Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi^1,2. Jako model ma kilka zalet. Po pierwsze, zwierzęta wolne od zarazków lub gnotobiotyczne są łatwe do zdobycia i utrzymania; Wybielacz może być używany do zabijania robaków gravid i związanych z nimi drobnoustrojów, pozostawiając ich odporne na wybielanie jaja nienaruszone, aby mogły rosnąć jako populacje zsynchronizowane z wiekiem, które mogą zostać skolonizowane przez bakterie będące przedmiotem zainteresowania^3,4. Ponadto, gdy rośnie w obecności bakterii, C. elegans, bakteriożerca, połyka napotkane bakterie, z gatunkami podatnymi trawionymi lub wydalanymi, podczas gdy gatunki odporne i trwałe stabilnie kolonizują jelito robaka. Co więcej, C. elegans są w większości hermafrodytami, wytwarzając populacje genetycznie identycznego potomstwa, co zmniejsza mylącą zmienność genetyczną. W połączeniu z dostępnością zmutowanych i transgenicznych szczepów robaków, praca z C. elegans oferuje naukowcom gnotobiotyczny i genetycznie podatny model do zbadania molekularnych podstaw interakcji gospodarz-mikroorganizm^5,6,7,8.

Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, identyfikacja i badanie bakterii, z którymi robaki wchodzą w interakcje w naturze, są niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów, odkrycia naturalnego kontekstu ich funkcji i zrozumienia selektywnych sił, które ukształtowały ich ewolucję. Poza laboratorium, C. elegans występuje na całym świecie w wilgotnym klimacie umiarkowanym, gdzie uważa się, że populacje przechodzą cykl życiowy "boom i upadek", charakteryzujący się szybkim wzrostem populacji, gdy zasoby są obfite, a następnie przesunięciem rozwojowym w kierunku pionierskich, odpornych na stres dauers, gdy zasoby są wyczerpane⁹. Chociaż uważa się je za nicienie glebowe, dziko rozmnażające się populacje C. elegans najczęściej żywią się rozkładającym się materiałem organicznym, takim jak gnijące kwiaty lub owoce, gdzie populacje bakterii są obfite i zróżnicowane.

Badania mikrobiomu jelitowego u nicieni wyizolowanych z dzikiej przyrody zidentyfikowały różnorodne, ale charakterystyczne społeczności bakteryjne^10,11, których skład został dodatkowo poparty badaniami przeprowadzonymi na robakach hodowanych w naturalnym środowisku mikrokosmosu^12,13. Łącznie takie badania umożliwiły wyznaczenie mikrobiomu jelitowego robaka rdzeniowego². Podczas gdy pobieranie próbek populacji C. elegans w naturze stanowi najbardziej bezpośrednie badanie naturalnych interakcji robak-mikroorganizm, nie jest to możliwe wszędzie i kiedykolwiek, ponieważ jest ograniczone do regionów i pór roku z obfitymi opadami^10,11. Alternatywnie, zamiast izolować robaki od ich naturalnego środowiska, eksperymenty z wykorzystaniem mikrokosmosów wprowadzają naturalne środowisko do laboratorium^6,8^,12,13,14,15. Środowiska mikrokosmiczne przygotowywane są z gleby kompostowanej z różnymi owocami lub warzywami, co umożliwia dalsze zróżnicowanie wyjściowego zbiorowiska glebowego. Oferują one praktyczne metody eksperymentalne, które łączą różnorodność mikrobiologiczną i trójwymiarowe środowisko dzikiej gleby z eksperymentalnymi zaletami kontrolowanego obiektu laboratoryjnego i genetycznie zdefiniowanych szczepów robaków. Poniższy protokół szczegółowo opisuje etapy związane z pracą z mikrokosmosami kompostu, demonstrując ich zastosowanie w zrozumieniu tworzenia charakterystycznego mikrobiomu jelitowego robaka z różnych środowisk.

