Artykuł metodologiczny

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64393

⸱

13 września 2022

 ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi. Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami lub zdefiniowanymi społecznościami bakteryjnymi mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, badanie nicieni w ich naturalnym kontekście mikrobiologicznym jest niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów. Jednocześnie odizolowanie robaków od dzikich zwierząt nie zawsze jest wykonalne, a nawet jeśli jest to możliwe, pobieranie próbek ze środowiska naturalnego ogranicza wykorzystanie zestawu narzędzi genetycznych, które w przeciwnym razie byłyby dostępne do badań nad C. elegans. Poniższy protokół opisuje metodę badań mikrobiomu z wykorzystaniem mikrokosmosów kompostu do wzrostu w laboratorium w zróżnicowanym mikrobiologicznie i naturalnym środowisku.

Lokalnie pozyskiwana gleba może być wzbogacona o produkty w celu urozmaicenia społeczności mikroorganizmów, w których hodowane są robaki i z których są zbierane, myte i sterylizowane powierzchniowo do późniejszych analiz. Reprezentatywne eksperymenty wykazały zdolność do modulowania społeczności drobnoustrojów we wspólnej glebie poprzez wzbogacanie jej różnymi produktami, a ponadto wykazują, że robaki hodowane w tych odrębnych środowiskach gromadzą podobne mikrobiomy jelitowe, różniące się od ich odpowiednich środowisk, co potwierdza koncepcję specyficznego dla gatunku mikrobiomu jelitowego. Ogólnie rzecz biorąc, mikrokosmosy kompostowe zapewniają naturalne środowisko laboratoryjne do badań nad mikrobiomem jako alternatywa dla syntetycznych społeczności mikrobiologicznych lub izolacji dzikich nicieni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi1,2. Jako model ma kilka zalet. Po pierwsze, zwierzęta wolne od zarazków lub gnotobiotyczne są łatwe do zdobycia i utrzymania; Wybielacz może być używany do zabijania robaków gravid i związanych z nimi drobnoustrojów, pozostawiając ich odporne na wybielanie jaja nienaruszone, aby mogły rosnąć jako populacje zsynchronizowane z wiekiem, które mogą zostać skolonizowane przez bakterie będące przedmiotem zainteresowania3,4. Ponadto, gdy rośnie w obecności bakterii, C. elegans, bakteriożerca, połyka napotkane bakterie, z gatunkami podatnymi trawionymi lub wydalanymi, podczas gdy gatunki odporne i trwałe stabilnie kolonizują jelito robaka. Co więcej, C. elegans są w większości hermafrodytami, wytwarzając populacje genetycznie identycznego potomstwa, co zmniejsza mylącą zmienność genetyczną. W połączeniu z dostępnością zmutowanych i transgenicznych szczepów robaków, praca z C. elegans oferuje naukowcom gnotobiotyczny i genetycznie podatny model do zbadania molekularnych podstaw interakcji gospodarz-mikroorganizm5,6,7,8.

Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, identyfikacja i badanie bakterii, z którymi robaki wchodzą w interakcje w naturze, są niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów, odkrycia naturalnego kontekstu ich funkcji i zrozumienia selektywnych sił, które ukształtowały ich ewolucję. Poza laboratorium, C. elegans występuje na całym świecie w wilgotnym klimacie umiarkowanym, gdzie uważa się, że populacje przechodzą cykl życiowy "boom i upadek", charakteryzujący się szybkim wzrostem populacji, gdy zasoby są obfite, a następnie przesunięciem rozwojowym w kierunku pionierskich, odpornych na stres dauers, gdy zasoby są wyczerpane9. Chociaż uważa się je za nicienie glebowe, dziko rozmnażające się populacje C. elegans najczęściej żywią się rozkładającym się materiałem organicznym, takim jak gnijące kwiaty lub owoce, gdzie populacje bakterii są obfite i zróżnicowane.

