Artykuł metodologiczny

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64392

⸱

6 października 2022

 , 
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Chan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania i oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice oraz ich zastosowanie w testach rozszczepienia in vitro.

Streszczenie

Kaspazy to bardzo specyficzne proteazy śmierci komórkowej, które biorą udział w procesach apoptotycznych i nieapoptotycznych. Podczas gdy rola kaspaz podczas apoptozy została bardzo dobrze zdefiniowana i zidentyfikowano i scharakteryzowano wiele apoptotycznych substratów proteolitycznych kaspaz, rola kaspaz w procesach nieapoptotycznych nie jest dobrze poznana. W szczególności do tej pory zidentyfikowano niewiele nieapoptotycznych substratów kaspaz. Tutaj, w celu ułatwienia identyfikacji i charakterystyki potencjalnych substratów kaspazy, opisano protokół, który umożliwia testowanie potencjalnych substratów w testach rozszczepienia kaspazy in vitro. Protokół ten obejmuje produkcję i oczyszczanie rekombinowanych białek kaspazy, wytwarzanie substratów kandydujących w sposób rekombinowany lub w bezkomórkowym systemie ekspresji oraz rzeczywistą reakcję rozszczepienia in vitro, po której następuje SDS-PAGE i immunoblotting. Protokół ten jest dostosowany do kaspaz Drosophila Dronc i Drice, ale można go łatwo dostosować do kaspaz innych organizmów, w tym ssaków.

Wprowadzenie

Programowana śmierć komórki lub apoptoza jest wykonywana przez klasę wysoce wyspecjalizowanych proteaz śmierci komórkowej zwanych kaspazami (przejrzane w Reference1). Kaspazy to proteazy Cys, które zawierają resztę Cys w miejscu katalitycznym. Zdefiniowali oni zgodne miejsca rozszczepienia i rozszczepiają substraty proteolitycznie po resztach Asp (chociaż donoszono również, że kaspaza Drosophila Dronc rozszczepia się po resztach Glu2). Dzielą się one na kaspazy inicjujące (znane również jako wierzchołkowe lub upstreamowe) i efektorowe (egzekucyjne lub końcowe). Kaspazy inicjujące aktywują kaspazy efektorowe. Na przykład u ssaków kaspaza inicjująca kaspaza-9 rozszczepia i aktywuje kaspazę efektorową kaspazę-33. Podobnie u Drosophila melanogaster ortolog kaspazy-9 Dronc rozszczepia i aktywuje ortolog kaspazy-3 Drice2,4. Podczas apoptozy kaspazy efektorowe rozszczepiają setki substratów, co prowadzi do śmierci komórki5.

Kaspazy są syntetyzowane w komórce jako nieaktywne proenzymy (zymogeny). W tej formie zawierają N-końcową prodomenę, dużą podjednostkę z katalitycznym Cys w centralnej części proenzymu i małą podjednostkę na C-końcu classus1 (Rysunek 1). Mechanizm aktywacji jest różny między kaspazami inicjatora i efektora. Kaspazy inicjujące (Kaspaza-9, Dronc) wymagają dimeryzacji do aktywacji, która zachodzi przez włączenie do dużego kompleksu białkowego, określanego jako klasa apoptosome6. W celu włączenia do apoptosomu, kaspaza-9 i Dronc przenoszą domenę aktywacji i rekrutacji kaspazy (CARD) w N-końcowej prodomenie (Rysunek 1). Komponent apoptosomu Apaf-1 zawiera również CARD i rekrutuje Kaspazę-9 lub Dronc poprzez interakcję CARD/CARD do apoptosomu3,6,7. Podczas gdy kaspaza-9 i Dronc mogą być proteolitycznie przetwarzane w apoptosomie, przetwarzanie to nie jest w pełni wymagane dla aktywności enzymatycznej8,9.

Natomiast kaspazy efektorowe (Kaspaza-3, Drice) nie posiadają CARD w swoich prodomenach i nie są włączane do dużych kompleksów białkowych w celu aktywacji1. Są one zależne od rozszczepienia proteolitycznego odpowiednio przez aktywną kaspazę-9 lub Dronc1. Aktywna kaspaza efektorowa tworzy tetramer złożony z dwóch dużych i dwóch małych podjednostek, a zatem zawiera dwa miejsca katalityczne (Rysunek 1). Co ważne dla tego protokołu, rekombinowana ekspresja kaspaz w E. coli powoduje automatyczne przetwarzanie i aktywację kaspaz, w tym Drice10 i Dronc2,8,9,11,12, nawet w przypadku braku Apaf-1. To automatyczne przetwarzanie pozwala na przeprowadzanie testów rozszczepienia in vitro potencjalnych substratów z rekombinowanym białkiem kaspazy.

Kaspazy nie tylko biorą udział w apoptozie, ale mogą również pełnić wiele funkcji nieapoptotycznych, w tym proliferację, różnicowanie, migrację komórek, przycinanie neuronów, odporność wrodzoną i inne13,14,15. Obecnie nie wiadomo, w jaki sposób komórki mogą przetrwać pomimo zawierania aktywnych kaspaz podczas procesów nieapoptotycznych. Możliwe, że komórki te aktywują kaspazy tylko na poziomach subletalnych16 lub sekwestrują aktywne kaspazy w nieapoptotycznych przedziałach komórki, takich jak błona plazmatyczna17,18. Dlatego identyfikacja i weryfikacja substratów nieapoptotycznych nie tylko ujawni, w jaki sposób kaspazy pośredniczą w procesach nieapoptotycznych, ale może również pomóc zrozumieć, w jaki sposób komórki mogą przetrwać w obecności aktywnych kaspaz.

