Artykuł metodologiczny

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64393

⸱

13 września 2022

 ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Streszczenie

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi. Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami lub zdefiniowanymi społecznościami bakteryjnymi mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, badanie nicieni w ich naturalnym kontekście mikrobiologicznym jest niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów. Jednocześnie odizolowanie robaków od dzikich zwierząt nie zawsze jest wykonalne, a nawet jeśli jest to możliwe, pobieranie próbek ze środowiska naturalnego ogranicza wykorzystanie zestawu narzędzi genetycznych, które w przeciwnym razie byłyby dostępne do badań nad C. elegans. Poniższy protokół opisuje metodę badań mikrobiomu z wykorzystaniem mikrokosmosów kompostu do wzrostu w laboratorium w zróżnicowanym mikrobiologicznie i naturalnym środowisku.

Lokalnie pozyskiwana gleba może być wzbogacona o produkty w celu urozmaicenia społeczności mikroorganizmów, w których hodowane są robaki i z których są zbierane, myte i sterylizowane powierzchniowo do późniejszych analiz. Reprezentatywne eksperymenty wykazały zdolność do modulowania społeczności drobnoustrojów we wspólnej glebie poprzez wzbogacanie jej różnymi produktami, a ponadto wykazują, że robaki hodowane w tych odrębnych środowiskach gromadzą podobne mikrobiomy jelitowe, różniące się od ich odpowiednich środowisk, co potwierdza koncepcję specyficznego dla gatunku mikrobiomu jelitowego. Ogólnie rzecz biorąc, mikrokosmosy kompostowe zapewniają naturalne środowisko laboratoryjne do badań nad mikrobiomem jako alternatywa dla syntetycznych społeczności mikrobiologicznych lub izolacji dzikich nicieni.

Wprowadzenie

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi1,2. Jako model ma kilka zalet. Po pierwsze, zwierzęta wolne od zarazków lub gnotobiotyczne są łatwe do zdobycia i utrzymania; Wybielacz może być używany do zabijania robaków gravid i związanych z nimi drobnoustrojów, pozostawiając ich odporne na wybielanie jaja nienaruszone, aby mogły rosnąć jako populacje zsynchronizowane z wiekiem, które mogą zostać skolonizowane przez bakterie będące przedmiotem zainteresowania3,4. Ponadto, gdy rośnie w obecności bakterii, C. elegans, bakteriożerca, połyka napotkane bakterie, z gatunkami podatnymi trawionymi lub wydalanymi, podczas gdy gatunki odporne i trwałe stabilnie kolonizują jelito robaka. Co więcej, C. elegans są w większości hermafrodytami, wytwarzając populacje genetycznie identycznego potomstwa, co zmniejsza mylącą zmienność genetyczną. W połączeniu z dostępnością zmutowanych i transgenicznych szczepów robaków, praca z C. elegans oferuje naukowcom gnotobiotyczny i genetycznie podatny model do zbadania molekularnych podstaw interakcji gospodarz-mikroorganizm5,6,7,8.

Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, identyfikacja i badanie bakterii, z którymi robaki wchodzą w interakcje w naturze, są niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów, odkrycia naturalnego kontekstu ich funkcji i zrozumienia selektywnych sił, które ukształtowały ich ewolucję. Poza laboratorium, C. elegans występuje na całym świecie w wilgotnym klimacie umiarkowanym, gdzie uważa się, że populacje przechodzą cykl życiowy "boom i upadek", charakteryzujący się szybkim wzrostem populacji, gdy zasoby są obfite, a następnie przesunięciem rozwojowym w kierunku pionierskich, odpornych na stres dauers, gdy zasoby są wyczerpane9. Chociaż uważa się je za nicienie glebowe, dziko rozmnażające się populacje C. elegans najczęściej żywią się rozkładającym się materiałem organicznym, takim jak gnijące kwiaty lub owoce, gdzie populacje bakterii są obfite i zróżnicowane.