Badania mikrobiomu jelitowego u nicieni wyizolowanych z dzikiej przyrody zidentyfikowały różnorodne, ale charakterystyczne społeczności bakteryjne10,11, których skład został dodatkowo poparty badaniami przeprowadzonymi na robakach hodowanych w naturalnym środowisku mikrokosmosu12,13. Łącznie takie badania umożliwiły wyznaczenie mikrobiomu jelitowego robaka rdzeniowego2. Podczas gdy pobieranie próbek populacji C. elegans w naturze stanowi najbardziej bezpośrednie badanie naturalnych interakcji robak-mikroorganizm, nie jest to możliwe wszędzie i kiedykolwiek, ponieważ jest ograniczone do regionów i pór roku z obfitymi opadami10,11. Alternatywnie, zamiast izolować robaki od ich naturalnego środowiska, eksperymenty z wykorzystaniem mikrokosmosów wprowadzają naturalne środowisko do laboratorium6,8,12,13,14,15. Środowiska mikrokosmiczne przygotowywane są z gleby kompostowanej z różnymi owocami lub warzywami, co umożliwia dalsze zróżnicowanie wyjściowego zbiorowiska glebowego. Oferują one praktyczne metody eksperymentalne, które łączą różnorodność mikrobiologiczną i trójwymiarowe środowisko dzikiej gleby z eksperymentalnymi zaletami kontrolowanego obiektu laboratoryjnego i genetycznie zdefiniowanych szczepów robaków. Poniższy protokół szczegółowo opisuje etapy związane z pracą z mikrokosmosami kompostu, demonstrując ich zastosowanie w zrozumieniu tworzenia charakterystycznego mikrobiomu jelitowego robaka z różnych środowisk.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kompostu

  1. Zdobądź kompost lub ziemię ogrodową z dowolnego wygodnego źródła i przechowuj w laboratorium w standardowym plastikowym pojemniku kuchennym z otworami wyciętymi w pokrywie, aby wpuścić powietrze. Zatkaj otwory watą, aby nie dopuścić do muszek owocówek i innych bezkręgowców (Rysunek 1A).
    UWAGA: Pięćset gramów gleby (mieszczącej się w pojemniku o pojemności 1,5 galona o wymiarach: 30 cm x 20 cm x 10 cm) zapewni wystarczającą ilość materiału na 12 mikrokosmosów.
  2. Wzbogać kompost lub glebę posiekanymi produktami lub mieszanką różnych produktów w stosunku masowym 1:2 produktu do gleby.
  3. Inkubować przez 7-14 dni w temperaturze 20-25 °C, mieszając raz dziennie i dodając pożywkę M9 w razie potrzeby, aby utrzymać wilgoć bez powodowania zamulenia.
    UWAGA: Gleby niewzbogacone w produkty zwykle nie sprzyjają wzrostowi C. elegans, ale wybór konkretnego produktu zależy od badacza, z wieloma rodzajami i mieszankami zdolnymi do wspierania wzrostu robaków. Wzbogacanie różnymi produktami będzie sprzyjać dywersyfikacji społeczności bakteryjnych na różne sposoby, umożliwiając badanie tworzenia się mikrobiomu jelitowego z różnych punktów wyjścia (patrz sekcja dyskusji).

2. Przygotowanie mikrokosmosów kompostu

  1. Dla każdego mikrokosmosu dodaj 10 g wzbogaconego kompostu do szklanej zlewki o pojemności 30 ml pokrytej folią aluminiową i autoklawem (Rysunek 1B).
  2. Aby przygotować ekstrakt mikrobiologiczny w celu uzupełnienia autoklawizowanego kompostu, zacznij od dodania 30 g tego samego kompostu, który został użyty w kroku 2.1, do każdej z trzech probówek o pojemności 50 ml i napełnij M9. Wiruj przez 1 minutę (Rysunek 1C).
    UWAGA: Powinno to zapewnić wystarczającą ilość bakterii dla dziewięciu mikrokosmosów, z których każdy wspiera rozwój setek nicieni.
  3. Odwirować probówki o masie 560 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Zwracając uwagę, aby nie naruszyć osadu, usunąć supernatanty za pomocą pipety serologicznej i połączyć w nowej probówce o pojemności 50 ml.
  5. Zagęścić ekstrakt bakteryjny przez odwirowanie z maksymalną prędkością (2 000 × g) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulki w takiej ilości M9, aby uzyskać 200 μl na każdy mikrokosmos i 200 μl więcej, aby dodać do płytki, która posłuży jako widoczny wskaźnik rozwoju robaków wewnątrz mikrokosmosów.
    UWAGA: Na przykład w przypadku dziewięciu mikrokosmosów ponownie zawieś osad mikrobiologiczny w 2 ml M9.
  6. Dodaj 200 μl skoncentrowanego ekstraktu mikrobiologicznego do każdej zlewki autoklawowanego kompostu, a także do płytki NGM, która posłuży jako widoczna płytka zastępcza.
  7. Inkubuj mikrokosmosy i proxy plate przez 24 godziny w temperaturze 20-25 °C przed dodaniem robaków.

