Artykuł metodologiczny

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

DOI:

10.3791/64391

⸱

13 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Laboratory of Cancer Drug Resistance, Federal University of Parana, 2Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Parana, 3Federal Institute of Parana

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje nowatorskie, proste i tanie urządzenie do przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT), nazwane PhotoACT. Urządzenie zostało zbudowane przy użyciu zestawu konwencjonalnych programowalnych diod elektroluminescencyjnych (LED), modułu wyświetlacza ciekłokrystalicznego (LCD) oraz czujnika światła podłączonego do komercyjnej płytki mikrokontrolera. Pudełkowa konstrukcja prototypu została wykonana z płyt pilśniowych (MDF) o średniej gęstości. Wewnętrzna komora może jednocześnie przydzielić cztery mikropłytki wielodołkowe do hodowli komórkowych.

Jako dowód słuszności koncepcji, badaliśmy cytotoksyczne działanie werteporfiny fotosensybilizatora (PS) przeciwko linii komórkowej HeLa w dwuwymiarowej (2D) hodowli. Komórki HeLa traktowano zwiększonym stężeniem werteporfiny przez 24 godziny. Pożywkę supernatantową zawierającą lek odrzucono, przylegające komórki przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodano pożywkę wolną od leku. W tym badaniu badano wpływ werteporfiny na komórki bez ekspozycji na światło lub po ekspozycji na światło przez 1 godzinę przy użyciu wartości czerwono-zielono-niebieskich (RGB) wynoszących 255, 255 i 255 (średnia fluencja 49,1 ± 0,6 J/cm2). Po 24 godzinach żywotność komórek oceniano za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT).

Wyniki eksperymentalne pokazały, że ekspozycja komórek leczonych werteporfiną na światło z urządzenia wzmacnia cytotoksyczne działanie leku poprzez mechanizm, w którym pośredniczą reaktywne formy tlenu (ROS). Ponadto zastosowanie prototypu opisanego w tej pracy zostało zweryfikowane poprzez porównanie wyników z komercyjnym urządzeniem PDT. W związku z tym ten prototyp terapii fotodynamicznej opartej na diodach LED stanowi dobrą alternatywę dla badań in vitro PDT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród najbardziej śmiertelnych chorób niezakaźnych, rak stanowi główną globalną przyczynę przedwczesnych zgonów. W 2020 roku było to prawie 10 milionów zgonów, co stanowi około jeden na sześć zgonów na całym świecie1. Ponadto zjawisko oporności wielolekowej (MDR) stanowi ogromne zagrożenie dla zdrowia publicznego, ponieważ zatwierdzone protokoły chemioterapeutyczne nie osiągają etapów remisji w tym stanie klinicznym2. Komórki rakowe mogą rozwinąć oporność na chemioterapię poprzez kilka mechanizmów; jednak nadekspresja niektórych transporterów kasetowych wiążących ATP (ABC) - pomp wypływowych zależnych od ATP - jest uważana za główną przyczynę rozwoju MDR w mikrośrodowisku guza3. Oprócz MDR, inne powikłania nowotworowe, takie jak nawroty i przerzuty, wzmacniają pilną potrzebę opracowania i ulepszenia podejść terapeutycznych w celu przezwyciężenia tego wyzwania onkologicznego.

Lecznicze wykorzystanie światła jest praktykowane od wieków4, a terapia fotodynamiczna (PDT) reprezentuje klinicznie zatwierdzone podejście terapeutyczne dla guzów litych. PDT łączy w sobie podanie fotouczulacza (PS), a następnie naświetlanie światłem w celu wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS) w celu wywarcia selektywnej cytotoksyczności w komórkach nowotworowych. To podejście terapeutyczne jest lepsze od konwencjonalnych metod, w tym chirurgii, radioterapii i chemioterapii5; Jest to technika małoinwazyjna wykazująca niższą cytotoksyczność w tkankach łącznych6. Lekka aplikacja i akumulacja PS bezpośrednio w guzie lub jego mikrośrodowisku zapewniają precyzyjne celowanie, a co za tym idzie, niewielkie, niepożądane ogólnoustrojowe skutki uboczne7 oraz możliwość powtórzenia leczenia w tym samym miejscu. Co więcej, koszt jest niższy niż w przypadku innych podejść. Ze względu na swoje obiecujące cechy, PDT może być uważana za odpowiednią opcję zarówno dla pojedynczego, zwłaszcza w przypadku guzów nieoperacyjnych, jak i uzupełniającego leczenia raka7, i stanowi alternatywę dla MDR związanego z chemioterapią8,9.