Badania mikrobiomu jelitowego u nicieni wyizolowanych z dzikiej przyrody zidentyfikowały różnorodne, ale charakterystyczne społeczności bakteryjne10,11, których skład został dodatkowo poparty badaniami przeprowadzonymi na robakach hodowanych w naturalnym środowisku mikrokosmosu12,13. Łącznie takie badania umożliwiły wyznaczenie mikrobiomu jelitowego robaka rdzeniowego2. Podczas gdy pobieranie próbek populacji C. elegans w naturze stanowi najbardziej bezpośrednie badanie naturalnych interakcji robak-mikroorganizm, nie jest to możliwe wszędzie i kiedykolwiek, ponieważ jest ograniczone do regionów i pór roku z obfitymi opadami10,11. Alternatywnie, zamiast izolować robaki od ich naturalnego środowiska, eksperymenty z wykorzystaniem mikrokosmosów wprowadzają naturalne środowisko do laboratorium6,8,12,13,14,15. Środowiska mikrokosmiczne przygotowywane są z gleby kompostowanej z różnymi owocami lub warzywami, co umożliwia dalsze zróżnicowanie wyjściowego zbiorowiska glebowego. Oferują one praktyczne metody eksperymentalne, które łączą różnorodność mikrobiologiczną i trójwymiarowe środowisko dzikiej gleby z eksperymentalnymi zaletami kontrolowanego obiektu laboratoryjnego i genetycznie zdefiniowanych szczepów robaków. Poniższy protokół szczegółowo opisuje etapy związane z pracą z mikrokosmosami kompostu, demonstrując ich zastosowanie w zrozumieniu tworzenia charakterystycznego mikrobiomu jelitowego robaka z różnych środowisk.

Protokół

1. Przygotowanie kompostu

  1. Pozyskać kompost lub ziemię ogrodową z dowolnego dostępnego źródła i przechowywać w laboratorium w standardowym plastikowym pojemniku kuchennym z otworami w pokrywie, aby zapewnić dopływ powietrza. Otwory należy zatkać watą, aby zapobiec dostawaniu się muszek owocówek i innych bezkręgowców (Rysunek 1A).
    UWAGA: Pięćset gramów ziemi (mieszczące się w pojemniku o pojemności 1,5 galona, wymiary: 30 cm x 20 cm x 10 cm) zapewni wystarczającą ilość materiału do 12 mikrokosmosów.
  2. Wzbogacić kompost lub ziemię posiekanymi produktami roślinnymi lub ich mieszanką w stosunku masowym produktów do ziemi 1:2.
  3. Inkubować przez 7-14 dni w temperaturze 20-25 °C, mieszając raz dziennie i dodając pożywkę M9 w razie potrzeby, aby utrzymać wilgotność bez doprowadzenia do powstania błota.
    UWAGA: Ziemie niewzbogacone produktami roślinnymi zazwyczaj nie wspierają wzrostu C. elegans; wybór konkretnych produktów roślinnych zależy od badacza, przy czym wiele rodzajów i mieszanek pozwala na wzrost nicieni. Wzbogacanie różnymi produktami roślinnymi będzie w różny sposób promować dywersyfikację społeczności bakteryjnych, co umożliwi badanie formowania się mikrobiomu jelitowego z różnych punktów wyjścia (patrz sekcja dyskusji).