3. Hodowla robaków w mikrokosmosach kompostu

  1. Dodaj 500-1000 jaj lub larw L13 do każdego mikrokosmosu i do płytki proxy (krok 2.7), aby rozpocząć eksperyment (Rysunek 1D).
    UWAGA: Opisane tutaj eksperymenty wykorzystują robaki N2 typu dzikiego. Można jednak stosować inne szczepy C. elegans (i potencjalnie inne nicienie).
  2. Wychowaj robaki do dorosłości w temperaturze 20 °C (zwykle 3 dni).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przygotowanie mikrokosmosów kompostu, hodowla robaków i zbiory. (A) Wzbogacić lokalną glebę lub kompost w produkty i inkubować przez 2 tygodnie. Połącz (B) autoklawowaną, wzbogaconą glebę z (C) ekstraktem mikrobiologicznym i (D) inkubuj przez co najmniej 24 godziny przed dodaniem zsynchronizowanych robaków L1s do mikrokosmosów, aby rozpocząć eksperyment. (E, F) Gdy będziesz gotowy do zbioru, dodaj kompost z mikrokosmosu do cylindra podtrzymującego lejek Baermann i przykryj M9. (G) Po 15 minutach uwolnić filtrat do probówki o pojemności 50 ml. Skrót: sup. = supernatant. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie lejka Baermann do zbierania robaków

  1. Zamontuj lejek Baermann, mocując 5-8 cm sztywnej gumowej rurki do końca plastikowego lejka.
  2. Wsuń zacisk na rurkę i clamp go.
  3. Umieść w lejku cylindryczną rurę PVC o długości 7 cm i średnicy 5 cm z przyklejoną na jej dole nylonową siatką o grubości 1 mm (Rysunek 1E). Wyłóż cylinder dwoma arkuszami bibuły.
  4. Umieść lejek Baermanna w kolbie (Rysunek 1F).

5. Zbieranie robaków z mikrokosmosów i pobieranie odpowiednich próbek gleby

  1. Dodaj 20 ml M9 do mikrokosmosu, w którym wyhodowano robaki, wymieszaj mieszaninę, a następnie wlej mieszaninę ze zlewki do cylindra wyłożonego bibułką w układzie lejka Baermanna. Dodaj więcej M9, aby całkowicie zanurzyć kompost w lejku.
    UWAGA: Populacje C. elegans (N2) osiągają dorosłość w mikrokosmosach kompostu w podobnym tempie, jak na standardowych płytkach agarowych wysianych Escherichia coli. Aby uzyskać więcej informacji na temat dokładności zbierania robaków na określonym etapie rozwoju, zapoznaj się z tabliczką proxy z kroku 3.3.
  2. Po 30 minutach odpiąć zacisk, aby uwolnić filtrat zawierający zebrane robaki do probówki o pojemności 50 ml (Rysunek 1G).
  3. Dodaj więcej M9 do cylindra i powtórz drugą rundę, aby zebrać więcej robaków, i jeszcze raz, jeśli potrzebne są dodatkowe robaki.
    UWAGA: Podczas powtarzania rund zbioru należy uważać, aby nie naruszyć integralności bibuły, co mogłoby spowodować przedostanie się cząstek gleby. Maksymalnie cztery rundy żniwne powinny wyizolować co najmniej 50% robaków pierwotnie dodanych do mikrokosmosu bez naruszania integralności bibuły.
  4. Zagęścić robaki, odwirowując w stężeniu 560 × g przez 2 minuty (RT). Usunąć 35 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej.
  5. Pozostałe 15 ml przenieść do probówki o pojemności 15 ml i ponownie odwirować przy 560 × g przez 1 minutę w celu dalszego zagęszczenia robaków. Usunąć 14 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej.
  6. Równolegle zbierz 1 g pozostałej mikrokosmicznej gleby do probówki o pojemności 1,5 ml. Próbki gleby zawierające środowiskowe zbiorowisko bakteryjne należy natychmiast przetworzyć lub przechowywać je w temperaturze -20 °C w celu późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych, jak opisano poniżej dla próbek robaków.

