Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

DOI:

10.3791/64382

⸱

10 lutego 2023

 , 
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy wydzielania trzeciego typu (T3SS) umożliwiają bakteriom Gram-ujemnym wstrzykiwanie baterii białek efektorowych bezpośrednio do cytozolu eukariotycznych komórek gospodarza. Po wniknięciu wstrzyknięte białka efektorowe kooperatywnie modulują eukariotyczne szlaki sygnałowe i przeprogramowują funkcje komórkowe, umożliwiając wnikanie bakterii i przetrwanie. Monitorowanie i lokalizacja tych wydzielanych białek efektorowych w kontekście infekcji zapewnia podstawę do zdefiniowania dynamicznego interfejsu interakcji gospodarz-patogen. Jednak znakowanie i obrazowanie białek bakteryjnych w komórkach gospodarza bez zakłócania ich struktury/funkcji jest technicznie trudne.

Konstruowanie fluorescencyjnych białek fuzyjnych nie rozwiązuje tego problemu, ponieważ białka fuzyjne zapychają aparat wydzielniczy i dlatego nie są wydzielane. Aby przezwyciężyć te przeszkody, zastosowaliśmy niedawno metodę specyficznego dla miejsca znakowania fluorescencyjnego efektorów wydzielanych przez bakterie, a także innych trudnych do znakowania białek, za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE). W tym artykule przedstawiono kompletny protokół krok po kroku oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą GCE specyficznego dla miejsca, a następnie wskazówki dotyczące obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)

Ostatnie odkrycia sugerują, że włączenie niekanonicznych aminokwasów (ncAA) przez GCE, a następnie bio-ortogonalne znakowanie barwnikami zawierającymi tetrazynę, jest realną techniką selektywnego znakowania i wizualizacji wydzielanych przez bakterie białek oraz późniejszej analizy obrazu w gospodarzu. Celem tego artykułu jest przedstawienie prostego i przejrzystego protokołu, który może być stosowany przez badaczy zainteresowanych przeprowadzaniem obrazowania w super rozdzielczości za pomocą GCE do badania różnych procesów biologicznych w bakteriach i wirusach, a także interakcji gospodarz-patogen.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje bakteryjne od dawna uważane są za poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Patogeny wykorzystują wysoce rozwinięte, niezwykle silne i skomplikowane systemy obronne, a także różnorodne czynniki wirulencji bakteryjnej (określane jako białka efektorowe), aby uniknąć odpowiedzi immunologicznej gospodarza i wywołać infekcje1,2. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych systemów i rola poszczególnych białek efektorowych są nadal w dużej mierze nieznane ze względu na brak odpowiednich podejść do bezpośredniego śledzenia kluczowych składników białkowych i efektorów w komórkach gospodarza podczas patogenezy.

Jednym z typowych przykładów jest Salmonella enterica serowar Typhimurium, która powoduje ostre zapalenie żołądka i jelit. Salmonella Typhimurium wykorzystuje systemy wydzielania typu trzeciego (T3SS) do wstrzykiwania różnych białek efektorowych bezpośrednio do komórek gospodarza. Gdy tylko Salmonella dostanie się do komórki gospodarza, znajduje się w kwaśnym przedziale związanym z błoną, zwanym wakuolą zawierającą Salmonellę (SCV)3,4. Kwaśne pH SCV aktywuje T3SS kodowaną przez wyspę patogeniczności Salmonelli 2 (SPI-2) i translokuje salwę 20 lub więcej białek efektorowych przez błonę wakuolarną do cytozolu gospodarza 5,6,7,8. Wewnątrz gospodarza te złożone koktajle białek efektorowych koordynują szlaki sygnałowe komórek gospodarza, powodując powstawanie wysoce dynamicznych, złożonych rurowych struktur błonowych rozciągających się od SCV wzdłuż mikrotubul, zwanych włóknami indukowanymi przez Salmonellę (SIF), które umożliwiają Salmonelli przetrwanie i replikację w komórkach gospodarza9,10,11.

Metody wizualizacji, śledzenia i monitorowania lokalizacji efektorów bakteryjnych, a także badania ich transportu i interakcji wewnątrz komórek gospodarza, dostarczają krytycznego wglądu w mechanizmy leżące u podstaw patogenezy bakteryjnej. Znakowanie i lokalizacja białek efektorowych T3SS wydzielanych przez Salmonellę w komórkach gospodarza okazało się wyzwaniem technologicznym12,13; Niemniej jednak rozwój genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych zmienił naszą zdolność do badania i wizualizacji białek w żywych organizmach. Jednak wielkość białek fluorescencyjnych (~25-30 kDa)15 jest często porównywalna lub nawet większa niż wielkość białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI; np. 13,65 kDa dla SsaP, 37,4 kDa dla SifA). W rzeczywistości znakowanie białkami fluorescencyjnymi efektorów często blokuje wydzielanie znakowanego efektora i blokuje T3SS14.