2. Przygotowanie mikrokosmosów kompostowych

  1. Do każdego mikrokosmosu dodaj 10 g wzbogaconego kompostu do zlewki szklanej o pojemności 30 mL przykrytej folią aluminiową, a następnie poddaj autoklawowaniu (Rycina 1B).
  2. Aby przygotować ekstrakt mikrobiologiczny do uzupełnienia autoklawowanego kompostu, zacznij od dodania 30 g tego samego kompostu, którego użyto w kroku 2.1, do każdej z trzech probówek o pojemności 50 mL i wypełnij je pożywką M9. Mieszaj w wstrząsarku typu vortex przez 1 min (Rycina 1C).
    UWAGA: Powinno to zapewnić wystarczającą ilość bakterii dla dziewięciu mikrokosmosów, z których każdy umożliwi rozwój setek nicieni.
  3. Odwiruj zawartość probówek w wirówce z prędkością 560 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Uważając, aby nie naruszyć osadu, usuń nadsącz za pomocą pipety serologicznej i przelej go do nowej probówki o pojemności 50 mL.
  5. Skoncentruj ekstrakt bakteryjny poprzez wirowanie z maksymalną prędkością (2,000 × g) przez 15 min w RT. Resuspenduj osad w takiej ilości M9, aby uzyskać 200 µL dla każdego mikrokosmosu oraz dodatkowe 200 µL do dodania na płytkę, która będzie służyć jako widoczny wskaźnik rozwoju nicieni wewnątrz mikrokosmosów.
    UWAGA: Na przykład dla dziewięciu mikrokosmosów resuspenduj osad mikrobiologiczny w 2 mL M9.
  6. Dodaj 200 µL skoncentrowanego ekstraktu mikrobiologicznego do każdej zlewki z autoklawowanym kompostem, a także na płytkę NGM, która będzie służyć jako płytka wskaźnikowa.
  7. Inkubuj mikrokosmosy i płytkę wskaźnikową przez 24 h w temperaturze 20-25 °C przed dodaniem nicieni.

3. Hodowla nicieni w mikrokosmosach kompostowych

  1. Do każdego mikrokosmosu oraz na płytkę zastępczą (krok 2.7) dodaj 500-1000 jaj lub larw L13, aby rozpocząć eksperyment (Rysunek 1D).
    UWAGA: W opisanych tutaj eksperymentach wykorzystano nicienie N2 typu dzikiego. Można jednak użyć innych szczepów C. elegans (a potencjalnie innych nicieni).
  2. Hoduj nicienie do osiągnięcia wieku dorosłego w temperaturze 20 °C (zazwyczaj przez 3 dni).

Proces kompostowania i metoda hodowli dżdżownic; obejmuje mikrokosmos oraz etapy zbioru lejkami Baermanna.
Rysunek 1: Przygotowanie mikrokosmosów kompostowych, hodowla i zbiór dżdżownic. (A) Wzbogacenie lokalnej gleby lub kompostu produktami roślinnymi i inkubacja przez 2 tygodnie. Połączenie (B) autoklawowanej wzbogaconej gleby z (C) ekstraktem mikrobiologicznym i (D) inkubacja przez co najmniej 24 h przed dodaniem zsynchronizowanych dżdżownic w stadium L1 do mikrokosmosów w celu rozpoczęcia eksperymentu. (E, F) W momencie zbioru, dodanie kompostu z mikrokosmosu do cylindra wspierającego w lejku Baermanna i zalanie medium M9. (G) Po 15 min, zlanie filtratu do probówki 50 mL. Skróty: sup. = supernatant. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie lejka Baermanna do pozyskiwania nicieni

  1. Zmontuj lejek Baermanna, mocując 5-8 cm sztywnej gumowej rurki do końcówki plastikowego lejka.
  2. Nasuń zacisk na rurkę i szczelnie ją zamknij.
  3. Umieść w lejku cylindryczną rurkę z PVC o długości 7 cm i średnicy 5 cm, z przyklejoną u dołu nylonową siatką o oczkach 1 mm (Rycina 1E). Wyłóż wnętrze cylindra dwoma arkuszami papieru chłonnego.
  4. Umieść lejek Baermanna w kolbie (Rycina 1F).