Białka kandydujące jako substraty kaspazy mogą być identyfikowane za pomocą metod genetycznych i biochemicznych. Zidentyfikowane białka można sprawdzić pod kątem obecności uzgodnionych miejsc rozszczepienia Dronc. Można to zrobić, dokonując wizualnej kontroli sekwencji białka lub korzystając z bardziej zaawansowanych narzędzi bioinformatycznych online, takich jak CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Narzędzia te wykorzystują znane konsensusowe miejsca cięcia kaspaz i względy strukturalne do przewidywania nowych celów kaspaz. Chociaż CasCleave zawiera informacje o zweryfikowanych substratach z ludzkich kaspaz-1, -3, -6, -7 i -8, może być jednak również przydatny do opisanych tutaj celów, ponieważ te kaspazy i ich konsensusowe miejsca cięcia są dobrze zachowane. Ponieważ jednak miejsce cięcia Dronc nie jest dobrze zdefiniowane (dwa badania zidentyfikowały dwa różne optymalne miejsca rozszczepienia, TATD/E2 i LALD9), potencjalne substraty są również badane pod kątem obecności innych miejsc rozszczepienia kaspazy, w tym Drice.

Aby zweryfikować przewidywane substraty kaspaz, konieczne są dodatkowe testy. Jednym z tych testów jest wykazanie, że dana kaspaza może faktycznie rozszczepić białko kandydujące in vitro. W tym miejscu zapewniamy wygodny protokół do testów rozszczepienia kaspazy in vitro. Korzystając z tego protokołu, potencjalne substraty są testowane z Dronc jako kaspazą. Mogą być również testowane jako substraty Drice. Chociaż protokół ten został napisany dla kaspaz Drosophila Dronc i Drice, można go również dostosować do kaspaz z innych organizmów.

Ekstrakcja i oczyszczanie Dronc i Drice wraz z testem rozszczepienia in vitro muszą być przeprowadzone tego samego dnia ze względu na utratę aktywności katalitycznej przez te kaspazy. Ten protokół został zmodyfikowany i zoptymalizowany w stosunku do poprzednich publikacji8,9,11,12,21,22. W tym protokole cztery różne białka kaspazy ulegają rekombinacyjnej ekspresji w szczepzie E. coli BL21 (DE3) pLysS. Białka te to: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt i 6xHis-DriceC211A. Każde z tych białek jest znakowane 6 resztami histydyny (6xHis) na N-końcu w celu oczyszczenia. Droncwt i Dricewt są białkami typu dzikiego i mogą automatycznie przekształcać się w aktywną kaspazę po rekombinowanej ekspresji. DroncC318A i DriceC211A kodują zmutowane formy Dronc i Drice, które zmieniają katalityczną resztę Cys w resztę Ala. Konstrukcje te są katalitycznie nieaktywne i nie mogą być automatycznie przetwarzane (patrz Rysunek 2A). Są one używane jako kontrole w teście rozszczepienia. Ponieważ DriceC211A nie może być przetwarzany automatycznie, jest on również używany jako substrat modelowy dla Droncwt w opisanym tutaj teście rozszczepienia in vitro.

Protokół

1. Ekspresja rekombinowanej kaspazy u bakterii

  1. Sklonuj interesujący nas gen (kaspaza lub przypuszczalny substrat) do bakteryjnego wektora ekspresyjnego ze znacznikiem N- i/lub C-końcowym przy użyciu standardowych protokołów23.
    UWAGA: Znaczniki mogą zwiększać rozpuszczalność rekombinowanych białek i są używane do oczyszczania rekombinowanych białek. Tutaj Dronc, Drice i ich katalityczne mutanty są klonowane do wektora pET28a, który zapewnia N-końcowy znacznik 6xHis (pET28a-6xHis-Droncwt, pET28a-6xHis-DroncC318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (informacje na temat podkładu znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1).
  2. Przekształć wektory z interesującymi genami w kompetentne komórki BL21 (DE3) pLysS E. coli przy użyciu standardowych procedur23,24. Mieszaninę transformacyjną należy umieścić na płytkach agarowych LB z odpowiednim antybiotykiem (kanamycyną w przypadku pET28a) w celu wyselekcjonowania przekształconych bakterii. (Patrz Tabela Uzupełniająca 2.)
  3. Wybrać kolonię z płytki i zaszczepić w 5 ml pożywki LB zawierającej odpowiedni antybiotyk, aby rosła przez noc w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min na platformie wstrząsającej.
  4. Następnego dnia przygotuj 30-50 ml (na próbkę) pożywki LB z antybiotykiem i dodaj 1 ml kultury wyhodowanej przez noc. Gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) przy użyciu biofotometru/spektrofotometru powinna wynosić od 0,1 do 0,2.
  5. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min na platformie wytrząsającej, aż OD600 osiągnie 0,6. Sprawdzaj OD600 co godzinę, aż osiągnie 0.6. Trwa to około 2 do 3 godzin.
  6. Aby indukować ekspresję białka (kaspazy), dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1-0,2 mM (rozcieńczyć 1:1,000-1:500 z materiału wyjściowego IPTG, patrz Tabela uzupełniająca 2).
  7. Hodować kultury przez 3 godziny w temperaturze 30 °C przy 220 obr./min.
    UWAGA: Czas i temperatura zależą od rodzaju białka, które ulega ekspresji i jego rozpuszczalności. Warunki te mogą wymagać dostosowania, jeśli wyrażane są różne kaspazy lub substraty.
  8. Po 3 godzinach odwirować kultury w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przy 2 000 x g. Odrzucić supernatant i przystąpić do osadu.
    UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym momencie i kontynuować później. Granulki bakteryjne można zamrażać w temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja rekombinowanych kaspaz na małą skalę