Pierwszy raport pokazujący wysoki wskaźnik obiektywnych odpowiedzi przy użyciu PDT został opisany w 1975 roku w modelu myszy i szczura10. Od tego czasu przeprowadzono badania z użyciem PDT z pozytywnymi wynikami7 zarówno in vivo, jak i in vitro z ludzkimi liniami komórek nowotworowych w hodowli komórkowej 2D11,12. Biorąc pod uwagę szerokie zastosowanie klinicznie zatwierdzonych PS, niezależnie od ich specyficznych szlaków akumulacji i zakresów długości fal pików absorpcyjnych, ogólny proces jest następujący: (i) wychwyt PS, (ii) szczyt stężenia PS w guzie lub jego mikrośrodowisku, (iii) zastosowanie światła, (iv) interakcja PS-światło, (v) transfer energii stanu wzbudzonego PS do substratu tkankowego lub otaczających cząsteczek tlenu, (vi) produkcja ROS z udziałem tlenu singletowego lub anionu ponadtlenkowego, (vii) śmierć komórek nowotworowych poprzez zasadniczo martwicę lub apoptozę (śmierć bezpośrednia), autofagię (mechanizm cytoprotekcyjny), niedokrwienie tkanek (uszkodzenie naczyń krwionośnych), modulację immunologiczną lub nakładanie się tych mechanizmów7. W tym końcowym etapie aktywacja określonego szlaku śmierci komórki zależy od wielu czynników, takich jak charakterystyka komórki, projekt eksperymentu i, co najważniejsze, lokalizacja wewnątrzkomórkowa PS i ukierunkowane uszkodzenie związane z PDT13.

Verteporfin to PS drugiej generacji, zatwierdzony przez agencje regulacyjne do użytku klinicznego w Norwegii i Chinach do leczenia zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem7. Po podaniu dawki doniesiono, że ten prolek częściowo gromadzi się w mitochondriach14 i indukuje fosforylację tyrozyny białek komórkowych i fragmentację DNA, prowadząc do apoptozy komórek nowotworowych15,16. Po 24 godzinach inkubacji w celu internalizacji werteporfiny zaleca się protokół PDT wykorzystujący konfigurację długości fali 690 nm w celu osiągnięcia efektywnych poziomów transferu promieniowania elektromagnetycznego do sąsiednich cząsteczek7,17.

Jeśli chodzi o źródło światła dla PDT, klasyczne systemy laserów diodowych są zazwyczaj drogie, skomplikowane technicznie, przewymiarowane, a tym samym nieprzenośne18,19. W związku z jego profilem pojedynczej długości fali, który można również zaobserwować w urządzeniach PDT opartych na diodach LED, zapotrzebowanie na niezależne jednostki dla każdego zastosowania fotosensybilizatora sprawia, że wykorzystanie systemów lasera diodowego jest jeszcze bardziej złożone i ekonomicznie niewykonalne20,21. Dlatego wykorzystanie maszyn LED jest uważane za najbardziej obiecującą alternatywę nie tylko w celu rozwiązania problemów związanych z kosztami22 i konserwacją, ale także w celu zapewnienia wysokiej mocy wyjściowej i mniej szkodliwych23 i szersze możliwości oświetlenia24,25,26,27.