5. Odzyskiwanie dżdżownic z mikrokosmosów i pobieranie odpowiednich próbek gleby

  1. Do mikrokosmosu, w którym hodowano nicienie, dodaj 20 mL M9, wymieszaj zawiesinę, a następnie przelej ją z zlewki do wyłożonego ręcznikiem papierowym cylindra w układzie lejka Baermanna. Dodaj więcej M9, aby całkowicie zanurzyć kompost w lejku.
    UWAGA: Populacje C. elegans (N2) osiągają stadium dorosłe w mikrokosmosach z kompostu w tempie zbliżonym do tego na standardowych płytkach agarowych z zasiań Escherichia coli. Aby zwiększyć dokładność zbierania nicieni na konkretnym etapie rozwojowym, należy odnieść się do płytki kontrolnej z kroku 3.3.
  2. Po 30 min odkręć zacisk, aby zebrać filtrat zawierający odizolowane nicienie do probówki 50 mL (Rysunek 1G).
  3. Do cylindra dodaj więcej M9 i powtórz procedurę w drugiej rundzie, aby zebrać więcej nicieni, a następnie jeszcze raz, jeśli wymagana jest większa liczba osobników.
    UWAGA: Podczas powtarzania rund zbierania należy uważać, aby nie uszkodzić ręcznika papierowego, co mogłoby doprowadzić do przedostania się cząsteczek gleby. Maksymalnie cztery rundy zbioru powinny pozwolić na wyizolowanie co najmniej 50% nicieni pierwotnie wprowadzonych do mikrokosmosu bez naruszania integralności ręcznika papierowego.
  4. Skoncentruj nicienie poprzez wirowanie przy 560 × g przez 2 min (RT). Za pomocą pipety serologicznej usuń 35 mL supernatantu.
  5. Przenieś pozostałe 15 mL do probówki 15 mL i ponownie wiruj przy 560 × g przez 1 min, aby dodatkowo skoncentrować nicienie. Za pomocą pipety serologicznej usuń 14 mL supernatantu.
  6. Równolegle pobierz 1 g pozostałej gleby z mikrokosmosu do probówki 1.5 mL. Próbki gleby zawierające środowiskową społeczność bakterii należy przetworzyć natychmiast lub przechowywać w −20 °C do późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych, zgodnie z opisem poniżej dla próbek nicieni.

6. Płukanie i sterylizacja powierzchni zebranych nicieni

  1. Przenieś 1 mL skoncentrowanych, zebranych nicieni z kroku 5.5 do probówki 1,5 mL za pomocą szklanej pipety. Inkubuj przez 2 min, aby nicienie osiadły na dnie probówki. Usuń nadsącz, pozostawiając nienaruszone dolne 100 µL.
  2. Przemyj 6x za pomocą 1,5 mL buforu M9+T (0,025% Triton-X w M9), pozwalając nicieniom osiadać na dnie po każdym razie.
  3. Przenieś przemyte nicienie w objętości 100 µL do nowej probówki 1,5 mL za pomocą szklanej pipety.
    UWAGA: Na tym etapie protokołu od pierwszego przemycia (krok 6.2) powinno upłynąć około 30 min. Zaleca się, aby nicienie pozostały bez pożywienia przez co najmniej 1 h przed dodaniem lewamisolu, co umożliwi wydalenie przejściowych bakterii i pełne strawienie bakterii pokarmowych.
  4. Dodaj 100 µL 25 mM chlorowodorku lewamisolu, aby sparaliżować nicienie. Inkubuj przez 5 min w RT.
  5. Dodaj 200 µL 4% roztworu wybielacza. Inkubuj przez 2 min.
  6. Usuń nadsącz, pozostawiając nienaruszone najniższe 150 µL, a następnie przemyj 3x buforem M9+T, jak opisano powyżej.
    UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek, zaleca się stosowanie filtrowanego buforu M9+T (przez filtr 0,2 µm) oraz noszenie rękawiczek od tego momentu.
  7. Po przemyciach pobierz 50 µL z pozostałych 150 µL z ostatniego płukania i wysiej na płytkę LB, inkubując w 25 °C przez 48 h, aby potwierdzić skuteczne usunięcie zewnętrznych bakterii.
    UWAGA: Obserwacja do 30 kolonii w ostatnim płukaniu (co odpowiada łącznie 60 zewnętrznych komórek bakteryjnych pozostałych w próbce) jest dopuszczalna i spodziewa się, że będzie miała jedynie marginalny wpływ na analizowany skład mikrobiomu, biorąc pod uwagę tysiące bakterii, które zazwyczaj kolonizują każdego dorosłego nicienia15. W przypadku zaobserwowania większej liczby, integralność próbki może być naruszona.
  8. Użyj sterylizowanych powierzchniowo nicieni niezwłocznie (np. do ekstrakcji żywych bakterii w celu hodowli [liczenie CFU]) lub przechowuj w −20 °C do późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