1. Przygotowanie kompostu

1. Zdobądź kompost lub ziemię ogrodową z dowolnego wygodnego źródła i przechowuj w laboratorium w standardowym plastikowym pojemniku kuchennym z otworami wyciętymi w pokrywie, aby wpuścić powietrze. Zatkaj otwory watą, aby nie dopuścić do muszek owocówek i innych bezkręgowców (Rysunek 1A).
   UWAGA: Pięćset gramów gleby (mieszczącej się w pojemniku o pojemności 1,5 galona o wymiarach: 30 cm x 20 cm x 10 cm) zapewni wystarczającą ilość materiału na 12 mikrokosmosów.
2. Wzbogać kompost lub glebę posiekanymi produktami lub mieszanką różnych produktów w stosunku masowym 1:2 produktu do gleby.
3. Inkubować przez 7-14 dni w temperaturze 20-25 °C, mieszając raz dziennie i dodając pożywkę M9 w razie potrzeby, aby utrzymać wilgoć bez powodowania zamulenia.
   UWAGA: Gleby niewzbogacone w produkty zwykle nie sprzyjają wzrostowi C. elegans, ale wybór konkretnego produktu zależy od badacza, z wieloma rodzajami i mieszankami zdolnymi do wspierania wzrostu robaków. Wzbogacanie różnymi produktami będzie sprzyjać dywersyfikacji społeczności bakteryjnych na różne sposoby, umożliwiając badanie tworzenia się mikrobiomu jelitowego z różnych punktów wyjścia (patrz sekcja dyskusji).

2. Przygotowanie mikrokosmosów kompostu

1. Dla każdego mikrokosmosu dodaj 10 g wzbogaconego kompostu do szklanej zlewki o pojemności 30 ml pokrytej folią aluminiową i autoklawem (Rysunek 1B).
2. Aby przygotować ekstrakt mikrobiologiczny w celu uzupełnienia autoklawizowanego kompostu, zacznij od dodania 30 g tego samego kompostu, który został użyty w kroku 2.1, do każdej z trzech probówek o pojemności 50 ml i napełnij M9. Wiruj przez 1 minutę (Rysunek 1C).
   UWAGA: Powinno to zapewnić wystarczającą ilość bakterii dla dziewięciu mikrokosmosów, z których każdy wspiera rozwój setek nicieni.
3. Odwirować probówki o masie 560 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
4. Zwracając uwagę, aby nie naruszyć osadu, usunąć supernatanty za pomocą pipety serologicznej i połączyć w nowej probówce o pojemności 50 ml.
5. Zagęścić ekstrakt bakteryjny przez odwirowanie z maksymalną prędkością (2 000 × g) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulki w takiej ilości M9, aby uzyskać 200 μl na każdy mikrokosmos i 200 μl więcej, aby dodać do płytki, która posłuży jako widoczny wskaźnik rozwoju robaków wewnątrz mikrokosmosów.
   UWAGA: Na przykład w przypadku dziewięciu mikrokosmosów ponownie zawieś osad mikrobiologiczny w 2 ml M9.
6. Dodaj 200 μl skoncentrowanego ekstraktu mikrobiologicznego do każdej zlewki autoklawowanego kompostu, a także do płytki NGM, która posłuży jako widoczna płytka zastępcza.
7. Inkubuj mikrokosmosy i proxy plate przez 24 godziny w temperaturze 20-25 °C przed dodaniem robaków.

3. Hodowla robaków w mikrokosmosach kompostu

1. Dodaj 500-1000 jaj lub larw L1³ do każdego mikrokosmosu i do płytki proxy (krok 2.7), aby rozpocząć eksperyment (Rysunek 1D).
   UWAGA: Opisane tutaj eksperymenty wykorzystują robaki N2 typu dzikiego. Można jednak stosować inne szczepy C. elegans (i potencjalnie inne nicienie).
2. Wychowaj robaki do dorosłości w temperaturze 20 °C (zwykle 3 dni).

Rysunek 1: Przygotowanie mikrokosmosów kompostu, hodowla robaków i zbiory. (A) Wzbogacić lokalną glebę lub kompost w produkty i inkubować przez 2 tygodnie. Połącz (B) autoklawowaną, wzbogaconą glebę z (C) ekstraktem mikrobiologicznym i (D) inkubuj przez co najmniej 24 godziny przed dodaniem zsynchronizowanych robaków L1s do mikrokosmosów, aby rozpocząć eksperyment. (E, F) Gdy będziesz gotowy do zbioru, dodaj kompost z mikrokosmosu do cylindra podtrzymującego lejek Baermann i przykryj M9. (G) Po 15 minutach uwolnić filtrat do probówki o pojemności 50 ml. Skrót: sup. = supernatant. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie lejka Baermann do zbierania robaków

1. Zamontuj lejek Baermann, mocując 5-8 cm sztywnej gumowej rurki do końca plastikowego lejka.
2. Wsuń zacisk na rurkę i clamp go.
3. Umieść w lejku cylindryczną rurę PVC o długości 7 cm i średnicy 5 cm z przyklejoną na jej dole nylonową siatką o grubości 1 mm (Rysunek 1E). Wyłóż cylinder dwoma arkuszami bibuły.
4. Umieść lejek Baermanna w kolbie (Rysunek 1F).

