząstek  obrazowanie z boku
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Podgrzewacz szalki Petriego związany z AFM (podgrzewacz szalek Petriego)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	T-05-0117
Skalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japonia	2023-01
Spódnica silikonowa	Bruker Nano GmbH, Berlin, Niemcy	nie dotyczy	Ochronna membrana silikonowa (D55x0,25), którą umieszcza się na podstawie podstawy bloku szklanego, aby zapobiec średniej kondensacji pary wodnej w głowicy AFM.
Program statystyczny - SPSS	IBM, Armonk, Nowy Jork, USA	SPSS Statistics 22	Wersja 280.0.0.0 (190)
Naczynia do hodowli tkankowych	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Szwajcaria	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holandia	SA6255012	Rozpuszczalne w wodzie podłoże do zatapiania