Ponadto, białka fluorescencyjne są mniej stabilne i emitują niską liczbę fotonów przed fotowybielaniem, co ogranicza ich użycie w technikach mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości16,17,18, szczególnie w mikroskopii fotoaktywacji lokalizacji (PALM), STORM i mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED). Podczas gdy właściwości fotofizyczne organicznych barwników fluorescencyjnych są lepsze niż białek fluorescencyjnych, metody/techniki takie jak CLIP/SNAP19,20, Split-GFP21, ReAsH/FlAsH22,23 i HA-Tags24,25 wymagają dodatkowego wyrostka białkowego lub peptydowego, który może upośledzać funkcję strukturalną białka efektorowego będącego przedmiotem zainteresowania poprzez zakłócanie modyfikacji potranslacyjnej lub transportu. Alternatywna metoda, która minimalizuje niezbędną modyfikację białek, polega na włączeniu ncAA do punktu POI podczas translacji przez GCE. NCAA są albo fluorescencyjne, albo mogą być fluorescencyjne za pomocą kliknięcia chemistry12,13,26,27,28.

Korzystając z GCE, ncAA z małymi, funkcjonalnymi, bioortogonalnymi grupami (takimi jak grupa azydkowa, cyklopropenowa lub cyklooktynowa) mogą być wprowadzane w prawie każdym miejscu docelowego białka. W tej strategii natywny kodon jest zamieniany na rzadki kodon, taki jak bursztynowy (TAG) kodon stop w określonej pozycji w genie POI. Zmodyfikowane białko ulega następnie ekspresji w komórkach wraz z ortogonalną parą syntetazy aminoacylo-tRNA/tRNA. Miejsce aktywne syntetazy tRNA jest zaprojektowane do odbierania tylko jednego określonego ncAA, który jest następnie kowalencyjnie przyłączany do końca 3' tRNA, który rozpoznaje bursztynowy kodon. ncAA jest po prostu wprowadzany do pożywki wzrostowej, ale musi zostać wchłonięty przez komórkę i dotrzeć do cytozolu, gdzie syntetaza aminoacylo-tRNA (aaRS) może połączyć go z ortogonalnym tRNA; jest następnie włączany do punktu POI w określonym miejscu (patrz Rysunek 1)12. W ten sposób GCE umożliwia specyficzne dla miejsca włączenie mnóstwa bioortogonalnych grup reaktywnych, takich jak keton, azydek, alkin, cyklooktyn, transcyklookten, tetrazyna, norbonen, α, β-nienasycony amid i bicyklo [6.1.0]-nonyn do POI, potencjalnie pokonując ograniczenia konwencjonalnych metod znakowania białek12,26,27,28.

Ostatnie pojawiające się trendy w technikach obrazowania o wysokiej rozdzielczości otworzyły nowe możliwości badania struktur biologicznych na poziomie molekularnym. W szczególności STORM, jednocząsteczkowa, oparta na lokalizacji, technika superrozdzielczości, stała się nieocenionym narzędziem do wizualizacji struktur komórkowych do ~20-30 nm i jest w stanie badać procesy biologiczne cząsteczka po cząsteczce, odkrywając w ten sposób role cząsteczek wewnątrzkomórkowych, które są jeszcze nieznane w tradycyjnych badaniach uśrednianych zespołowo13. Techniki jednocząsteczkowe i superrozdzielcze wymagają małego znacznika z jasnymi, fotostabilnymi fluoroforami organicznymi w celu uzyskania najlepszej rozdzielczości. Niedawno pokazaliśmy, że GCE może być używany do włączenia odpowiednich sond do obrazowania w superrozdzielczości12.

Dwa z najlepszych wyborów do znakowania białek w komórkach to bicyklo [6.1.0] nonynelizyna (BCN) i trans-cyklookten-lizyna (TCO; pokazane w Rysunek 1), które mogą być genetycznie kodowane przy użyciu wariantu pary tRNA/syntetaza (tutaj określanego jako tRNAPyl/PylRSAF), gdzie Pyl reprezentuje pirolizynę, a AF reprezentuje racjonalnie zaprojektowaną podwójną mutantkę (Y306A, Y384F) pochodzącą z Methanosarcina mazei To naturalnie koduje pirolizynę12,29,30,31. Poprzez promowaną przez szczep reakcję cykloaddycji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronów (SPIEDAC), aminokwasy te reagują chemoselektywnie z koniugatami tetrazyny ( Rysunek 1) < klasa sup = "xref">12,< klasa sup = "xref" >30,< klasa sup = "xref">31. Takie reakcje cykloaddycji są wyjątkowo szybkie i kompatybilne z żywymi komórkami; Mogą być również fluorogenne, jeśli odpowiedni fluorofor jest funkcjonalizowany ugrupowaniem tetrazynowym < klasa sup="xref">12,26,32. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania dynamiki efektorów bakteryjnych dostarczanych do komórek gospodarza za pomocą GCE, a następnie subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą dSTORM. Wyniki wskazują, że włączenie ncAA przez GCE, a następnie reakcja kliknięcia z fluorogennymi barwnikami zawierającymi tetrazynę, stanowi wszechstronną metodę selektywnego znakowania, wizualizacji wydzielanych białek, a następnie lokalizacji subkomórkowej w gospodarzu. Wszystkie opisane tutaj komponenty i procedury można jednak dostosować lub zastąpić, tak aby system GCE mógł być dostosowany do badania innych zagadnień biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa plazmidu