Pomimo potencjalnego wkładu, jaki sprzęt oparty na diodach LED może zaoferować do eksperymentów PDT28, większość opcji komercyjnych nadal ma wady, takie jak brak przenośności, wysokie koszty oraz skomplikowane projekty budowlane i eksploatacja29. Głównym celem tych prac było zaoferowanie prostego i niezawodnego narzędzia do oznaczania PDT in vitro. W tym artykule opisano PhotoACT, wbudowane przez nas urządzenie PDT oparte na diodach LED, które jest niedrogie, przyjazne dla użytkownika i przenośne. Jako dowód słuszności koncepcji, wykazano, że urządzenie to zwiększa cytotoksyczność werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D, a zatem może być wykorzystywane jako narzędzie badawcze w eksperymentach PDT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i oprogramowania użytego w tym protokole.

1. Budowa urządzenia

  1. Piła Płyty pilśniowe o średniej gęstości (MDF) o grubości 3 mm, aby uzyskać kawałki o wymiarach pokazanych w Rysunek 1A.
    UWAGA: Użyj pliku wektorowego (Plik uzupełniający 1) do cięcia sterowanego numerycznie (CNC).
  2. Zbuduj dwa pudełka o następujących wymiarach (długość x szerokość x wysokość): 330 mm x 235 mm x 225 mm dla większych pudełek i 300 mm x 220 mm x 150 m dla mniejszych pudełek (Rysunek 1B).
  3. Wywierć tył większego pudełka, aby zainstalować złącze podnośnika baryłkowego. Wywierć górną część większej skrzynki, a następnie górną i dolną część mniejszego pudełka, aby zapewnić przejście dla elektrycznych (Rysunek 1C).
  4. Pomaluj wszystkie wewnętrzne powierzchnie czarnym tuszem, aby zapewnić jednorodne padanie światła (Rysunek 1D).
  5. Przymocuj równolegle trzy taśmy LED po 10 diod LED każda na górnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka (Rysunek 1E).
  6. Zainstaluj czujnik jasności na środku dolnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka (Rysunek 1F).
  7. Wydrukuj strukturę jednostki sterującej (Rysunek 1G) za pomocą pliku do druku 3D (plik uzupełniający 2).
  8. Zainstaluj wszystkie komponenty (przycisk zasilania, potencjometry, touchpad czasu/startu, diody LED, czujnik jasności, wyświetlacz LCD, brzęczyk i zasilacz) w portach płyty sterującej ESP32 zamontowanej we wnętrzu jednostki sterującej (Rysunek 2).
  9. Prześlij kod programowania (plik uzupełniający 3, plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5) i uruchom test, aby sprawdzić, czy wszystkie połączenia działają (Rysunek 1H).
  10. Zmontuj pudełka i przymocuj je razem, aby uniknąć szczelin, a co za tym idzie zakłóceń światła zewnętrznego i utraty emitowanego światła. Przymocuj zamontowaną jednostkę sterującą do wywierconego obszaru w górnej części prototypu (Rysunek 1I).
  11. Zamocuj drzwi wejściowe z tego samego materiału i wymiarach 330 mm x 225 mm (długość x szerokość) na większej skrzynce za pomocą dwóch małych zawiasów. Przymocuj również taśmy rzepowe bokiem do większego pudełka, aby wzmocnić prototypowe zamknięcie (Rysunek 1J). Zamontuj uchwyt, aby manipulować przednimi drzwiami urządzenia.
  12. Przymocuj cztery gumowe podkładki pod stopy na spodzie prototypu, aby zapewnić większą stabilność podczas operacji (Rysunek 1K).