5. Zbieranie robaków z mikrokosmosów i pobieranie odpowiednich próbek gleby

1. Dodaj 20 ml M9 do mikrokosmosu, w którym wyhodowano robaki, wymieszaj mieszaninę, a następnie wlej mieszaninę ze zlewki do cylindra wyłożonego bibułką w układzie lejka Baermanna. Dodaj więcej M9, aby całkowicie zanurzyć kompost w lejku.
   UWAGA: Populacje C. elegans (N2) osiągają dorosłość w mikrokosmosach kompostu w podobnym tempie, jak na standardowych płytkach agarowych wysianych Escherichia coli. Aby uzyskać więcej informacji na temat dokładności zbierania robaków na określonym etapie rozwoju, zapoznaj się z tabliczką proxy z kroku 3.3.
2. Po 30 minutach odpiąć zacisk, aby uwolnić filtrat zawierający zebrane robaki do probówki o pojemności 50 ml (Rysunek 1G).
3. Dodaj więcej M9 do cylindra i powtórz drugą rundę, aby zebrać więcej robaków, i jeszcze raz, jeśli potrzebne są dodatkowe robaki.
   UWAGA: Podczas powtarzania rund zbioru należy uważać, aby nie naruszyć integralności bibuły, co mogłoby spowodować przedostanie się cząstek gleby. Maksymalnie cztery rundy żniwne powinny wyizolować co najmniej 50% robaków pierwotnie dodanych do mikrokosmosu bez naruszania integralności bibuły.
4. Zagęścić robaki, odwirowując w stężeniu 560 × g przez 2 minuty (RT). Usunąć 35 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej.
5. Pozostałe 15 ml przenieść do probówki o pojemności 15 ml i ponownie odwirować przy 560 × g przez 1 minutę w celu dalszego zagęszczenia robaków. Usunąć 14 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej.
6. Równolegle zbierz 1 g pozostałej mikrokosmicznej gleby do probówki o pojemności 1,5 ml. Próbki gleby zawierające środowiskowe zbiorowisko bakteryjne należy natychmiast przetworzyć lub przechowywać je w temperaturze -20 °C w celu późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych, jak opisano poniżej dla próbek robaków.

6. Mycie i sterylizacja powierzchni zebranych robaków

1. Przenieść 1 ml zagęszczonych, zebranych robaków z etapu 5,5 do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety. Inkubować przez 2 minuty, aby robaki osiadły na dnie probówki. Usunąć sklarowany osad, pozostawiając dno 100 μl w nienaruszonym stanie.
2. Przemyj 6x 1,5 ml M9+T (0,025% Triton-X w M9), pozwalając robakom za każdym razem osiąść na dnie.
3. Przenieść umyte robaki w objętości 100 μl do nowej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety.
   UWAGA: W tym momencie protokołu powinno upłynąć około 30 minut od pierwszego prania (krok 6.2). Zaleca się pozostawienie robaków bez pożywienia przez co najmniej 1 godzinę przed dodaniem lewamizolu, aby umożliwić wydalanie przemijających bakterii i pełne trawienie bakterii pokarmowych.
4. Dodaj 100 μl 25 mM chlorowodorku lewamizolu, aby sparaliżować robaki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodaj 200 μl 4% roztworu wybielacza. Inkubować przez 2 minuty.
6. Usunąć supernatant, pozostawiając 150 μl na samym dole w spokoju i przemyć 3x M9+T, jak wyżej.
   UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek, zaleca się stosowanie przefiltrowanego M9+T (przez filtr 0,2 μm) i noszenie rękawic od tego momentu.
7. Po przemyciu należy pobrać 50 μl z pozostałych 150 μl z ostatniego prania i umieścić je na płytce LB, inkubując w temperaturze 25 °C przez 48 godzin, aby potwierdzić skuteczne usunięcie bakterii zewnętrznych.
   UWAGA: Obserwacja do 30 kolonii w ostatnim praniu (reprezentujących łącznie 60 zewnętrznych komórek bakteryjnych pozostających w próbce) jest dozwolona i oczekuje się, że będzie miała tylko marginalny wkład w analizowany skład mikrobiomu, biorąc pod uwagę tysiące bakterii, które zwykle kolonizują każdego dorosłego robaka¹⁵. W przypadku zaobserwowania większej liczby próbek integralność próbki może być zagrożona.
8. Wysterylizowane powierzchniowo robaki należy natychmiast użyć (np. w celu ekstrakcji żywych bakterii do hodowli [liczba CFU]) lub przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

7. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Poniższe kroki opisują ekstrakcję DNA zebranych robaków za pomocą komercyjnego zestawu przeznaczonego do ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z gleby (zobacz Tabelę Materiałów), z modyfikacjami opisanymi poniżej w celu ułatwienia ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z robaków.

1. Przenieś próbkę zawierającą robaki wysterylizowane powierzchniowo (w razie potrzeby rozmrozić w temperaturze pokojowej) do probówek dostarczonych przez zestaw, zastępując dostarczone szklane kulki kulkami cyrkonowymi o średnicy około 30-50 1 mm (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Obserwowana wydajność DNA jest wyższa w przypadku kulek cyrkonowych niż w przypadku kulek szklanych dostarczonych w zestawie. Chociaż przyczyna tej obserwacji pozostaje nieokreślona, kulki cyrkonu mogą skuteczniej rozłupywać naskórek nicienia, uwalniając więcej bakterii.
2. W przypadku próbek kompostu dodaj około 250 mg zebranej gleby do tubek zestawu bez wymiany szklanych kulek.
3. Po dodaniu roztworu buforowego dostarczonego przez zestaw do wszystkich próbek, homogenizować za pomocą homogenizatora energetycznego w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów) przez dwie rundy po 2 000 obr./min przez 30 s każdy, zatrzymując się na 30 s pomiędzy nimi.
4. Wykonaj pozostałe etapy oczyszczania DNA zgodnie z protokołem zestawu. Eluować próbki robaków w nie więcej niż 50 μl buforu elucyjnego, aby zapewnić stężenia DNA wystarczająco wysokie do sekwencjonowania.

Aby zbadać możliwość zróżnicowania społeczności mikrokosmosów glebowych, porównaliśmy społeczności mikroorganizmów w mikrokosmosach kompostowych przygotowanych przez wzbogacenie tej samej początkowej gleby, kompostu klasy przemysłowej dostępnego w mieście Berkeley w Kalifornii, z różnymi produktami: jabłkami, papryką, pomarańczami lub ziemniakami (każdy zestaw w trzech egzemplarzach). Następnie porównaliśmy społeczności mikrobiologiczne w każdym środowisku kompostowym z mikrobiomem jelitowym C. elegans typu dzikiego wyhodowanego w odpowiednim mikrokosmosie. Analizę przeprowadzono na próbkach DNA wyekstrahowanych od około 500 sterylizowanych powierzchniowo dorosłych osób na mikrokosmos oraz z 250 mg próbek kompostu z odpowiednich mikrokosmosów.

Charakterystyka mikrobiomów środowiskowych, glebowych i jelitowych robaków opierała się na sekwencjonowaniu nowej generacji regionu V4 bakteryjnego genu 16S rRNA. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania zostało osiągnięte przy użyciu standardowych zestawów i przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta, przy czym sekwencjonowanie przeprowadzono na komercyjnym sekwencerze (patrz tabela materiałów). Demultipleksowane sekwencje zostały przetworzone przy użyciu DADA2, przypisano im taksonomię na podstawie referencyjnej bazy danych SILVA v132 i przeanalizowano za pomocą phyloseq16,17,18 (patrz plik uzupełniający 1, rysunek uzupełniający S1, rysunek uzupełniający S2, rysunek uzupełniający S3, tabela uzupełniająca S1 i tabela uzupełniająca S2 szczegółowy opis sekwencjonowania i analizy; pełny potok obliczeniowy jest dostępny w GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Surowe dane są dostępne w NCBI Sequence Read Archive (identyfikator bioprojektu PRJNA856419).