7. Izolacja DNA

UWAGA: Poniższe kroki opisują ekstrakcję DNA z zebranych nicieni przy użyciu komercyjnego zestawu przeznaczonego do ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z gleby (patrz Tabela materiałów), z modyfikacjami opisanymi poniżej, mającymi na celu ułatwienie ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z nicieni.

  1. Przenieś próbkę zawierającą wysterylizowane powierzchniowo nicienie (w razie potrzeby rozmroź w temperaturze pokojowej) do probówek dołączonych do zestawu, zastępując dostarczone szklane kuleczki około 30-50 kuleczkami z cyrkonu o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Obserwowane wydajności DNA są wyższe przy użyciu kuleczek z cyrkonu niż przy szklanych kuleczkach dołączonych do zestawu. Choć przyczyna tego zjawiska pozostaje nieustalona, kuleczki z cyrkonu mogą skuteczniej rozrywać kutykulę nicieni, uwalniając więcej bakterii.
  2. W przypadku próbek kompostu dodaj około 250 mg zebranej gleby do probówek z zestawu, nie zastępując szklanych kuleczek.
  3. Po dodaniu do wszystkich próbek roztworu buforu dołączonego do zestawu, homogenizuj je za pomocą homogenizatora elektrycznego w temperaturze pokojowej (patrz Tabela materiałów) w dwóch cyklach przy 2 000 rpm przez 30 s każdy, z 30-sekundową przerwą pomiędzy nimi.
  4. Wykonaj pozostałe etapy oczyszczania DNA zgodnie z protokołem zestawu. Eluuj próbki z nicieni w ilości nie przekraczającej 50 µL buforu do eluowania, aby zapewnić stężenia DNA wystarczająco wysokie do sekwencjonowania.

Wyniki

Aby zbadać możliwość zróżnicowania społeczności w mikrokosmosach glebowych, porównaliśmy społeczności mikrobowe w mikrokosmosach kompostowych przygotowanych poprzez wzbogacenie tej samej gleby początkowej — kompostu przemysłowego dostępnego w mieście Berkeley w Kalifornii — różnymi produktami roślinnymi: jabłkami, papryką, pomarańczami lub ziemniakami (każdy zestaw w trzech powtórzeniach). Następnie porównaliśmy społeczności mikrobowe każdego środowiska kompostowego z mikrobiomem jelitowym dzikiego typu C. elegans hodowanego w odpowiednim mikrokosmosie. Analizę przeprowadzono z próbkami DNA wyekstrahowanego z około 500 wysterylizowanych powierzchniowo osobników dorosłych na mikrokosmos oraz z próbek 250 mg kompostu z odpowiednich mikrokosmosów.

Charakterystyka mikrobiomów gleby środowiskowej oraz jelit dżdżownic opierała się na sekwencjonowaniu nowej generacji regionu V4 genu 16S rRNA bakterii. Przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu standardowych zestawów zgodnie z instrukcjami producentów, a samo sekwencjonowanie wykonano na komercyjnym sekwenatorze (patrz Tabela materiałów). Zdemultipleksowane sekwencje przetworzono za pomocą programu DADA2, przypisano im taksonomię na podstawie bazy referencyjnej SILVA v132 i przeanalizowano za pomocą pakietu phyloseq16,17,18 (szczegółowy opis sekwencjonowania i analizy znajduje się w Pliku uzupełniającym 1, Rysunku uzupełniającym S1, Rysunku uzupełniającym S2, Rysunku uzupełniającym S3, Tabeli uzupełniającej S1 oraz Tabeli uzupełniającej S2; pełny schemat obliczeniowy jest dostępny w serwisie GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Surowe dane są dostępne w bazie NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).