2. Linie komórkowe: uprawa, siew i leczenie

  1. chemikalia
    1. Rozpuścić porfirynę w dimetylosulfotlenku (DMSO) do uzyskania stężenia 100 mM.
      UWAGA: Z DMSO należy obchodzić się ostrożnie (obchodzenie się z użyciem środków ochrony osobistej i w przewiewnym pomieszczeniu). Ostrożnie manipuluj zarówno roztworami podstawowymi, jak i rozcieńczonymi, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na światło.
  2. Linie komórkowe
    1. Hoduj linię komórkową HeLa w pożywce o niskiej glukozie Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% gentamycyny.
    2. Kolby hodowlane należy przechowywać w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    3. Zarządzaj komórkami i sprawdzaj je, aż osiągną zbieżność 80%-90%.
  3. Proces wysiewu
    1. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby.
    2. Umyj monowarstwę ogniw PBS.
    3. Odłączyć zlewającą się hodowlę komórkową za pomocą trypsyny-EDTA (0,5%) 1x na 5 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać działanie trypsyny poprzez ponowne wyparcie komórek pożywką hodowlaną uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% gentamycyną.
    4. Policz zawieszone komórki za pomocą hemocytometru i umieść je na 96-dołkowej płytce w 2,0 × 104 komórkach / dołku.
    5. Przygotuj dwie płytki na ciemne i jasne warunki.
    6. Inkubować płytki przez 24 godziny w celu przyłączenia komórek.
  4. Proces leczenia
    1. Usuń pożywkę z obu płytek 96-dołkowych.
    2. Potraktuj komórki 100 μl o rosnącym stężeniu werteporfiny (0,045 do 24 μM, rozcieńczenie seryjne).
    3. Inkubować komórki z leczeniem farmakologicznym przez 24 godziny, aby umożliwić internalizację werteporfiny.
    4. Po 24 godzinach wyrzucić pożywkę zawierającą lek, przemyć monowarstwę komórek PBS (100 μl) i dodać pożywkę wolną od leku (100 μl).
    5. Przykryj jedną mikropłytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem i inkubuj przez 24 godziny. Ta tabliczka dostarczy danych kontrolnych dla wyników PDT (stan ciemny). Druga mikropłytka zostanie wykorzystana do warunków ekspozycji na światło w urządzeniu.

3. Działanie urządzenia

  1. Podłącz urządzenie PDT do gniazdka elektrycznego i włącz je, naciskając przycisk zasilania.
  2. Umieść drugą mikropłytkę (stan światła) w urządzeniu PDT i zamknij urządzenie, przypinając przednie drzwiczki za pomocą taśm rzepowych.
  3. Za pomocą potencjometrów dostosuj konfigurację RGB (eksperyment RGB 255, 255, 255 tutaj) i ustaw kolor emisji światła.
    UWAGA: Każda kombinacja RGB ma określone widmo emisyjne, które należy dostosować do eksperymentów z różnymi fotouczulaczami, a co za tym idzie, różnymi krzywymi absorbancji.
  4. Naciśnij panel dotykowy (+)/(-), aby dostosować konfigurację czasu (tutaj eksperyment 60-minutowy) i ustawić czas trwania testu.
    UWAGA: Konfiguracja czasu, w połączeniu z wartością natężenia promieniowania, określi płynność procesu - dawkę światła zastosowaną w teście.
  5. Sprawdź informacje o konfiguracji na wyświetlaczu.
  6. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć test. Upewnij się, że na początku testu słychać brzęczyk z jednym sygnałem dźwiękowym.
  7. W trakcie eksperymentu obserwuj informacje w czasie rzeczywistym na wyświetlaczu, takie jak natężenie promieniowania i pozostały czas.
  8. Nie otwieraj drzwi wejściowych ani nie zmieniaj żadnej konfiguracji podczas testu PDT.
  9. Pod koniec testu poczekaj na sygnał dźwiękowy wyemitujący cztery sygnały dźwiękowe i na wyłączenie wszystkich diod LED przez system elektroniczny. Obserwuj na wyświetlaczu komunikat Zakończono i ostateczną ilość zużytej energii - fluencję - podczas eksperymentu.
    UWAGA: Końcowa wartość fluencji jest obliczana za pomocą równania (1):
    figure-protocol-1 (1)
    Gdzie F równa się J/cm2, a I równa się mW/cm2 lub mJ/s·cm2. Wartość natężenia promieniowania uwzględnia moc diod LED (źródło emitujące) i równomiernie naświetlany obszar ciemnej komory (660 cm2) (równanie [2]):
    figure-protocol-2 (2)
    Teoretyczna wartość natężenia promieniowania jest wyświetlana na wyświetlaczu urządzenia przez cały czas trwania testu PDT. Na koniec operacji użyj równania (3), aby obliczyć fluencję:
    Fluencja (F) = natężenie promieniowania (I, wartość stała) × czas pracy (s) (3)