  1. Wyjmij zamrożone probówki z granulowanymi kulturami z przechowywania w temperaturze -80 °C i trzymaj je na lodzie przez 10 minut, aby zmiękczyć granulki.
  2. Po 10 minutach dodać 0,6 ml buforu do lizy komórek bakteryjnych (Tabela uzupełniająca 2) uzupełnionego świeżo dodanymi inhibitorami proteazy, 10 mg/ml lizozymu i 50 U/ml benzonazy do probówek zawierających osady za pomocą kontrolera pipet z pipetą serologiczną o pojemności 1 ml.
  3. Za pomocą tej samej końcówki pipety rozpuść osad, pipetując w górę i w dół, aż do uzyskania klarownego bladożółtego roztworu bez żadnych cząstek osadu. Inkubować przez 30 minut na lodzie.
  4. Przenieść lizat do odpowiednich probówek wirówkowych i odwirować lizaty przy 17 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść supernatanty do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Jest to surowy ekstrakt zawierający kaspazy.
  6. Trzymaj probówki na lodzie i przystąp do oczyszczania agarozą Ni-NTA.

3. Oczyszczanie kaspaz na małą skalę oznaczone przez His-tagged

  1. Dodać 0,2 ml 50% zawiesiny agarozy Ni-NTA do każdej probówki ekstraktów kaspazy z kroku 2.5. Obracać rurki na rotatorze typu "koniec do końca" przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  2. Po 1 godzinie dodać ekstrakt z agarozą Ni-NTA do 1 ml kolumn polipropylenowych z nienaruszoną końcówką, umieszczonych w stojaku. Odstaw na 5 minut.
  3. Po 5 minutach zdjąć nasadkę kolumn i pozwolić, aby supernatant wypłynął grawitacyjnie.
  4. Ostrożnie dodać 1 ml buforu do przemywania (tabela uzupełniająca 2) do kolumn, nie naruszając wypełnionej żywicy agarozy Ni-NTA i przepłukać ją przez przepływ grawitacyjny.
  5. Wykonaj krok prania trzy razy.
  6. W celu wymowania kaspaz umieścić 1,5 ml probówek mikrowirówek pod dyszą zbiorczą kolumn po całkowitym opróżnieniu buforu płuczącego.
  7. Dodać 0,5 ml buforu elucyjnego (uzupełnionego 1x inhibitorami proteazy bezpośrednio przed użyciem) do każdej kolumny i zebrać eluat w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Drobno oczyszczony eluat będzie miał przezroczysty kolor.
  8. Trzymaj eluaty na lodzie i zmierz stężenie białek za pomocą testu Bradforda25. Potwierdź czystość/jednorodność oczyszczonych kaspaz za pomocą SDS-PAGE, a następnie Coomassie Blue staining26.
    UWAGA: Wydajność hodowli 50 ml LB waha się od 0,5 do 1,5 mg białka kaspazy. Biorąc pod uwagę, że do elucji stosuje się 0,5 ml buforu elucyjnego, stężenie waha się od 1 do 3 mg/ml. Ważne jest, aby używać oczyszczonych eluatów kaspazy do testów rozszczepienia in vitro w tym samym dniu lizy i oczyszczania, ponieważ te preparaty kaspazy tracą aktywność w ciągu nocy.

4. Ekspresja przypuszczalnego substratu kaspazy w bezkomórkowych systemach ekspresyjnych

UWAGA: W tym protokole, Drice, naturalny substrat Dronc, jest przygotowywany zarówno przez rekombinowaną ekspresję w E. coli (patrz sekcja 3 powyżej), jak i przez ekspresję w lizacie retikulocytów królika (RRL), systemie ekspresji wolnym od komórek ssaków (ta sekcja, patrz poniżej).