6. Mycie i sterylizacja powierzchni zebranych robaków

  1. Przenieść 1 ml zagęszczonych, zebranych robaków z etapu 5,5 do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety. Inkubować przez 2 minuty, aby robaki osiadły na dnie probówki. Usunąć sklarowany osad, pozostawiając dno 100 μl w nienaruszonym stanie.
  2. Przemyj 6x 1,5 ml M9+T (0,025% Triton-X w M9), pozwalając robakom za każdym razem osiąść na dnie.
  3. Przenieść umyte robaki w objętości 100 μl do nowej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety.
    UWAGA: W tym momencie protokołu powinno upłynąć około 30 minut od pierwszego prania (krok 6.2). Zaleca się pozostawienie robaków bez pożywienia przez co najmniej 1 godzinę przed dodaniem lewamizolu, aby umożliwić wydalanie przemijających bakterii i pełne trawienie bakterii pokarmowych.
  4. Dodaj 100 μl 25 mM chlorowodorku lewamizolu, aby sparaliżować robaki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodaj 200 μl 4% roztworu wybielacza. Inkubować przez 2 minuty.
  6. Usunąć supernatant, pozostawiając 150 μl na samym dole w spokoju i przemyć 3x M9+T, jak wyżej.
    UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek, zaleca się stosowanie przefiltrowanego M9+T (przez filtr 0,2 μm) i noszenie rękawic od tego momentu.
  7. Po przemyciu należy pobrać 50 μl z pozostałych 150 μl z ostatniego prania i umieścić je na płytce LB, inkubując w temperaturze 25 °C przez 48 godzin, aby potwierdzić skuteczne usunięcie bakterii zewnętrznych.
    UWAGA: Obserwacja do 30 kolonii w ostatnim praniu (reprezentujących łącznie 60 zewnętrznych komórek bakteryjnych pozostających w próbce) jest dozwolona i oczekuje się, że będzie miała tylko marginalny wkład w analizowany skład mikrobiomu, biorąc pod uwagę tysiące bakterii, które zwykle kolonizują każdego dorosłego robaka15. W przypadku zaobserwowania większej liczby próbek integralność próbki może być zagrożona.
  8. Wysterylizowane powierzchniowo robaki należy natychmiast użyć (np. w celu ekstrakcji żywych bakterii do hodowli [liczba CFU]) lub przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

7. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Poniższe kroki opisują ekstrakcję DNA zebranych robaków za pomocą komercyjnego zestawu przeznaczonego do ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z gleby (zobacz Tabelę Materiałów), z modyfikacjami opisanymi poniżej w celu ułatwienia ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z robaków.

  1. Przenieś próbkę zawierającą robaki wysterylizowane powierzchniowo (w razie potrzeby rozmrozić w temperaturze pokojowej) do probówek dostarczonych przez zestaw, zastępując dostarczone szklane kulki kulkami cyrkonowymi o średnicy około 30-50 1 mm (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Obserwowana wydajność DNA jest wyższa w przypadku kulek cyrkonowych niż w przypadku kulek szklanych dostarczonych w zestawie. Chociaż przyczyna tej obserwacji pozostaje nieokreślona, kulki cyrkonu mogą skuteczniej rozłupywać naskórek nicienia, uwalniając więcej bakterii.
  2. W przypadku próbek kompostu dodaj około 250 mg zebranej gleby do tubek zestawu bez wymiany szklanych kulek.
  3. Po dodaniu roztworu buforowego dostarczonego przez zestaw do wszystkich próbek, homogenizować za pomocą homogenizatora energetycznego w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów) przez dwie rundy po 2 000 obr./min przez 30 s każdy, zatrzymując się na 30 s pomiędzy nimi.
  4. Wykonaj pozostałe etapy oczyszczania DNA zgodnie z protokołem zestawu. Eluować próbki robaków w nie więcej niż 50 μl buforu elucyjnego, aby zapewnić stężenia DNA wystarczająco wysokie do sekwencjonowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać możliwość zróżnicowania społeczności mikrokosmosów glebowych, porównaliśmy społeczności mikroorganizmów w mikrokosmosach kompostowych przygotowanych przez wzbogacenie tej samej początkowej gleby, kompostu klasy przemysłowej dostępnego w mieście Berkeley w Kalifornii, z różnymi produktami: jabłkami, papryką, pomarańczami lub ziemniakami (każdy zestaw w trzech egzemplarzach). Następnie porównaliśmy społeczności mikrobiologiczne w każdym środowisku kompostowym z mikrobiomem jelitowym C. elegans typu dzikiego wyhodowanego w odpowiednim mikrokosmosie. Analizę przeprowadzono na próbkach DNA wyekstrahowanych od około 500 sterylizowanych powierzchniowo dorosłych osób na mikrokosmos oraz z 250 mg próbek kompostu z odpowiednich mikrokosmosów.