Średnio uzyskano 73 220 sekwencji na próbkę. Sekwencje te reprezentują 15 027 wariantów sekwencji amplikonów (ASV), obejmujących 27 typów i 216 rodzin, w tym rodziny uznawane za część rdzennego mikrobiomu jelitowego C. elegans13, takie jak Rhizobiaceae, Burkholderiaceae oraz Bacillaceae. Enterobacteriaceae i Pseudomonadaceae, które wcześniej uznano za dominujące elementy, tym razem stanowiły mniejszość, lecz nadal były wzbogacone (2–10-krotnie) w porównaniu do ich odpowiednich środowisk glebowych. Porównania oparte na nieważonych i ważonych dystansach UniFrac19,20 wykazały dobrą powtarzalność między triplikatami mikrokosmosów wzbogaconych tym samym produktem roślinnym, co wskazuje bliskie grupowanie się próbek. Z kolei mikrobiomy glebowe z różnych środowisk, wzbogacone różnymi produktami, grupowały się oddzielnie, co demonstruje możliwość zróżnicowania początkowej społeczności mikrobowej poprzez dodanie różnych produktów roślinnych (Rycina 2).

W porównaniach mikrobiomów jelit dżdżownic i społeczności środowiskowych, analiza głównych współrzędnych (PCoA) z zastosowaniem nieważonych lub ważonych odległości UniFrac wykazała wyraźne grupowanie się mikrobiomów jelit dżdżownic oddzielnie od ich odpowiednich środowisk dla każdego typu mikrokosmosu (Rysunek 2). Podczas gdy PCoA oparta na nieważonych odległościach UniFrac nie odróżniła mikrobiomów glebowych od mikrobiomów dżdżownic (Rysunek 2A), grupowanie oparte na odległościach ważonych ujawniło wyraźną separację mikrobiomów jelit dżdżownic i kompostu (Rysunek 2B). Wyniki te wspierają proces, w którym filtracja przez gospodarza oddziałuje na dostępność środowiskową, kształtując mikrobiom jelitowy, który nie jest całkowicie odrębny od swojego źródła środowiskowego pod względem obecności taksonów, lecz moduluje ich obfitość poprzez wzbogacanie o podzbiór dostępnych taksonów, co ostatecznie skutkuje powstaniem rdzennego mikrobiomu jelit dżdżownic, wspólnego dla osobników hodowanych w różnych środowiskach.

Wykres analizy głównych składowych (PCA) typów kompostu z markerami gleby i dżdżownic do analizy.
Rysunek 2: Mikrobiomy jelit dżdżownic grupujące się oddzielnie od odpowiadających im środowisk mikrobiologicznych zdywersyfikowanych produktami roślinnymi. Skład mikrobiomu określono za pomocą sekwencjonowania 16S, a społeczności z mikrokosmosów wzbogaconych wyznaczonymi produktami roślinnymi lub z dżdżownic w nich hodowanych zgrupowano za pomocą PCoA w oparciu o (A) nieważone lub (B) ważone odległości UniFrac. Przedstawione osie to te, które wyjaśniają największą zmienność w składzie społeczności między próbkami (N = 3 dla każdego typu mikrokosmosu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Sekwencjonowanie nowej generacji i analiza danych. Przedstawiono tutaj etapy przygotowania bibliotek, sekwencjonowania w laboratorium oraz analizy danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Przykład wykresu kontroli jakości dla odczytów odwrotnych z jednej próbki. Oś X (cykl) przedstawia pozycję nukleotydu wzdłuż odczytu sekwencji. Lewa oś Y przedstawia wynik jakości. Skala szarości mapy ciepła reprezentuje częstotliwość występowania wyniku jakości w każdej pozycji nukleotydu; zielona linia obrazuje medianę wyniku jakości w każdej pozycji nukleotydu; górna pomarańczowa linia obrazuje kwartyle rozkładu wyniku jakości; dolna czerwona linia obrazuje procent odczytów sekwencji, które sięgnęły danej pozycji nukleotydu (prawa oś Y, tutaj 100%). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Wskaźniki błędów dla różnych próbek. Częstotliwość błędów w różnych próbkach (czarne kropki) powinna maleć wraz ze wzrostem wyniku jakości (quality score) dla każdej przedstawionej możliwej substytucji par zasad, co odzwierciedla oczekiwaną tendencję. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Przykład PCoA opartego na ważonych dystansach UniFrac. Nazwy grup przedstawione w legendzie reprezentują produkty użyte do wzbogacenia kompostu w różnych mikrokosmosach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Sekwencyjne filtrowanie sekwencji. aLiczba odczytów sekwencji przed filtrowaniem. b-dKażda kolumna przedstawia liczbę odczytów sekwencji pozostałych po etapie filtracji: odfiltrowaniu odczytów o niskiej jakości (krok 2.5), algorytmie odszumiającym wykonanym przez dada() (krok 2.8), łączeniu odczytów forward i reverse (krok 2.9) oraz usuwaniu chimer (krok 2.11). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Tabela metadanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania mikrobiomu jelitowego nicieni hodowanych w naturalnym środowisku, oferując alternatywne podejście do izolacji robaków od natury lub do hodowania ich w syntetycznych społecznościach.