  1. Sklonuj gen wyrażający POI do plazmidu ekspresyjnego (np. pET28a-sseJ 10TAG), który wyraża POI w E. coli BL21 (DE3). Ten krok ułatwia ustalenie, czy mutanty są funkcjonalne.
    2. W celu wizualizacji efektorów wydzielanych przez Salmonellę w komórkach gospodarza, skonstruuj plazmid ekspresyjny (pWSK29-sseJ-HA), który wyraża docelowe POI SseJ pod kontrolą swojego natywnego promotora, jak opisano w poprzednich raportach7,12,24.
  2. Stosując mutagenezę ukierunkowaną, zastąp kodon fenyloalaniny-10 kodonem bursztynowym (TAG) w SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), zapewniając motyw AAT-TAG-ACT33,34.
  3. Oprócz powyższych plazmidów, do genetycznej inkorporacji trans-cyklooct-2-en-L-lizyny (TCO*A) do POI, należy użyć innego plazmidu ekspresyjnego (pEVOL-PylRS-AF)31, który zawiera wyewoluowaną parę tRNA/syntetaza (tRNAPyl/PylRSAF ) geny kodowane w plazmidzie pEVOL.
    UWAGA: Szczegółowe opisy plazmidu i protokołów klonowania są opisane w poprzednim raporcie30,31.
  4. Użyj dostępnych na rynku zestawów do przygotowania plazmidu, aby uzyskać wysokiej jakości plazmidowe DNA. Dla oczyszczonego DNA optymalny stosunek 260/280 wynosi ~1,8. W razie potrzeby sprawdź czystość DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym 1%.

2. Przygotowanie kultury bakteryjnej

  1. Otrzymywanie podwójnych transformantów w celu sprawdzenia, czy mutant jest funkcjonalny w E. coli
    1. Wyjmij kompetentne komórki BL21 z temperatury -80 °C i rozmrażaj na lodzie przez około 20–30 minut.
    2. Wymieszaj 1–5 μl każdego plazmidu (~50 ng pEVOL-PylRS-AF i pET28a-sseJ 10TAG) z 200 μl chemicznie kompetentnych komórek BL21 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj kompetentne komórki i mieszaninę plazmidów; Inkubować przez 30 minut na lodzie.
    3. Szok termiczny probówki mikrowirówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s. Umieść probówki z powrotem na lodzie na 2 minuty.
    4. Dodaj 1 ml ciepłej pożywki LB do probówki mikrowirówkowej i szybko przenieś mieszaninę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę. Umieść część lub wszystkie przekształcone komórki na płytkach agarowych LB zawierających odpowiednie antybiotyki. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W tym protokole użyto 35 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml kanamycyny do wyboru odpowiednio pEVOL-PylRS-AF i pET28a-sseJ 10TAG. Na etapie transformacji oceń udaną transformację za pomocą kontroli negatywnych i pozytywnych.
  2. Przenieś mutanta do Salmonelli w celu wizualizacji efektorów wydzielanych przez Salmonellę w komórkach gospodarza:
    1. Dodać po 2–3 μl pEVOL-PylRS-AF i pWSK29-sseJ 10TAG do 40–60 μl elektrokompetentnego szczepu Salmonella Typhimurium 14028s w schłodzonej probówce do mikrowirówki. Delikatnie wymieszaj mieszaninę za pomocą pipety.
    2. Przenieś mieszaninę elektroporacyjną do schłodzonej kuwety (0,2 cm odstępu między elektrodami); ustaw ustawienia elektroporacji na 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Umieść kuwetę w komorze elektroporacyjnej. Upewnij się, że elektroda komory mocno styka się z kuwetą mikropulsatora.
    3. Naciśnij i przytrzymaj przycisk pulsacyjny, aż usłyszysz sygnał dźwiękowy.
    4. Natychmiast dodaj 1 ml ciepłej pożywki LB do kuwety. Przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 250 obr./min przez 1 godzinę.
    5. Umieścić część lub całość mieszaniny Salmonelli do elektroporacji na płytce agarowej LB zawierającej odpowiednie antybiotyki. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W tym protokole do wyboru odpowiednio pEVOL-PylRS-AFi pWSK29-sseJ 10TAG użyto 35 μg/ml chloramfenikolu i 100 μg/ml ampicyliny.
  3. Przygotowanie kultury
    1. Zaszczepić pojedynczą kolonię Salmonelli lub E. coli w 5 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.