Charakterystyka mikrobiomów środowiskowych, glebowych i jelitowych robaków opierała się na sekwencjonowaniu nowej generacji regionu V4 bakteryjnego genu 16S rRNA. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania zostało osiągnięte przy użyciu standardowych zestawów i przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta, przy czym sekwencjonowanie przeprowadzono na komercyjnym sekwencerze (patrz tabela materiałów). Demultipleksowane sekwencje zostały przetworzone przy użyciu DADA2, przypisano im taksonomię na podstawie referencyjnej bazy danych SILVA v132 i przeanalizowano za pomocą phyloseq16,17,18 (patrz plik uzupełniający 1, rysunek uzupełniający S1, rysunek uzupełniający S2, rysunek uzupełniający S3, tabela uzupełniająca S1 i tabela uzupełniająca S2 szczegółowy opis sekwencjonowania i analizy; pełny potok obliczeniowy jest dostępny w GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Surowe dane są dostępne w NCBI Sequence Read Archive (identyfikator bioprojektu PRJNA856419).

Średnio uzyskano 73 220 sekwencji na próbkę. Sekwencje te reprezentują 15 027 wariantów sekwencji amplikonów (ASV), obejmujących 27 typów i 216 rodzin, w tym rodziny uważane za część rdzenia mikrobiomu jelitowego C. elegans13, takie jak Rhizobiaceae, Burkholderiaceae i Bacillaceae. Enterobacteriaceae i Pseudomonadaceae, które wcześniej uznano za dominujących członków, tym razem stanowiły mniejszość, ale nadal były wzbogacone (2-10-krotnie) w porównaniu z odpowiednimi środowiskami glebowymi. Porównania oparte zarówno na odległościach nieważonych, jak i ważonych UniFrac19,20 wykazały dobrą odtwarzalność wśród mikrokosmicznych triplikatów wzbogaconych tym samym produktem, na co wskazuje ścisłe grupowanie. W przeciwieństwie do tego, środowiskowe mikrobiomy glebowe wzbogacone różnymi produktami grupowały się od siebie, wykazując zdolność do dywersyfikacji początkowej społeczności drobnoustrojów poprzez dodawanie różnych produktów (Rysunek 2).

W porównaniach mikrobiomów jelitowych robaków i społeczności środowiskowych, analiza głównych współrzędnych (PCoA) z nieważonymi lub ważonymi odległościami UniFrac wykazała wyraźne grupowanie mikrobiomów jelitowych robaków w stosunku do ich odpowiednich środowisk dla każdego typu mikrokosmosu (Rysunek 2). Podczas gdy PCoA oparte na nieważonych odległościach UniFrac nie rozróżniało mikrobiomów glebowych i robaków (Rysunek 2A), grupowanie oparte na odległościach ważonych ujawniło wyraźne oddzielenie mikrobiomów jelitowych i kompostowych robaków (Rysunek 2B). Wyniki te wspierają proces, w którym filtrowanie gospodarza wpływa na dostępność środowiskową w celu kształtowania mikrobiomu jelitowego, który nie jest całkowicie odrębny od swojego źródła środowiskowego pod względem obecności taksonów, ale moduluje ich liczebność poprzez wzbogacanie podzbioru dostępnych taksonów, co ostatecznie prowadzi do powstania mikrobiomu jelitowego robaka rdzeniowego współdzielonego przez robaki hodowane w różnych środowiskach.