4. Test żywotności komórek

  1. Po wykonaniu testu PDT przykryj mikropłytkę, która była wystawiona na działanie światła i inkubuj przez 24 godziny.
  2. Po okresie inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z obu płytek, przemyć monowarstwę komórek PBS (100 μl) i dodać roztwór MTT (0,5 mg/ml, 100 μl). Inkubować obie płytki - w ciemności i świetle - przez 4 godziny, aby umożliwić tworzenie się kryształów formazanu.
  3. Ostrożnie usunąć roztwór MTT i rozpuścić fioletowe kryształy w roztworze DMSO/etanolu (1:1).
  4. Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów przeprowadzić pomiar absorbancji za pomocą czytnika mikropłytek przy 595 nm.
    UWAGA: Urządzenie może być używane w innych ważnych eksperymentach, takich jak śmierć komórki za pośrednictwem ROS wywołana przez fotouczulacze po ekspozycji na światło za pomocą cytometrii przepływowej30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie urządzenie PDT, nazwane PhotoACT, zawierało ciemną komorę do przydzielenia do czterech wielodołkowych mikropłytek, z górną powierzchnią wewnętrzną wyposażoną w zestaw 30 rozproszonych diod LED zaprogramowanych do emitowania różnych widm światła widzialnego (Rysunek 3 i Plik uzupełniający 6). Urządzenie zostało zbudowane przy użyciu dwóch powiązanych ze sobą skrzynek: wewnętrznej skrzynki zaprojektowanej jako ciemna komora do testów PDT oraz zewnętrznej skrzynki do p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostateczne urządzenie PhotoACT było wygodne do zbudowania z dostępnych na rynku, tanich komponentów za łączny koszt poniżej 50 USD. Dodatkowe zalety to niskie wymagania konserwacyjne, możliwość napromieniania wielu rodzajów płytek hodowlanych, jednoczesne stosowanie do czterech jednostek na test, niska waga (2 kg)/rozmiar (44 cm3), która umożliwia przenośność, dokładne i powtarzalne napromieniowanie (dane nie są pokazane) oraz przyjazny dla użytkownika i prosty interfejs konfiguracji, który nie wymaga połączen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Arthurowi Henrique Gomesowi de Oliveira i Lucasowi Julianowi Cruzowi Gomesowi za pomoc w procesie filmowania. Projekt ten był wspierany przez Brazylijską Radę ds. Badań Naukowych (CNPq, numery grantów 400953/2016-1-404286/2021-6) oraz Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Badanie to zostało również częściowo sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% Trypsyna-EDTA (10x)Gibco15400054Odczynnik do dysocjacji hodowli komórek ssaków
Drukarka 3DFlashforgeFinder model
96-dołkowe Niesterylne, polistyrenowe i o wysokim poziomie wiązania płytki powierzchniowe z płaskim dnem używane do hodowli komórkowych 2D
Czujnik
Model TSL2561 z poziomami detekcji 0,1-40,000+ luksów i interfejsem I2C Przyciski
Brzęczyk
KolbySterylna, polistyrenowa, prostokątna kolba dolna z powierzchnią poddaną kulturom tkankowym (TC), pochyloną szyjką i nasadką odpowietrzającą (rozmiary)
ProbówkiwirówkoweSterylne, polipropylenowe probówki o pojemności 15/50 ml używane do rozcieńczania kultur komórkowych na etapie wysiewu testu
CO2 Płyta sterująca inkubatora
OprogramowanieESP32
TrimbleSketchUp
DMEM o wysokiej zawartości glukozyGibco11965092DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) jest szeroko stosowanym podłożem podstawowym do wspomagania wzrostu wielu różnych komórek ssaków.
DMSOSigma-AldrichD4540-500MLDimetylosulfotlenek, ≥ 99,5% (GC), nadaje się do hodowli komórek roślinnych
Surowica bydlęca płodu Gibco12657029FBS zapewnia najlepszą wartość, zapewniając spójność wzrostu komórek w czasie i przejściach.
Gentamycyna (50 mg/ml)Gibco15750060Antybiotyk rozpuszczalny w wodzie, pierwotnie oczyszczony z grzyba  Micromonospora purpurea. Gentamycyna działa poprzez zapobieganie zanieczyszczeniu kultur komórkowych
HemocytometrKomora o wzorze Neubauera używana do zliczania komórek na etapie wysiewu testu
Odwrócony mikroskop laboratoryjnyLeicaDM IL