3. Ekspresja i znakowanie fluorescencyjne białek zawierających ncAA

  1. Ekspresja białek zawierających ncAA w E. coli
    1. Przenieść 100 μl kultury podstawowej do 5 ml pożywki LB (rozcieńczenie 1:50) zawierającej 35 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml kanamycyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,4–0,6.
    2. Przygotować 1 mM roztworu podstawowego TCO*A (10 ml; Tabela 1).
    3. Gdy kultury osiągną OD600 = 0,4–0,6, zastąp pożywkę LB świeżym LB zawierającą 1 mM TCO*A, 35 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml kanamycyny.
      UWAGA: Alternatywnie roztwór podstawowy TCO*A można przygotować zgodnie z opisem w kroku 5.4.2.
    4. Indukować ekspresję białka w obecności 1 mM IPTG, 0,2% arabinozy i wstrząsać przez noc w temperaturze 34 °C, 250 obr./min. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 11 000 × g. Usunąć sklarowany osad i zamrozić osad w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    5. W przypadku eksperymentu kontrolnego powtórz ten sam eksperyment, ale ekspresję białek zawierających ncAA pod nieobecność ncAA. W przypadku znakowania fluorescencyjnego in vitro białek zawierających ncAA w E. coli należy postępować zgodnie ze szczegółową procedurą opisaną w kroku 3.3.
  2. Ekspresja białek zawierających ncAA w Salmonelli
    1. Przenieść 100 μl kultury podstawowej do 5 ml pożywki LB (rozcieńczenie 1:50) zawierającej 35 μg/ml chloramfenikolu i 100 μg/ml ampicyliny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,6.
    2. Przygotować zmodyfikowaną pożywkę N-minimalną (MgM, pH 5,6) zgodnie z opisem w tabeli 1.
    3. Zastąp pożywkę LB zmodyfikowaną pożywką N-minimalną (MgM) uzupełnioną 1 mM TCO*A (tabela 1). Hodować bakterie w temperaturze 34 °C przez 30 minut. Następnie dodaj 0,2% arabinozy, 25 mg/ml chloramfenikolu i 100 mg/ml ampicyliny i hoduj komórki przez kolejne 6 godzin, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
    4. Po 6 godzinach przemyć bakterie 4x w odstępie 30 minut, świeżymi pożywkami MgM (pH 5,6) (Tabela 1) bez ncAA. Na etapach prania stosować 972 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odwirować bakterie, ponownie zawiesić w 1 buforze PBS i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności w celu usunięcia nadmiaru ncAA. Po 1 godzinie odwirować bakterie w temperaturze 3 000 × g, w temperaturze 4 °C przez 15 minut i przechowywać do dalszego wykorzystania.
    6. W przypadku eksperymentu kontrolnego powtórz ten sam eksperyment, powodując ekspresję białek zawierających ncAA przy braku ncAA.
  3. Znakowanie fluorescencyjne in vitro białek zawierających ncAA w Salmonella Typhimurium
    1. Ponownie zawiesić komórki Salmonelli wykazujące ekspresję SseJ-F10TCO-HA w przypadku braku lub obecności TCO*A (z kroku 3.2) w 1x PBS. Dostosuj OD600 do 4 w PBS. Inkubować komórki z 20 μM Janelia Fluor 646-tetrazyną (JF646-Tz) lub 20 μM BDP-Fl-tetrazyną (5 mM roztwory podstawowe w DMSO) w temperaturze 37 °C w ciemności i wstrząsać przez 1–2 godziny z prędkością 250 obr./min.
    2. Komórki należy otopić osadem, przemyć 3–4 razy PBS zawierającym 5% DMSO i 0,2% Pluronic F-127, ponownie zawiesić w PBS zawierającym 5% DMSO i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności. Umyj 2x ponownie za pomocą 1x PBS. Na etapach prania stosować 972 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Natychmiast zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub utrwal je 1,5% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 30–45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    4. Przemyj stałe komórki 2x PBS, a na koniec w 50 mM NH4Cl w PBS przez 15 minut, aby usunąć nadmiar PFA. Zawiesić komórki w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 3–4 dni. Zobrazuj bakterie za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak opisano w sekcji 6.