figure-results-1
Rysunek 2: Mikrobiomy jelitowe robaków grupujące się z dala od swoich zróżnicowanych środowisk mikrobiologicznych. Skład mikrobiomu określono za pomocą sekwencjonowania 16S, a zbiorowiska z mikrokosmosów wzbogaconych o wyznaczony produkt lub z wyhodowanych w nich robaków grupowano za pomocą PCoA w oparciu o (A) nieważone lub (B) ważone odległości UniFrac. Pokazane osie to te, które wyjaśniają największą zmienność w składzie zbiorowiska między próbkami (N = 3 dla każdego typu mikrokosmosu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Sekwencjonowanie nowej generacji i analiza danych. Poniżej przedstawiono kroki przygotowania biblioteki, sekwencjonowania w laboratorium i analizy danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Przykład wykresu kontroli jakości dla odwrotnych odczytów z jednej próbki. Oś X (cykl) pokazuje pozycję nukleotydu wzdłuż odczytanej sekwencji. Lewa oś Y pokazuje wynik jakości. Mapa cieplna w skali szarości reprezentuje częstotliwość oceny jakości w każdej pozycji nukleotydu; Zielona linia przedstawia medianę wyniku jakości w każdej pozycji nukleotydu; Górna pomarańczowa linia przedstawia kwartyle rozkładu Wyniku Jakości; dolna czerwona linia przedstawia procent odczytów sekwencji, które rozszerzyły tę pozycję nukleotydu (prawa oś Y, tutaj 100%). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Poziomy błędów dla różnych próbek. Częstość występowania błędów w różnych próbkach (czarne kropki) powinna zmniejszać się wraz ze wzrostem wyniku jakości dla każdego możliwego podstawienia par zasad, odzwierciedlając oczekiwany trend. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Przykład PCoA oparty na ważonych odległościach UniFrac. Nazwy grup pokazane w legendzie reprezentują produkty używane do wzbogacania kompostu używanego w różnych mikrokosmosach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Sekwencyjne filtrowanie sekwencji. ZALiczba odczytów sekwencji przed filtrowaniem. b-d Każda kolumna reprezentuje liczbę odczytów sekwencji pozostałych po kroku filtracji: odfiltrowanie odczytów o niskiej jakości (krok 2.5), algorytm odszumiania wykonywany przez dada() (krok 2.8), scalanie odczytów do przodu i do tyłu (krok 2.9) i usuwanie chimer (krok 2.11). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Tabela metadanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania mikrobiomu jelitowego nicieni hodowanych w naturalnym środowisku, oferując alternatywne podejście do izolacji robaków od natury lub do hodowania ich w syntetycznych społecznościach.

Tysiące potencjalnych gatunków bakterii schwytanych w reprezentatywnym eksperymencie mikrokosmicznym odzwierciedlają różnorodność mikrobiologiczną, z którą wyewoluowały robaki, i pokazują zdolność rurociągu mikrokosmicznego do łączenia zalet pracy z modelowym organizmem gospodarza i zalet pracy z naturalnymi, zróżnicowanymi społecznościami mikroorganizmów.

Reprezentatywne wyniki pokazują, że wzbogacenie wspólnej gleby w różne rodzaje produktów moduluje różnorodność mikrobiologiczną środowiska, podkreślając zakres różnorodności mikrobiologicznej dostępnej do eksploracji przy użyciu tego rurociągu. Wybór produktów nie jest szczególnie ważny. W poprzednich pracach wykorzystano banany, jabłka, pomarańcze, truskawki, liście zielonej herbaty i ziemniaki do wzbogacenia gleby, co dało podobną wydajność hodowli robaków. Skutecznie wykorzystano również produkty mieszane. Kluczową cechą jest to, że różne produkty będą różnicować daną glebę na różne sposoby.

Pomimo dużej różnorodności mikrobiologicznej w środowisku, mikrobiomy jelitowe robaków różnią się znacznie mniej, co potwierdza znaczenie niszy jelitowej robaków i filtrowania gospodarza dla tworzenia rdzenia mikrobiomu jelitowego, który różni się od środowiska glebowego13. Wzorzec ten najlepiej obserwuje się za pomocą ważonej analizy UniFrac PCoA, która pokazuje, że różnice między mikrobiomami środowiskowymi glebowymi a mikrobiomami jelitowymi robaków wynikają głównie z różnic we względnej liczebności kluczowych taksonów.

Chociaż opisany tutaj protokół koncentruje się na zbieraniu robaków do sekwencjonowania 16S, mikrokosmosy można wykorzystać do zbadania dodatkowych interesujących pytań. Na przykład robaki zebrane z mikrokosmosów mogą być następnie badane pod kątem wpływu zróżnicowanego mikrobiomu jelitowego na odporność gospodarza na różne niekorzystne warunki, w tym patogeny lub toksyny. Alternatywnie, nowe gatunki i szczepy bakterii mogą być izolowane i hodowane z robaków zebranych w ziemi, rozszerzając taksonomiczną i funkcjonalną różnorodność bakterii dostępnych do przeprowadzania eksperymentów.