Tysiące potencjalnych gatunków bakterii schwytanych w reprezentatywnym eksperymencie mikrokosmicznym odzwierciedlają różnorodność mikrobiologiczną, z którą wyewoluowały robaki, i pokazują zdolność rurociągu mikrokosmicznego do łączenia zalet pracy z modelowym organizmem gospodarza i zalet pracy z naturalnymi, zróżnicowanymi społecznościami mikroorganizmów.

Reprezentatywne wyniki pokazują, że wzbogacenie wspólnej gleby w różne rodzaje produktów moduluje różnorodność mikrobiologiczną środowiska, podkreślając zakres różnorodności mikrobiologicznej dostępnej do eksploracji przy użyciu tego rurociągu. Wybór produktów nie jest szczególnie ważny. W poprzednich pracach wykorzystano banany, jabłka, pomarańcze, truskawki, liście zielonej herbaty i ziemniaki do wzbogacenia gleby, co dało podobną wydajność hodowli robaków. Skutecznie wykorzystano również produkty mieszane. Kluczową cechą jest to, że różne produkty będą różnicować daną glebę na różne sposoby.

Pomimo dużej różnorodności mikrobiologicznej w środowisku, mikrobiomy jelitowe robaków różnią się znacznie mniej, co potwierdza znaczenie niszy jelitowej robaków i filtrowania gospodarza dla tworzenia rdzenia mikrobiomu jelitowego, który różni się od środowiska glebowego13. Wzorzec ten najlepiej obserwuje się za pomocą ważonej analizy UniFrac PCoA, która pokazuje, że różnice między mikrobiomami środowiskowymi glebowymi a mikrobiomami jelitowymi robaków wynikają głównie z różnic we względnej liczebności kluczowych taksonów.

Chociaż opisany tutaj protokół koncentruje się na zbieraniu robaków do sekwencjonowania 16S, mikrokosmosy można wykorzystać do zbadania dodatkowych interesujących pytań. Na przykład robaki zebrane z mikrokosmosów mogą być następnie badane pod kątem wpływu zróżnicowanego mikrobiomu jelitowego na odporność gospodarza na różne niekorzystne warunki, w tym patogeny lub toksyny. Alternatywnie, nowe gatunki i szczepy bakterii mogą być izolowane i hodowane z robaków zebranych w ziemi, rozszerzając taksonomiczną i funkcjonalną różnorodność bakterii dostępnych do przeprowadzania eksperymentów.