  1. Sklonuj gen domniemanego substratu do wektora ekspresyjnego zawierającego promotor T7, T3 lub SP6 przy użyciu standardowych procedur23.
    UWAGA: W tym protokole DriceC211A jest używany jako substrat modelowy i został sklonowany do wektora pT7CFE1-N-Myc, który przenosi promotor T7 do ekspresji genów i znakuje domniemany substrat białkowy N-końcowym znacznikiem Myc w celu wykrycia przez immunoblotting.
  2. W RRL substraty kandydujące mogą być syntetyzowane zarówno radioaktywnie, jak i nieradioaktywnie.
    1. Synteza nieradioaktywna: Do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml dodać 25 μl RRL, 2 μl buforu reakcyjnego, 0,5 μl mieszaniny aminokwasów -minus leucyna (1 mM), 0,5 μl mieszaniny aminokwasów minus metionina (1 mM), 1 μl inhibitora rybonukleazy (40 U/μL), 2 μL matrycy DNA (0,5 μg/μL), i 1 μl polimerazy T7-RNA. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby dostosować końcową objętość reakcji do 50 μl. Delikatnie wymieszać składniki, pipetując lub mieszając końcówką pipety, a następnie krótko odkręcić.
      UWAGA: Lizat RRL zawiera 100-200 mg/ml białek endogennych. W przypadku reakcji translacji in vitro dodać RRL w stężeniu 50% (tutaj 25 μL/50 μL reakcji).
    2. Synteza radioaktywna: W probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml dodaj 25 μl lizatu RRL, 2 μl buforu reakcyjnego, 0,5 μl mieszaniny aminokwasów minus metioniny (1 mM), 1 μl inhibitora rybonukleazy (40 U/μL), 2 μl matrycy DNA (0,5 μg/μL), 2 μL SMetionina znakowana 35 (1000 Ci/mmol przy 10 mCi/ml) i 1 μl polimerazy T7-RNA. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby dostosować końcową objętość reakcji do 50 μl. Delikatnie wymieszać składniki, pipetując lub mieszając końcówką pipety, a następnie krótko odwirować. Wyrzuć końcówki i rurki do pojemnika na odpady radioaktywne.
      UWAGA: Nie dodawaj mieszaniny aminokwasów bez leucyny. Wektor pT7CFE1 wykorzystuje promotor T7 do ekspresji białek. Inne wektory używają promotorów T3 lub SP6. W takim przypadku zamiast polimerazy RNA T7 należy użyć polimeraz RNA T3 lub SP6. Upewnij się, że matryca DNA jest wysokiej czystości.
  3. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 90 minut.
  4. Wiruj krótko przez 10 s i umieść probówki na lodzie. Sprawdź poziom ekspresji przypuszczalnego substratu w RRL za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu/autoradiografii.
    UWAGA: Ilość ekstraktu RRL dodanego do reakcji rozszczepienia powinna być oparta na ilości białka, które można wykryć za pomocą metody wykrywania (immunoblotting lub S35 autoradiografia). Przystąpić do testu rozszczepienia in vitro (następna sekcja) lub przechowywać go w temperaturze -80 °C.

5. Test rozszczepienia in vitro z substratami wygenerowanymi za pomocą RRL

  1. Należy wziąć przypuszczalnie wygenerowany substrat lub substraty, jak opisano w sekcji 4. W tym protokole N-Myc-DriceC211A jest używany jako podłoże modelowe.
  2. W zależności od poziomu ekspresji przypuszczalnego substratu (do określenia oddzielnie za pomocą analizy immunoblot lub autoradiografii, patrz krok 4.4), należy użyć 1-10 μl RRL zaprogramowanego białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w teście rozszczepienia.
  3. Dodać 10 μg oczyszczonego białka kaspazy wytworzonego w sekcjach 1, 2 i 3.
  4. Doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 50 μl za pomocą buforu do oznaczania kaspazy.
  5. Reakcje inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 3 godziny. Upewnij się, że w teście rozszczepienia uwzględniono odpowiednie kontrole. W tym przypadku katalityczny mutant DroncC318A jest używany jako kontrola.
  6. Po 3 godzinach przerwij reakcje, przenosząc probówki na lód.
  7. Dodaj jeden wolumin bufora próbki LDS zawierającego 50 mM DTT. Reakcja zostaje całkowicie zatrzymana przez dodanie buforu do próbek LDS.
  8. Próbki inkubować w temperaturze 75 °C w bloku grzewczym przez 10 minut.
  9. Szybko odwirować, wymieszać przez trześnięcie, załadować 24 μl na próbkę i uruchomić SDS-PAGE (patrz rozdział 7) lub przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.

6. Test rozszczepienia in vitro z rekombinowanym białkiem substratowym o ekspresji bakteryjnej

  1. Dodać 10 μg oczyszczonego substratu kandydującego (tutaj 6xHis-DriceC211A, wygenerowanego w sekcjach 1, 2 i 3) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  2. Dodać 10 μg oczyszczonych białek kaspazy wytworzonych w sekcjach 1 i 2. Doprowadzić całkowitą objętość do 50 μl za pomocą buforu do oznaczania kaspazy.
  3. Wykonaj kroki od 5.5 do 5.9.

7. SDS-PAGE i immunoblotting

  1. Załaduj reakcje rozszczepienia (24 μL) na 4%-12% żele gradientowe Tris-Glycine lub Bis-Tris (Tabela materiałów) i wykonaj elektroforezę białek i immunoblotting (lub autoradiografię, jeśli używasz substratów znakowanych S35), aby zobrazować wyniki przy użyciu standardowych procedur27,28.
    UWAGA: Tutaj, w tym protokole, zastosowano żele gradientowe Bis-Tris z buforem uruchomionym Mops i buforem ładującym LDS. Ogólnie rzecz biorąc, powszechnie używane protokoły PAGE żeli Tris-Glycine działają przy użyciu bufora uruchomionego Tris-Glycine-SDS i bufora ładującego SDS.

Wyniki

Niniejszy protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące indukcji białka kaspazy w E. coli, oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice, syntezy potencjalnych substratów oraz reakcji cięcia in vitro z potencjalnymi substratami (w tym przypadku DriceC211A) i kaspazą Dronc. Mutant katalityczny DriceC211A został użyty jako substrat modelowy w tym teście, ponieważ nie wykazuje on aktywności autoprzetwarzania (Rysunek 2A) i zachowuje pełną długość aż do momentu cięcia przez Droncwt. DriceC211A należy zawsze stosować jako kontrolę pozytywną w celu potwierdzenia aktywności enzymatycznej preparatu Droncwt.