4. Biochemiczna charakterystyka białek zawierających ncAA

  1. Liza komórek
    1. Zawiesić komórki z sekcji 3.1 w buforze do lizy (Tabela 1) i inkubować w temperaturze pokojowej przez ponad 30 minut. Schłodzić mieszaninę na lodzie przez 15 minut
      UWAGA: Stosunek buforu do lizy do masy komórki należy utrzymywać na poziomie 1:10.
    2. Sonikuj zawieszone komórki, będąc jeszcze na lodzie. Pulsuj przez 30 s przy ustawieniu 7 co najmniej 6x, z 1-minutowymi przerwami, używając sonikatora (patrz Tabela Materiałów).
    3. Odwiruj lizat komórkowy w temperaturze 20 500 × g, 4 °C przez 15 minut (utrzymanie 4 °C ma kluczowe znaczenie). Przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad.
  2. Analiza SDS-PAGE
    1. Przygotuj 5x barwnik ładujący SDS (Tabela 1). Dodać 5 μl buforu ładującego żel SDS do 13 μl lizatu komórkowego. Denaturować białka za pomocą buforu próbki dodecylosiarczanu sodu (SDS) w probówce o pojemności 2 ml w temperaturze 95 °C przez 10 minut, odwirować mieszaninę przy 2 000 × g przez 50 s i załadować do 12% żelu poliakryloamidowego SDS.
    2. Zmontuj kasetę z żelem, umieść ją w aparacie do elektroforezy żelowej i podłącz aparat do elektroforezy do źródła zasilania elektrycznego. Wlać działający bufor, załadować markery masy cząsteczkowej i próbki białek, a następnie uruchomić żel pod napięciem 100 V, aż bromofenol dotrze do dna żelu rozdzielczego.
      UWAGA: Analizę należy rozpocząć natychmiast, ponieważ lizaty przechowywane w temperaturze -20 °C mają tendencję do utraty jakości po każdym cyklu zamrażania i rozmrażania.
    3. Zabarwić żel niebieską plamą białkową Coomassie.