LED OkapKabina zaprojektowana w celu ochrony środowiska pracy przed zanieczyszczeniami poprzez utrzymanie stałego, jednokierunkowego przepływu powietrza przefiltrowanego przez HEPA nad pracą obszar. Stosowany na kilku etapach hodowli komórek i procedur zabiegowych
Wyświetlacz
model LED RGB WS28125050 RGB SMD z wbudowanym procesorem. Taśma z 30 diodami LED, długością 1 metra i mocą 9 W Płyty
pilśniowe MDFPłyty pilśniowe o grubości 3 mm Płyty pilśniowe o średniej gęstości
ProbówkiSterylne, polipropylenowe probówki z pokrywką zabezpieczającą o pojemności 1,5/2,0 mL. Wygodne narzędzia do manipulowania małymi objętościami na etapie obróbki testu Czytnik
mikropłytekTermoFischerMultiskan FC Fotometr mikropłytkowy przeznaczony do wykrywania szerokiego zakresu długości fal (340-850 nm). Sprzęt wykorzystano do oceny żywotności komórek po inkubacji MTT.
Odczynnik MTTInvitrogenM6494bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium. Używany do testów żywotności komórek
Operational SystemReal Time Engineers ltd.
P10
P1000Nieelektroniczna, jednokanałowa, 10-1000 μ
MikropipetaNieelektroniczna, jednokanałowa, 20-200 μ L pojemność
Sprzęt PDTLumaCareModel LC-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4Gibco10010031Zrównoważona formuła soli stosowana do mycia komórek podczas hodowli i procedur testowych
Potencjometry
KońcówkiNiesterylne, uniwersalne dopasowanie, 10/200/1000 μ L maksymalne objętości
VerteporfinSigma-AldrichSML0534-5MGVerteporfin, ≥ 94% (HPLC)
jasności Arduino do hodowli komórkowych projektowe z przepływem laminarnym : LCD, do mikrowirówek Micripipet FreeRTOS Nieelektroniczny, jednokanałowy, 1-10 μMikropipeta o pojemności L P200 o pojemności L

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
  2. Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
  3. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
  4. Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
  5. Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
  6. Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
  7. Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447(2021).
  8. Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91(2019).
  9. Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
  10. Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
  11. Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
  12. Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
  13. Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
  14. Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
  15. Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
  16. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
  17. Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
  18. Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
  19. Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
  20. Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
  21. Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
  22. Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323(2022).
  23. Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
  24. Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
  25. Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
  26. Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
  27. Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
  28. Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
  29. Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719(2022).
  30. Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474(2019).
  31. T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
  32. LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
  33. W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenie oparte na diodach LEDdwuwymiarowa hodowla kom rekbadanie fotosensybilizatoralinia kom rkowa HeLareaktywne formy tlenutest MTTcytometria przep ywowaekspozycja na wiat o

Powiązane artykuły