Rysunek 2A stanowi reprezentatywny przykład ekspresji i oczyszczania rekombinowanych kaspaz. Indukowano i oczyszczono cztery różne rekombinowane kaspazy: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricemasa cząsteczkowaoraz 6xHis-DriceC211AOczyszczone kaspazy poddano elektroforezie w żelu SDS-PAGE i analizie immunoblottingowej, a następnie przymiotowano błonę za pomocą przeciwciała anty-His (rozcieńczenie 1:5 000), a następnie przeciwciała anty-mysie IgG sprzężonego z HRP (1:10 000). Nieprzetworzone 6xHis-Dronc (proDronc) migruje przy względnej masie cząsteczkowej (MWr) o masie cząsteczkowej 55 kDa (ścieżka 2), natomiast nieprzetworzone 6xHis-Drice (proDrice) ma masę cząsteczkowąProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. o masie 35 kDa (ścieżka 4). Autoprocesowanie kaspaz jest widoczne poprzez pojawienie się prążków o mniejszej masie cząsteczkowejr które dzięki obecności znaczka His w końcu N-terminalnym reprezentują duże podjednostki kaspaz (Rysunek 1). W przypadku 6x-Dronc podjednostka duża ma masę cząsteczkową (MW)r o masie 40 kDa (ścieżka 1). Duża podjednostka 6x-Drice wędruje na wysokości 23 kDa (ścieżka 3). Mutanty katalityczne 6xHis-DroncC318A oraz 6xHis-DriceC211A nie ulegają autoproteolizie i są wykrywalne wyłącznie jako białka o pełnej długości (ścieżki 2 i 4).

Rycina 2B Aby wykazać, że bakteryjnie wyprodukowana i oczyszczona białka 6xHis-Droncwt w celu sprawdzenia, czy preparat wykazuje aktywność enzymatyczną, przeprowadzono test cięcia in vitro zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Jako kontrolę negatywną zastosowano mutant katalityczny 6xHis-DroncC318A. Substratem było białko N-Myc-Drice otrzymane w układzie RRL.C211A, który jest oznakowany znacznikiem Myc na N-końcu. Po in vitro w reakcji rozszczepienia białka rozdzielono za pomocą SDS-PAGE, wykonano immunoblotting, a następnie membrany inkubowano z przeciwciałem anty-Myc (rozcieńczenie 1:1 000), a następnie z przeciwciałem anty-mouse IgG sprzężonym z HRP (1:10 000), aby wykryć N-Myc-DriceC211APomyślne rozszczepienie, a tym samym aktywność enzymatyczna kaspazy, może zostać wykazana poprzez pojawienie się co najmniej jednego prążka o mniejszej masie cząsteczkowej (MW).r w porównaniu do pełnowymiarowej, nieprzetworzonej formy substratu. Nieprzetworzony, pełnowymiarowy N-Myc-DriceC211A ma masę cząsteczkową (MW)Prześlij tekst źródłowy, który chcesz przetłumaczyć. o masie 40 kDa (ścieżki 2 i 4), podczas gdy duża podjednostka przetworzonego białka N-Myc-DriceC211A przesuwa się na poziomie 30 kDa (ścieżka 3). Ścieżka 1 przedstawia nieprogramowany lizat RRL (bez dodanego plazmidu/transkryptu). Ścieżka 2 demonstruje in vitro produkcja DriceC211A poprzez ekspresję w układzie RRL. Ścieżka 3 zawiera in vitro reakcja cięcia z 6xHis-DroncwtŚcieżka 4 zawiera in vitro reakcja cięcia z 6xHis-DroncC318A.

Rycina 2C Reakcję cięcia in vitro z wykorzystaniem rekombinowanej i oczyszczonej kaspazy (6xHis-Droncwt oraz 6x-His-DroncC318A) i substratu (6xHis-DriceC211A) zgodnie z niniejszym protokołem, przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Do analizy reakcji cięcia w tym immunoblotcie zastosowano przeciwciało przeciwko rozszczepionej Drice (rozcieńczenie 1:5 000; następnie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z HRP (1:10 000)). Przeciwciało przeciwko rozszczepionej Drice wykrywa neoepitop w dużej podjednostce (23 kDa) 6xHis-DriceC211A wyłącznie po przetworzeniu przez 6xHis-Droncwt (ścieżka 1). Mutacja katalityczna 6xHis-DroncC318A nie jest w stanie przetworzyć 6xHis-DriceC211A w tym badaniu, a pełnowymiarowa 6xHis-DriceC211A pojawia się jako słaba, nieprzetworzona prążek o masie 35 kDa (ścieżka 2).