5. Bio-ortogonalne znakowanie efektora SseJ-F10TCO-HA wydzielanego przez Salmonellę w komórkach HeLa

  1. Hoduj i utrzymuj komórki HeLa w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g / l), uzupełnionej 10% (v/v) FBS oprócz penicyliny-streptomycyny (1x).
  2. Hodowla bakterii 1 dzień przed zakażeniem. Zaszczepić pojedynczą kolonię Salmonelli 14028s zawierających pEVOL-PylRS-AF i pWSK29-sseJ 10TAG w 5 ml standardowego bulionu LB zawierającego antybiotyk przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
  3. Wysiew komórek HeLa 1 dzień przed infekcją. Weź kolbę do hodowli tkankowej (T-75) zawierającą komórki HeLa przy ~80% zgrywce, zgodnie z badaniem mikroskopowym gęstości komórek. Umyj komórki ciepłym PBS. Odłącz komórki za pomocą 3 ml ciepłej 0,25% trypsyny/EDTA na 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    1. Ugasić trypsynę za pomocą 2 ml DMEM (+ 10% FBS). Przenieść całą zawartość kolby do probówki o pojemności 15 ml po ponownym wymieszaniu komórek. Wiruj komórki w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut. Wyjąć supernatant z probówki. Ponownie zawiesić osad komórek HeLa we wstępnie podgrzanym podłożu wzrostowym.
    2. Użyj hemocytometru, aby zbadać zawiesinę i policzyć obecne komórki. Przygotować rozcieńczony zapas komórek w stężeniu 1 × 105 komórek/ml. Wysiew 0,5 × 105 komórek HeLa na studzienkę w 500 μL DMEM + 10% pożywki wzrostowej FBS w ośmiodołkowym szkiełku skalnym. Szkiełko komorowe należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95% przez 24 godziny.
  4. Infekcja bakteryjna
    1. Subkultura Salmonella 14028s zawierająca pEVOL-PylRS-AF i pWSK29-sseJ 10TAG, poprzez rozcieńczenie 100 μl nocnej kultury bakteryjnej (z kroku 5.2) w 3 ml pożywki LB (rozcieńczenie 1:30) zawierającej 35 μg/ml chloramfenikolu i 100 μg/ml ampicyliny, a następnie inkubację w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 5–7 h.
      UWAGA: Podczas tej fazy kultury osiągają późną fazę wykładniczą, a bakterie są wysoce inwazyjne.
    2. Przygotować roztwór podstawowy 100 mM TCO*A i kompletną pożywkę (Tabela 1).
    3. Aby zainicjować infekcję komórkami HeLa, wyjmij komórki HeLa z inkubatora i umyj komórki wstępnie podgrzanym DPBS przed dodaniem 500 μl świeżego DMEM (+10% FBS) do każdej studzienki. Umieść szkiełko komory z powrotem w inkubatorze CO2 do momentu rozpoczęcia infekcji.
    4. Po 5-7 godzinach inkubacji rozcieńczyć kulturę Salmonelli do OD600 = 0,2 w 1 ml pożywki wzrostowej DMEM (~3 × 108 jtk/ml). Dodać wymagane ilości inokulum Salmonelli do każdej studzienki szkiełka komorowego, tak aby wielokrotność infekcji (MOI) wynosiła 100.
    5. Inkubować zakażone komórki w inkubatorze CO2 przez 30 minut. Umyj komórki 3x podgrzanym DPBS, aby usunąć zewnątrzkomórkową Salmonellę. Ustaw ten punkt czasu na 0 godzin po infekcji. Dodawać 500 μl kompletnej pożywki (Tabela 1) zawierającej 100 μg/ml gentamycyny przez 1 godzinę. Po 1 h umyj komórki 3x DPBS. Dodać 500 μl kompletnej pożywki (od kroku 5.4.2; Tabela 1) uzupełnione 0,2% arabinozą, 10 μg/ml gentamycyny do każdego dołka szkiełka komorowego.
    6. W eksperymencie kontrolnym wykonaj podobne infekcje komórek HeLa bez TCO*A.
    7. Inkubować szkiełko komorowe przez 10 godzin w inkubatorze CO2 .
  5. Kliknij etykietowanie oparte na chemii w aktywnych komórkach
    1. Przystąp do oznaczania komórek zakażonych bakteriami. Podgrzej całe podłoże bez TCO*A (Tabela 1).
    2. Po 10 godzinach od zakażenia wymień kompletną pożywkę na świeżą kompletną pożywkę bez TCO*A i umyj komórki HeLa 4x w odstępie 30 minut każda, wstępnie podgrzanym DPBS, a następnie świeżą kompletną pożywką (bez TCO*A).
    3. Przygotować 0,5 mM roztwór podstawowy barwnika i tetrazyny w DMSO.
      UWAGA: Do znakowania efektorów wydzielanych przez Salmonellę w komórkach gospodarza przedstawiono dwa protokoły. Dla protokołu 1 należy przygotować mieszaninę barwników, rozcieńczając bulion JF646-Tz w 1x PBS zawierającym 1% sól sodową kazeiny z mleka krowiego, tak aby końcowy roztwór roboczy wynosił 2 μM. Dla protokołu 2 przygotuj ciepłą kompletną pożywkę (bez FBS i TCO*A) i dodaj 2 μM JF646-Tz. Spraw, aby ta mieszanina barwników była świeża na każdą sesję etykietowania. Jeśli to możliwe, pracuj w ciemności (przyciemnij światła w okapie i/lub pomieszczeniu).
    4. Po 12 godzinach od zakażenia odessać pożywkę z komórek. Umyj ogniwo wstępnie podgrzanym DPBS 2x lub 3x. W jednej grupie studzienek dodać 500 μl mieszaniny roztworu barwnika opisanej w protokole 1, a w innej grupie studzienek tej samej komory dodać 500 μl mieszaniny roztworu barwnika opisanej w protokole 2 wspomnianym w kroku 5.5.3 i uwadze następnej. Umieść szkiełka komory z powrotem w inkubatorze CO2 na 1,5–2 godziny.
    5. Po 13,5–14 godzinach od infekcji przepłukać komórki HeLa 2x podgrzanym DPBS. Dodaj 500 μL świeżego DMEM (uzupełnionego FBS). Umieść szkiełko komory z powrotem w inkubatorze na 30 minut. Umyj komórki podgrzanym DPBS, a następnie świeżym DMEM 4x w odstępie 30 minut.
    6. Po 16 godzinach od zakażenia utrwalić komórki HeLa za pomocą PFA, dodając 200 μl 4% PFA do każdej studzienki i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odessać PFA, przepłukać 3x PBS i przechowywać komórki w PBS w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: PFA jest wysoce toksyczną substancją chemiczną. Unikać wdychania, a także kontaktu ze skórą i oczami. Podczas obsługi należy nosić sprzęt ochronny. Aby uniknąć wystawienia oznakowanej próbki na działanie światła, wyłącz światło w kapturze do hodowli komórkowych.
  6. Barwienie immunologiczne białek znakowanych kwasem hialuronowym
    1. Odessać PBS i raz spłukać w roztworze blokującym (Tabela 1).
    2. Utrwalone komórki HeLa inkubować z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych na bazie PBS (Tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Użyj króliczego przeciwciała pierwszorzędowego anty-HA do barwienia wydzielanego SseJ (rozcieńczenie 1:500).
    3. Po 1 godzinie delikatnie umyj komórki 2x 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS. Podczas płukania roztworem Tween/PBS inkubować komórki 3x z 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS przez 5 min.
    4. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi 555 w stosunku 1:500 w roztworze przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Po 1 godzinie delikatnie przemyć komórki 2x 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS i inkubować 2x z 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS przez 5 min.
    6. Umyj komórki 3x 0,5 ml 1x PBS i przechowuj je w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: Utrwalone komórki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w PBS w temperaturze 4 °C. Barwienie immunologiczne należy wykonać w ostatniej chwili.

6. Obrazowanie konfokalne

  1. Użyj mikroskopu konfokalnego, takiego jak wirujący dysk (SD) lub mikroskop SED.
    1. Dostosuj ustawienia akwizycji obrazu, takie jak tryb skanowania (XYZ), szybkość skanowania (400 Hz), rozdzielczość (512 x 512), powiększenie (100x) i układanie w stos Z.
    2. Używaj odpowiednich filtrów wzbudzenia/emisji dla DAPI, BDP-Tz i JF646 tetrazine.
      UWAGA: W przypadku tego protokołu obrazowanie konfokalne wykonano na systemie mikroskopowym STED wyposażonym w pulsacyjny laser światła białego, pozwalający na wybór wzbudzenia w zakresie 470–670 nm oraz laser diodowy UV 405 nm do wzbudzenia przy 405 nm, 488 nm i 647 nm. Odpowiednie zakresy emisji zostały ustawione za pomocą wbudowanego akustyczno-optycznego rozdzielacza wiązki w połączeniu z pryzmatyczną, przestrajalną, wielopasmową detekcją spektralną układu konfokalnego.
    3. Uchwyć obrazy za pomocą obiektywu immersyjnego 100×/1,4 olejku.