Średnio uzyskano 73 220 sekwencji na próbkę. Sekwencje te reprezentują 15 027 wariantów sekwencji amplikonów (ASV), obejmujących 27 typów i 216 rodzin, w tym rodziny uważane za część rdzenia mikrobiomu jelitowego C. elegans13, takie jak Rhizobiaceae, Burkholderiaceae i Bacillaceae. Enterobacteriaceae i Pseudomonadaceae, które wcześniej uznano za dominujących członków, tym razem stanowiły mniejszość, ale nadal były wzbogacone (2-10-krotnie) w porównaniu z odpowiednimi środowiskami glebowymi. Porównania oparte zarówno na odległościach nieważonych, jak i ważonych UniFrac19,20 wykazały dobrą odtwarzalność wśród mikrokosmicznych triplikatów wzbogaconych tym samym produktem, na co wskazuje ścisłe grupowanie. W przeciwieństwie do tego, środowiskowe mikrobiomy glebowe wzbogacone różnymi produktami grupowały się od siebie, wykazując zdolność do dywersyfikacji początkowej społeczności drobnoustrojów poprzez dodawanie różnych produktów (Rysunek 2).

W porównaniach mikrobiomów jelitowych robaków i społeczności środowiskowych, analiza głównych współrzędnych (PCoA) z nieważonymi lub ważonymi odległościami UniFrac wykazała wyraźne grupowanie mikrobiomów jelitowych robaków w stosunku do ich odpowiednich środowisk dla każdego typu mikrokosmosu (Rysunek 2). Podczas gdy PCoA oparte na nieważonych odległościach UniFrac nie rozróżniało mikrobiomów glebowych i robaków (Rysunek 2A), grupowanie oparte na odległościach ważonych ujawniło wyraźne oddzielenie mikrobiomów jelitowych i kompostowych robaków (Rysunek 2B). Wyniki te wspierają proces, w którym filtrowanie gospodarza wpływa na dostępność środowiskową w celu kształtowania mikrobiomu jelitowego, który nie jest całkowicie odrębny od swojego źródła środowiskowego pod względem obecności taksonów, ale moduluje ich liczebność poprzez wzbogacanie podzbioru dostępnych taksonów, co ostatecznie prowadzi do powstania mikrobiomu jelitowego robaka rdzeniowego współdzielonego przez robaki hodowane w różnych środowiskach.

Rysunek 2: Mikrobiomy jelitowe robaków grupujące się z dala od swoich zróżnicowanych środowisk mikrobiologicznych. Skład mikrobiomu określono za pomocą sekwencjonowania 16S, a zbiorowiska z mikrokosmosów wzbogaconych o wyznaczony produkt lub z wyhodowanych w nich robaków grupowano za pomocą PCoA w oparciu o (A) nieważone lub (B) ważone odległości UniFrac. Pokazane osie to te, które wyjaśniają największą zmienność w składzie zbiorowiska między próbkami (N = 3 dla każdego typu mikrokosmosu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Sekwencjonowanie nowej generacji i analiza danych. Poniżej przedstawiono kroki przygotowania biblioteki, sekwencjonowania w laboratorium i analizy danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Przykład wykresu kontroli jakości dla odwrotnych odczytów z jednej próbki. Oś X (cykl) pokazuje pozycję nukleotydu wzdłuż odczytanej sekwencji. Lewa oś Y pokazuje wynik jakości. Mapa cieplna w skali szarości reprezentuje częstotliwość oceny jakości w każdej pozycji nukleotydu; Zielona linia przedstawia medianę wyniku jakości w każdej pozycji nukleotydu; Górna pomarańczowa linia przedstawia kwartyle rozkładu Wyniku Jakości; dolna czerwona linia przedstawia procent odczytów sekwencji, które rozszerzyły tę pozycję nukleotydu (prawa oś Y, tutaj 100%). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Poziomy błędów dla różnych próbek. Częstość występowania błędów w różnych próbkach (czarne kropki) powinna zmniejszać się wraz ze wzrostem wyniku jakości dla każdego możliwego podstawienia par zasad, odzwierciedlając oczekiwany trend. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Przykład PCoA oparty na ważonych odległościach UniFrac. Nazwy grup pokazane w legendzie reprezentują produkty używane do wzbogacania kompostu używanego w różnych mikrokosmosach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Sekwencyjne filtrowanie sekwencji. ZALiczba odczytów sekwencji przed filtrowaniem. b-d Każda kolumna reprezentuje liczbę odczytów sekwencji pozostałych po kroku filtracji: odfiltrowanie odczytów o niskiej jakości (krok 2.5), algorytm odszumiania wykonywany przez dada() (krok 2.8), scalanie odczytów do przodu i do tyłu (krok 2.9) i usuwanie chimer (krok 2.11). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Tabela metadanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.