Schemat aktywacji kaspaz; przetwarzanie proKaspazy-3/9 przez Kaspazę-9; badanie mechanizmu apoptozy.
Rysunek 1: Struktura domen kaspaz inicjujących: Kaspazy-9 i Dronc oraz kaspaz efektorowych: Kaspazy-3 i Drice. CARD – domena aktywacji i rekrutacji kaspaz; Cys – względne położenie katalitycznego reszty cysteiny; L – podjednostka duża; S – podjednostka mała. Oznaczono położenie N-końcowych prodomen. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE; test cięcia białek; analiza proDronc i proDrice.
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki. (A) Analiza immunoblottingowa oczyszczonych preparatów rekombinowanych białek 6xHis-Dronc i 6xHis-Drice, z użyciem przeciwciała anty-His. Nieprzetworzone (proDronc i proDrice) oraz cięte formy 6xHis-Dronc i 6xHis-Drice zaznaczono strzałkami. Markery MW wskazano po lewej stronie. (B) Analiza immunoblottingowa reakcji cięcia in vitro N-Myc-Drice wytworzonego w układzie RRL z kaspazami 6xHis-Droncwt (ścieżka 3) lub 6x-His-DroncC318A (ścieżka 4), z użyciem przeciwciała anty-Myc. Reakcje RRL nieprogramowane i programowane (N-Myc-DriceC211A) naniesiono i rozdzielono w ścieżkach 1 i 2. Nieprzetworzony (proDrice) oraz cięty N-Myc-Drice zaznaczono strzałkami. Markery MW wskazano po lewej stronie. (C) Analiza immunoblottingowa reakcji cięcia in vitro bakteryjnie ekspresowanego i oczyszczonego rekombinowanego białka 6xHis-DriceC211A z kaspazami 6xHis-Droncwt (ścieżka 1) lub 6x-His-DroncC318A (ścieżka 2), z użyciem przeciwciała przeciwko ciętemu białku Drice. Pełnowymiarowy (proDrice) oraz cięty 6xHis-DriceC211A zaznaczono strzałkami. Markery MW wskazano po lewej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela ta zawiera primery użyte do klonowania w wektorze pET28a. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Tabela ta zawiera skład buforów i pożywek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Większość naszej wiedzy na temat kaspaz i funkcji kaspazy pochodzi z intensywnych prac nad apoptozą w ciągu ostatnich trzech dekad. Bardzo dobrze wiadomo, że kaspazy inicjujące proteolitycznie przetwarzają kaspazy efektorowe, a setki białek zidentyfikowano jako substraty kaspazy efektorowej podczas apoptozy 5,29. W przeciwieństwie do tego, znacznie mniej wiadomo o funkcji kaspaz w procesach nieapoptotycznych i o tym, jakie substraty nieapoptotyczne przetwarzają. Można sobie wyobrazić, że kluczowymi decydentami są tutaj kaspazy inicjatorów. Podczas apoptozy aktywują kaspazy efektorowe powodujące śmierć komórki. Jednak, aby wywołać procesy nieapoptotyczne, mogą aktywować różne białka (inne niż kaspazy efektorowe), które kontrolują proces nieapoptozyjny. W protokole tym testuje się białka kandydujące jako substraty kaspazy inicjującej Dronc u Drosophila 17,30.

Substraty, które mają być badane w teście rozszczepienia, mogą być wytwarzane albo w systemie ekspresji in vitro bez komórek ssaków, takim jak RRL, albo przez rekombinowaną ekspresję w E. coli. Istnieje kilka zalet ekspresji in vitro przy użyciu RRL w porównaniu z ekspresją bakteryjną. Protokół ekspresji RRL jest prosty i szybki, co pozwala na równoległe przygotowanie wielu różnych substratów. W wielu przypadkach ekstrakt RRL zawierający białko będące przedmiotem zainteresowania może być przechowywany w temperaturze -80 °C przed użyciem w teście rozszczepienia (chociaż należy to określić oddzielnie dla każdego substratu). Przypuszczalny substrat można oznaczyć za pomocą S35-Met, co umożliwia łatwą analizę za pomocą autoradiografii po SDS-PAGE. Jest to szczególnie przydatne, jeśli nie jest dostępne przeciwciało specyficzne dla substratu. Alternatywnie, jeśli znakowanie S35-Met nie jest pożądane, przypuszczalny substrat można oznaczyć typowymi znacznikami, takimi jak znaczniki Flag, HA lub Myc, co umożliwia wykrycie rozszczepienia kaspazy za pomocą immunoblottingu.

Należy z całą mocą podkreślić, że powodzenie tego protokołu zależy od starannego i konsekwentnego oczyszczania rekombinowanych białek Dronc i Drice. Niestety, białka te nie mogą być przechowywane – nawet przez krótki czas – ani w lodówce, ani zamrożone. Tracą aktywność enzymatyczną z dnia na dzień w dowolnej przechowywanej formie. Dlatego należy je przygotować na świeżo w dniu testu rozszczepienia. Niezależnie od badanego białka (białek) kandydującego(-ych), DriceC211A powinien być zawsze stosowany jako kontrola pozytywna w celu walidacji aktywności enzymatycznej preparatu Droncwt (patrz rysunek 2B, C). Alternatywnie, aktywność preparatów Dronc i Drice można również badać przez rozszczepianie in vitro fluorogenicznych syntetycznych substratów tetrapeptydowych 2,9,31.

Jeśli przeciwciała są używane do wykrywania potencjalnych substratów, muszą one zostać zwalidowane przez użytkownika32,33. Dotyczy to również dostępnych na rynku przeciwciał, które wykrywają znaczniki epitopów, takie jak Flag, HA, Myc lub inne. Niska jakość przeciwciał może przysłonić ważne wyniki. Zaleca się również podwójne znakowanie epitopów substratów kandydujących zarówno na końcu N, jak i C z różnymi znacznikami34. Jeśli dojdzie do rozszczepienia, podwójne znakowanie pomaga prześledzić oba produkty rozszczepienia i może pomóc w wyjaśnieniu, czy rozszczepienie występuje w jednym lub więcej miejscach.