7. Obrazowanie w superrozdzielczości (dSTORM)

  1. Włącz mikroskop na 3 godziny przed obrazowaniem, aby umożliwić równowagę termiczną (dryft jest bardziej prawdopodobny, jeśli obrazowanie rozpocznie się wcześniej). Schłodzić aparat do temperatury -70 °C.
  2. W międzyczasie należy przygotować świeży bufor obrazowania GLOX-BME (Tabela 1).
  3. Przynieś komórki do mikroskopu. Umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu w uchwycie próbki. W uchwycie upewnij się, że próbka jest płaska i bezpieczna. Zmienić pożywkę w studzience na 0,4 ml świeżo przygotowanego buforu do obrazowania GLOX-BME.
  4. Ustaw odpowiednią linię laserową i zestawy filtrów. Zmniejsz moc lasera do ~1 mW, aby zidentyfikować interesujące ogniwo HeLa. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej i kąt wiązki laserowej podczas oświetlania próbki o niskiej gęstości lasera 647 nm (w tym przypadku sugerowany jest stromo nachylony kąt [HILO], ponieważ HILO podnosi sygnał do tła [SBR]). Dostosuj kąt oświetlenia HILO.
    UWAGA: W tym protokole obrazowanie SseJ w superrozdzielczości uzyskano w kanale Alexa Fluor 647 przy użyciu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego (patrz tabela materiałów), wyposażonego w obiektyw TIRF (obiektyw zanurzeniowy w oleju 100x Apo TIRF, NA 1,49). Fluorescencję wykryto za pomocą kamery EMCCD, która była kontrolowana za pomocą μManager.
  5. Ustaw wzmocnienie przedwzmacniacza na 3 i aktywuj transfer klatek w μManagerze. Ustaw wzmocnienie EM na 200, aby uzyskać wyższą czułość w pomiarach dSTORM, zgodnie z opisem w poprzednim raporcie35.
  6. Przed przystąpieniem do obrazowania dSTORM należy wykonać referencyjny obraz struktury docelowej z ograniczoną dyfrakcją. Przełącz fluorofory w stan ciemny, włączając laser na maksymalną moc.
    UWAGA: Pojedyncze, szybko cząsteczki fluoroforów JF646 obserwowano, gdy fluorofory JF646 były przekształcane w stan przeważnie ciemny przez ciągłe oświetlenie światłem wzbudzającym 647 nm, jak opisano wcześniej36.
  7. Dostosuj siłę lasera do odpowiedniego poziomu, w którym zdarzenia są oddzielone w przestrzeni i czasie, ustaw czas ekspozycji na 30 ms i rozpocznij akwizycję. Zdobądź 10 000–30 000 klatek.
    UWAGA: Należy wprowadzić zmiany w sile lasera, aby zoptymalizować mruganie. Rozważ zwiększenie intensywności lasera, jeśli wykryto zbyt wiele zdarzeń (cząstek, które nakładają się na siebie). Idealna długość zależy od jakości próbki, ale ~10 000 klatek powinno wykazywać dostrzegalne cechy.