Podczas gdy metody badawcze w warunkach laboratoryjnych dążą do spójności i odtwarzalności, praca z mikrokosmosami wykorzystuje naturalną zmienność do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm w naturalnym kontekście. Niemniej jednak ta odmiana wiąże się również z pewnymi wyzwaniami. Niektóre gleby, które zawierają wysoki poziom endogennych bezkręgowców, mogą wymagać dodatkowego wirowania, filtracji i etapów badania, aby skutecznie wyeliminować niepożądane organizmy z preparatu mikrokosmosu. Ponadto niska liczebność mikroorganizmów w glebie może powodować niepożądane powstawanie dauerów w populacjach robaków, co wymaga zwiększenia ekstraktu mikrobiologicznego lub wzbogacenia gleby w większą ilość plonów. Z każdym przeprowadzonym eksperymentem mikrokosmicznym naukowcy kontynuują badanie pełnej różnorodności taksonomicznej i funkcjonalnej zapewnianej przez naturę, umożliwiając odkrycie nowych taksonów drobnoustrojów i zdolności funkcjonalnych, od odporności na infekcje po ochronę przed ksenobiotykami środowiskowymi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez granty NIH R01OD024780 a R01AG061302. K.T. był dodatkowo wspierany przez Letnie Stypendium Badawcze Studiów Licencjackich z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley, ufundowane przez Fundację Rose Hills. Projekty kreskówek na rysunku 1 uzyskano z BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik AMPure XP, 60 mlBeckman CoulterA63881Plik uzupełniający Krok 1.3
Wybielacz (podchloryn sodu)Sigma-Aldrich7681-52-9Krok 6.5
Zestaw DNeasy PowerSoil ProQiagen47016Krok 7 Ekstrakcje DNA
Zestaw dNTP 10mM Invitrogen18427013Dodatkowy krok 1.2
Pipeta serologiczna Easypet 3 KontrolerEppendorf4430000018Służy do usuwania supernatantu w razie określenia
Greiner Bio-One 25 ml Sterylne pipety serologiczneFisher Scientific07-000-368Służy do usuwania supernatantu, gdy jest określony
KH2PO4Fisher ScientificP285-500Używany do produkcji
chlorowodorku lewamizoluFisher ScientificAC187870100Krok 6.4
M9 Minimalny roztwór podłożaPrzygotowany we własnymzakresie Receptura nie dotyczy w wormbook.org
MgSO4Fisher ScientificM63-500Służy do produkcji
zestawu odczynników M9 MiniSeq o wysokiej wydajności (150 cykli)IlluminaFC-420-1002Dodatkowy krok 1.7
System MiniSeqIlluminaSY-420-1001Używany komercyjny sekwencer; Krok uzupełniający 1.7
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500Używany do produkcji M9
NaClFisher ScientificS271-3Używany do produkcji
pożywki hodowlanej nicieni M9 (NGM)Przygotowany we własnymzakresie przepis nabrak w
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (96 próbek)IlluminaFC-131-1096Używany zestaw do przygotowania biblioteki; Krok uzupełniający 1.4
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001Krok uzupełniający 1.7
Polimeraza DNA o wysokiej wierności PhusionNew England BiolabsM0530LKrok uzupełniający 1.2
Homogenizator PowerLyzer 24 (110/220 V)Qiagen13155Krok 7.3
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32851Kroki uzupełniające 1.1 i 1.6
Fluorometr kubitowyInvitrogenQ33238Kroki dodatkowe 1.1 i 1.6
Triton X-100Fisher ScientificBP-151Służy do przygotowania
Koralików cyrkonowych/krzemionkowych M9+T o średnicy 1,0 mmFisher ScientificNC9847287Krok 7.1
M9 wormbook.org

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
  2. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285(2017).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 7-8 (2006).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  6. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604(2019).
  7. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  8. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
  9. Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849(2015).
  10. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  11. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  12. Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622(2016).
  13. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  14. Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
  15. Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343(2022).
  16. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  17. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
  18. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217(2013).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrobiom jelitowyoddzia ywania mi dzy mikrobiomem a gospodarzemmikrobiomy rodowiskoweizolacja nicienisterylizacja powierzchniowasekwencjonowanie 16Sanaliza g wnych wsp rz dnych

Powiązane artykuły