Chociaż protokół ten z łatwością weryfikuje znany substrat biologiczny Dronc, Drice, istnieją również ograniczenia. Jednym z ograniczeń jest to, że jest to protokół in vitro z rekombinowanymi białkami. W tych testach kaspazy są obecne w niefizjologicznie wysokim stężeniu, co wynika z obserwacji, że mogą spontanicznie automatycznie przetwarzać się w E. coli. Spontaniczne autoprzetwarzanie zwykle nie zachodzi w warunkach fizjologicznych. To wysokie stężenie kaspazy może powodować fałszywą aktywność skutkującą fałszywie dodatnimi wynikami. Wyniki fałszywie dodatnie można wyeliminować poprzez obniżenie stężenia kaspazy w reakcji rozszczepienia in vitro . Ponadto, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej, konieczne są dodatkowe testy, aby potwierdzić autentyczne substraty i wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie.

Rekombinowane kaspazy mogą nie mieć takiej samej specyficzności, jak w swoim normalnym środowisku komórkowym in vivo. Na przykład aktywność kaspaz może być modyfikowana przez modyfikacje potranslacyjne. Nie są one obecne w rekombinowanych białkach. Ponadto in vivo kaspazy inicjujące, w tym Dronc, są włączane do dużych kompleksów białkowych, takich jak apoptosom. W warunkach tego protokołu nie dochodzi do powstania apoptosomu. Wymagałoby to rekombinowanej ekspresji Drosophila Apaf-1 (aka Dark lub Hac-1)35-37, która ma swoje własne wyzwania. Dlatego in vitro Dronc może nie mieć takiej samej specyficzności, jaką ma in vivo.

Możliwe jest również, że Dronc jest włączony do innego kompleksu białkowego dla procesów nieapoptotycznych. Może to nadawać Dronc inną specyficzność rozszczepienia, co może również wyjaśniać, dlaczego Dronc nie indukuje apoptozy w warunkach nieapoptotycznych. W związku z tym CasCleave wykorzystuje znane miejsca konsensusu rozszczepienia do przewidywania nowych substratów kaspazy. Nie wiadomo jednak, czy te same miejsca konsensusu rozszczepienia są również wykorzystywane w procesach nieapoptotycznych. W rzeczywistości niedawno wykazano, że kaspaza-3 zmienia swoje preferowane miejsce konsensusu podczas procesu nieapoptotycznego w rozwijającym się słuchowym pniu mózgu w zarodku pisklęcia38. Podobnie, jeśli kaspazy inicjujące są włączone do różnych kompleksów białkowych, mogą mieć różną specyficzność, a zatem mogą rozszczepiać się w różnych sekwencjach konsensusu.

Ograniczenia te pokazują, że nie wystarczy polegać wyłącznie na testach rozszczepienia in vitro opisanych w niniejszym protokole. W celu dalszej walidacji wyników uzyskanych przy użyciu tego protokołu należy zastosować alternatywne podejścia. Idealnie byłoby, gdyby testy in vivo były stosowane w celu odpowiedzi na następujące pytania: Czy białko kandydujące jest przetwarzane proteolitycznie podczas procesu nieapoptotycznego in vivo? Jeśli tak, to czy to samo miejsce rozszczepienia stosuje się in vivo i in vitro? Jakie są konsekwencje, jeśli rozszczepienie zostanie zablokowane przez mutagenezę miejsca rozszczepienia? Czy przetwarzanie substratu kandydującego jest zależne od kaspaz, a jeśli tak, to jakich? Jaka jest rola fragmentów rozszczepienia w procesie nieapoptozy? Na te pytania można łatwo odpowiedzieć w modelowych organizmach genetycznych, takich jak C. elegans i Drosophila, przy użyciu standardowych metod genetycznych i transgenicznych.