8. Rekonstrukcja obrazu dSTORM

  1. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.
    UWAGA: ThunderSTORM, jeden z wielu dostępnych programów do rekonstrukcji obrazów o otwartym kodzie źródłowym, jest pokrótce opisany poniżej.
  2. Otwórz ImageJ i zaimportuj nieprzetworzone dane. Otwórz wtyczkę ThunderSTORM i skonfiguruj ustawienia kamery odpowiadające urządzeniu.
  3. Przejdź do opcji Uruchom analizę i ustaw odpowiednie ustawienia, takie jak filtrowanie obrazu (różnica filtrów uśredniających), metody lokalizacji (maksimum lokalne) i lokalizacja cząsteczek pod pikselami (zintegrowane PSF Gaussa). Kliknij OK, aby rozpocząć rekonstrukcję obrazu.
    UWAGA: W razie potrzeby szczegółowe instrukcje dotyczące ustawiania parametrów w ThunderSTORM zostały już opisane 37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten dokument protokołu opisuje opartą na GCE metodę specyficznego dla danego miejsca znakowania fluorescencyjnego i wizualizacji efektorów wydzielanych przez Salmonellę, jak pokazano w Rysunek 1. Struktura chemiczna grupy bioortogonalnej transcyklooctenu transcyklooctenu (TCO) i barwnika fluorescencyjnego jest pokazana w Rysunek 1A. Znakowanie SseJ osiągnięto poprzez genetyczne włączenie bioortogonalnych ncAA do bursztynowego kodo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane w niniejszym dokumencie podejście wykorzystano do śledzenia dokładnej lokalizacji białek efektorowych wstrzykniętych do komórki gospodarza przez bakteryjną T3SS po zakażeniu. T3SS są wykorzystywane przez patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Salmonella, Shigella i Yersinia, do transportu składników wirulencji do gospodarza. Rozwój technologii obrazowania w superrozdzielczości umożliwił wizualizację czynników wirulencji w niewyobrażalnej wcześniej rozdzielczości 12,13,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze start-up z oddziału medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston, TX, oraz nagrodę Texas STAR dla L.J.K. Dziękujemy prof. Edwardowi Lemke (Europejskie Laboratorium Biologii Molekularnej, Heidelberg, Niemcy) za plazmid pEVOL-PylRS-AF. Obrazy na rysunku 1 zostały utworzone przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Bufor do biegania Tris/Glycine SDSBIO-RAD1610732
Chlorek amonuFischer ScientificA661-500
Siarczan amonuFischer ScientificBP212R-1
Ampicylina SodowaSigma-AldrichA01665 g
Antybiotyk-Przeciwgrzybicza (100x)ThermiFischer Scientific15240096
ArabinozaSigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP (wysokowydajna wirówka)Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-tetrazynaLumiprobe (USA)2.14E+02
β-merkaptoetanolMilipore444203250 ml
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
KazeinaSigma-AldrichC8654
KatalazaSigma-AldrichC9322
ChloramfenikolSigma-AldrichC1919
Click Aminokwas / trans-Cyclooct-2-en – L - Lizyna (TCO*A)SiChem GmbHSC-8008Rozmiar: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+DeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* Używany do utrzymywania HeLa Cell
DMEM**Gibco11965-092**Stosowany w przypadku infekcji bakteryjnych w obecności ncAA, patrz punkt 5.4.
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
Osioł przeciwciało anty-królicze Alexa fluoro555wtórne InvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
Szczep E. coli BL21 (DE3)Novagen (Madison, WI)
Kamera EMCCDAndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Probówka 1,5 ml (PCR clean)Eppendorf, Hamburg, Niemcy30123.328
Surowica bydlęca płodu (FBS)Filtry
Fisherbrand - sterylne (PVDF 0,22 i mikro; m)Fischer Scientific97203Zestaw 100
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBIO-RAD1652660
GentamycinSigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-Glutamina (200 mM), 100xFischer Scientific25-030-081
Oksydaza glukozowaSigma-AldrichG7141-50KU
GlicerolFischer ScientificBF229-4
Komórki HeLaATTCCCL-2
Bufor HEPESCorning25-060-C1100 mL
Kwas hydrokwarowyFischerScientific A144-212
ImageJPrzetwarzanie i analiza obrazu:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1LBejca na bazie Coomassie
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-tetrazynaTocris Bioscience7279
KanamycynaSigma-Aldrich606155 g
LB BulionBD Difco244620500 g
LizozymSigma-AldrichL6876
μ Menedżer (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
Kuweta mikropulsacyjnaBIO-RAD165-20860,2 cm odstęp między elektrodami, opakowanie 50
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Kolby do hodowli komórkowychThermiFischer Scientific156499
Omnipur Casamino AcidCalbiochem2240500 g
Paraformaldehhyde (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauki 15710
PBS (10x)Roche11666789001
Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AFBudowa plazmidu i mapa znajdują się pod następującymi numerami referencyjnymi
1. Angew Chem Int ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Zestaw do miniprzygotowania plazmiduQiagen27106
plazmid pWSK29-sseJ10TAG-HARef: elife. 2021, 10, e67789.
plazmid pWSK29-sseJ-HANr ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                                                                                    Mapa wektorowa PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025Klasa białkowa, 10% roztwór
Jednozasadowy fosforan potasuFischer ScientificP285-500
Siarczan potasuAcros Organicznyzestaw
- CalbiochemSigma-Aldrich539131100x Roztwór
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-HASigma-AldrichH6908
S. enterica. serowar Typhimurium 14028sRef.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-F
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771
Wodorotlenek soduFischer ScientificSS255-1
Pirogronian sodu (100 mM), 100xCorning25-060-C1100 mL
Dysmembrator soniczny Model 100Fischer Scientific24932
STED mikrosocpe (system Leica TCS SP8 STED 3X)Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcyhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-well szkiełka do hodowli tkankowychSARSTEDT94.6190.802
Spektrofotometr strzykawkowe Fischer 10082147 koktajli inhibitorów proteazy 424220250

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116(2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311(2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335(2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789(2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050(2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12(2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292(2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811(2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715(2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261(2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekrecja typu trzeciegoznakowanie specyficzne dla miejscaniekanoniczne aminokwasymikroskopia dSTORModdzia ywanie gospodarz patogenefektory Salmonellaznakowanie bioortogonalne

Powiązane artykuły