Podczas gdy metody badawcze w warunkach laboratoryjnych dążą do spójności i odtwarzalności, praca z mikrokosmosami wykorzystuje naturalną zmienność do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm w naturalnym kontekście. Niemniej jednak ta odmiana wiąże się również z pewnymi wyzwaniami. Niektóre gleby, które zawierają wysoki poziom endogennych bezkręgowców, mogą wymagać dodatkowego wirowania, filtracji i etapów badania, aby skutecznie wyeliminować niepożądane organizmy z preparatu mikrokosmosu. Ponadto niska liczebność mikroorganizmów w glebie może powodować niepożądane powstawanie dauerów w populacjach robaków, co wymaga zwiększenia ekstraktu mikrobiologicznego lub wzbogacenia gleby w większą ilość plonów. Z każdym przeprowadzonym eksperymentem mikrokosmicznym naukowcy kontynuują badanie pełnej różnorodności taksonomicznej i funkcjonalnej zapewnianej przez naturę, umożliwiając odkrycie nowych taksonów drobnoustrojów i zdolności funkcjonalnych, od odporności na infekcje po ochronę przed ksenobiotykami środowiskowymi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez granty NIH R01OD024780 a R01AG061302. K.T. był dodatkowo wspierany przez Letnie Stypendium Badawcze Studiów Licencjackich z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley, ufundowane przez Fundację Rose Hills. Projekty kreskówek na rysunku 1 uzyskano z BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik AMPure XP, 60 mlBeckman CoulterA63881Plik uzupełniający Krok 1.3
Wybielacz (podchloryn sodu)Sigma-Aldrich7681-52-9Krok 6.5
Zestaw DNeasy PowerSoil ProQiagen47016Krok 7 Ekstrakcje DNA
Zestaw dNTP 10mM Invitrogen18427013Dodatkowy krok 1.2
Pipeta serologiczna Easypet 3 KontrolerEppendorf4430000018Służy do usuwania supernatantu w razie określenia
Greiner Bio-One 25 ml Sterylne pipety serologiczneFisher Scientific07-000-368Służy do usuwania supernatantu, gdy jest określony
KH2PO4Fisher ScientificP285-500Używany do produkcji
chlorowodorku lewamizoluFisher ScientificAC187870100Krok 6.4
M9 Minimalny roztwór podłożaPrzygotowany we własnymzakresie Receptura nie dotyczy w wormbook.org
MgSO4Fisher ScientificM63-500Służy do produkcji
zestawu odczynników M9 MiniSeq o wysokiej wydajności (150 cykli)IlluminaFC-420-1002Dodatkowy krok 1.7
System MiniSeqIlluminaSY-420-1001Używany komercyjny sekwencer; Krok uzupełniający 1.7
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500Używany do produkcji M9
NaClFisher ScientificS271-3Używany do produkcji
pożywki hodowlanej nicieni M9 (NGM)Przygotowany we własnymzakresie przepis nabrak w
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (96 próbek)IlluminaFC-131-1096Używany zestaw do przygotowania biblioteki; Krok uzupełniający 1.4
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001Krok uzupełniający 1.7
Polimeraza DNA o wysokiej wierności PhusionNew England BiolabsM0530LKrok uzupełniający 1.2
Homogenizator PowerLyzer 24 (110/220 V)Qiagen13155Krok 7.3
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32851Kroki uzupełniające 1.1 i 1.6
Fluorometr kubitowyInvitrogenQ33238Kroki dodatkowe 1.1 i 1.6
Triton X-100Fisher ScientificBP-151Służy do przygotowania
Koralików cyrkonowych/krzemionkowych M9+T o średnicy 1,0 mmFisher ScientificNC9847287Krok 7.1
M9 wormbook.org

Bibliografia

  1. Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
  2. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285(2017).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 7-8 (2006).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  6. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604(2019).
  7. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  8. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
  9. Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849(2015).
  10. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  11. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  12. Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622(2016).
  13. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  14. Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
  15. Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343(2022).
  16. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  17. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
  18. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217(2013).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrobiom jelitowyoddzia ywania mi dzy mikrobiomem a gospodarzemmikrobiomy rodowiskoweizolacja nicienisterylizacja powierzchniowasekwencjonowanie 16Sanaliza g wnych wsp rz dnych
Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.