Podsumowując, protokół ten opisuje niezawodną i spójną metodę produkcji enzymatycznie aktywnych kaspaz, w szczególności kaspaz Drosophila Dronc i Drice. Ostatecznym celem tego protokołu jest zbadanie, czy Dronc może rozszczepiać potencjalne substraty in vitro, które zostały zidentyfikowane za pomocą podejść genetycznych, biochemicznych lub bioinformatycznych. Jak wyjaśniono w poprzednim akapicie, wymagane są dodatkowe testy, aby potwierdzić te białka jako substraty kaspazy in vivo. Biorąc pod uwagę stopień zachowania genów kaspazy w metazoa, powinno być możliwe dostosowanie tego protokołu również do kaspaz z innych organizmów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Elif Kamber-Kaya za pomoc w ustaleniu protokołu w laboratorium. Dr Guy Salvesen uprzejmie dostarczył mutanta DriceC211A9. Praca ta została sfinansowana z nagrody MIRA przyznanej przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) of the National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu o numerze 2R35GM118330. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AmpicillinFisherBP1760-25
Przeciwciało anty-HeSigma-AldrichMA1-21315
Przeciwciało anty-mysie IgG, przeciwciało sprzężone z HRPSygnalizacja komórkowa7076P2
Przeciwciało anty-MycSanta Cruz Biotechnologysc-40
Przeciwciało anty-królicze IgG, sygnalizacja komórkowa przeciwciała sprzężonego z HRP7074P2
Wirówka stołowaEppendorf5415 R
BenzonaseSigma-AldrichE1014-5KU
BioPhotometerEppendorf#6131
BL21 (DE3) pLysS Competent CellsPromegaL1195
Wirnik wirówkiBeckman CoulterJA-25.50
ROZDĘCIA Sigma-AldrichC3023-1G
ChemiDoc z oprogramowaniem do obrazowaniaBio-RadUniversal Hood IIDo obrazowania chemiluminescencji
Podłoże chemiluminescencyjneThermofisher Scientific34095Do obrazowania chemiluminescencji
Rozszczepiony Drosophila ICE (drICE) (Asp230)Technologia sygnalizacji komórek9478S
Kuwety jednorazoweFisher Scientific14955128Służy do pomiaru wzrostu bakterii i stężenia białek
Ditiothreitol (DTT)Bio-Rad#1610610
Kolby Erlenmeyera, 1000 mlMillipore sigmaCLS49801LDo przygotowania pożywki agarowej LB i autoklawowania
Kolby Erlenmeyera, 250 mlMillipore sigmaCLS4980250Do wzrostu i indukcji kultur bakteryjnych.
Kwas etyleno-diamino-tetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Zbiornik żelowy System SDS-PAGEThermofisher ScientificSTM1001
GlicynaSigma-AldrichG8898
Koktajl inhibitorów proteazy Halt (100x)Thermofisher scientific87786
HEPESSigma-AldrichH3375
His-Drice-pET28a To badanieN/ADostępne u autorów
His-DriceC211A-pET28a To badanieN/ADostępne u autorów
His-Dronc-pET28a To badanieN/ADostępne u autorów
His-DroncC318A-pET28a To badanieN/ADostępne u autorów
ImidazolSigma-AldrichI2399-100G
Izopropylo-ß-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Thermofisher ScientificFERR0392
KanamycynaFisher ScientificBP906-5
LB Agar, Miller (proszek)Fisher ScientificBP1425-500
LB Rosół, MillerFisher ScientificBP1426-500
LizozymThermofisher Scientific90082
Mikrobiologiczny inkubator płytkowyFisher Scientific11-690-650DDo wzrostu kolonii po transformacji
Probówki do mikrowirówek, 0,5 mlEppendorf22363611
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlEppendorf22363204
Zestaw MidiprepQiagen12243
Mini rotator rurowyFisher Scientific05-450-127do mieszania lizatów bakteryjnych i agarozy Ni-NTA
Zestaw miniprzygotowawczyQiagen27106
Zmotoryzowany kontroler pipetGilsonF110120Do korzystania z pipet serologicznych
NaH2PO4Fisher ScientificBP330-1
Ni-NTA AgarozaQiagen30210
NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Żel białkowy Midi, 20-dołkowyThermofisher ScientificWG1402BOX
NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)Thermofisher ScientificNP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x)Thermofisher ScientificNP0001
Bufor transferowy NuPAGE (20x)InvitrogenNP00061
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym z regulacją temperaturyWytrząsarkainkubatora New Brunswick Scientific
Petridish 100 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875712
Koraliki galwaniczneZymo researchS1001Do rozsiewania kultur na płytkach AmpR/KanR
Kolumny polipropylenowe (1 ml)Qiagen34924Do oczyszczania białek znakowanych Hisem
Precision Plus Protein StandardsBio-Rad#161-0374
Koncentrat odczynnika do oznaczania białekBio-Rad#5000006
pT7CFE1-NMyc ThermofisherScientific88863Do klonowania substratów do ekspresji RRL
Membrana PVDFInvitrogenLC2007
14 mL Polipropylen Rurki z okrągłym dnemFisher Scientific352029Do hodowli kultur plazmidowych
QiaRackQiagen19095Do utrzymywania kolumn polipropylenowych podczas oczyszczania
Wirówka szybkoobrotowa z chłodzeniemBeckman CoulterAvanti J-25
rRNasin Inhibitor rybonukleazyPromegaN251ADo ekspresji RRL
Chlorek soduFisher ScientificBP358-212
Wodorotlenek soduFisher ScientificBP359-500
Sterylne probówki Falcon, 15 mlFisher Scientific05-527-90
Sterylne probówki Falcon, 50 mlFisher Scientific14-959-49A Sacharoza
Sigma-AldrichS70903-250G
1 ml Pipety serologiczne, sterylneleczenie komórkowe229001BDo lizy komórek bakteryjnych w probówkach 50 ml
Lizat retikulocytów sprzężony z TnT -T7PromegaL4611
Tris-baseFisher ScientificBP154-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Kąpiel wodnaFisher Scientific2340
Zachodnia kaseta do przenoszenia na mokroThermofisher Scientific
przeciwciał C25STM2001

Bibliografia

  1. Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
  2. Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
  3. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  4. Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
  5. Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
  6. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
  7. Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
  8. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  9. Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
  10. Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
  11. Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
  12. Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
  13. Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
  14. Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
  15. Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
  16. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
  17. Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
  18. Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
  19. Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
  20. Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
  21. Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438(2017).
  22. Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  26. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  27. Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
  28. Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
  29. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  30. Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
  31. Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
  32. Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130(2018).
  33. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
  34. Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
  35. Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
  36. Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
  37. Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
  38. Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekombinowane kaspazyprocesy apoptotycznesubstraty nieapoptotyczneSDS PAGEimmunoblottingoczyszczanie bia ekaktywno kaspazy
In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.