Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji i oczyszczania komórek jajnika z pęcherzyków antralnych. Omawiamy metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych, a także zbierania nienaruszonych pęcherzyków antralnych, które są traktowane enzymatycznie w celu uwolnienia wielu typów komórek rezydujących w pęcherzykach, w tym ziarnistości, osłonki, śródbłonka, komórek krwiotwórczych i zrębowych.

Streszczenie

Aktywacja, wzrost, rozwój i dojrzewanie oocytów to złożony proces, który jest koordynowany nie tylko między wieloma typami komórek jajnika, ale także między wieloma punktami kontroli w obwodzie podwzgórza/przysadki/jajnika. W jajniku rośnie wiele wyspecjalizowanych typów komórek w ścisłym związku z oocytem w pęcherzykach jajnikowych. Biologia tych komórek została dobrze opisana na późniejszych etapach, kiedy można je łatwo odzyskać jako produkty uboczne leczenia wspomaganego rozrodu. Jednak dogłębna analiza małych pęcherzyków antralnych izolowanych bezpośrednio z jajnika nie jest często przeprowadzana ze względu na niedobór ludzkiej tkanki jajnikowej i ograniczony dostęp do jajnika u pacjentek poddawanych zabiegom wspomaganego rozrodu.

Te metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych z jednoczesną identyfikacją/izolacją komórek rezydujących w jajnikach umożliwiają analizę w wysokiej rozdzielczości wczesnych etapów rozwoju pęcherzyków antralnych. Pokazujemy protokoły izolacji dyskretnych typów komórek poprzez enzymatyczne traktowanie pęcherzyków antralnych i oddzielanie komórek ziarnistych, osłonkowych, śródbłonkowych, krwiotwórczych i zrębowych. Izolacja komórek z pęcherzyków antralnych o różnych rozmiarach i stadiach rozwojowych umożliwia kompleksową analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych, które napędzają wzrost pęcherzyków i fizjologię jajników, a także stanowi źródło żywotnych komórek, które można hodować in vitro w celu odtworzenia mikrośrodowiska pęcherzyków.

Wprowadzenie

Podstawowymi funkcjonalnymi elementami ludzkiego jajnika są pęcherzyki, które regulują wzrost i rozwój oocytów. Protokoły izolacji komórek pęcherzykowych zostały dobrze ugruntowane w kontekście zapłodnienia in vitro, ale są one odpowiednie tylko dla pobierania komórek z pęcherzyków luteinizowanych w momencie pobierania oocytów¹. Opracowaliśmy protokół, który umożliwia izolację dyskretnych populacji komórek z pęcherzyków antralnych na różnych etapach rozwoju, które powstają z natywnych jajników lub ksenoprzeszczepionej tkanki jajnikowej². Chociaż panuje zgoda co do tego, że wkład komórek rezydujących w pęcherzykach jajnikowych w hodowlę oocytu jest bardzo ważny, niewiele badań prospektywnie zidentyfikowało i wyodrębniło unikalne podtypy fenotypowe obecne w pęcherzykach w stadium antralnym. Głębsze zrozumienie hierarchii różnicowania i transdukcji sygnału między wyspecjalizowanymi komórkami na różnych etapach rozwoju może poszerzyć naszą wiedzę na temat fizjologii jajników w warunkach homeostatycznych i patologicznych. Co więcej, rozróżnienie dyskretnych podtypów komórkowych i ich molekularnego wkładu we wzrost/dojrzewanie pęcherzyków może zapewnić sposób na generowanie substytutów ex vivo, które rekonstruują funkcję jajników w celu przyspieszenia dojrzewania oocytów i/lub leczenia dysfunkcji endokrynologicznych.

Każdy unikalny typ komórki w jajniku przyczynia się do złożonej funkcji pęcherzyka, który skutecznie funkcjonuje jako odrębny mini-organ wspomagający wzrost i dojrzewanie komórki jajowej, którą zawiera. Oocyt, centralna część pęcherzyka, jest bezpośrednio otoczony ciągłą warstwą komórek ziarnistych (GC), przy czym komórki osłonki (TC) tworzą wtórną warstwę komórek, które łączą się z oocytem i GC, tworząc jednostkę pęcherzykową. Chociaż dzielą się na dwie grupy, GC i TC zawierają liczne podtypy. GC są klasyfikowane zgodnie z ich położeniem w mieszku włosowym; GC otaczające oocyt w porównaniu z tymi, które przylegają do błony podstawnej, są oznaczone odpowiednio jako ooforyczne i ścienne GC, a te podtypy wykazują unikalne sygnatury transkryptomiczne. TC mają wiele podtypów, które działają w celu zapewnienia wsparcia steroidogennego, metabolicznego i strukturalnego. Komórki śródbłonka, okołonaczyniowe i odpornościowe odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowej fizjologii jajników. Zrąb jajnika służy nie tylko jako substrat do wzrostu pęcherzyków, ale prawdopodobnie stanowi również źródło komórek progenitorowych, które powodują powstawanie TC. Ten wielowarstwowy kompleks podtypów komórkowych w obrębie jajnika umożliwia jego funkcjonowanie zarówno jako narządu hormonalnego, jak i rozrodczego.

Ten artykuł przedstawia protokół identyfikacji i oczyszczania komórek ziarnistych, osłonowych, zrębowych, śródbłonkowych i krwiotwórczych z pęcherzyków antralnych. Wykorzystaliśmy ten protokół do wyizolowania tych komórek jajnika i przeanalizowania ich za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek, a następnie specyficznego barwienia pęcherzyków na różnych etapach rozwoju. Protokół zapewnia prostą metodologię, która jest powtarzalna i umożliwi analizę w wysokiej rozdzielczości zarówno fizjologii, jak i patologii jajnika.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Weill Cornell Medicine. Wszystkie eksperymenty ksenotransplantacyjne z wykorzystaniem tkanki jajnikowej przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Oba jajniki wyizolowano od 14-letniego dawcy narządów w stanie śmierci mózgowej, u którego nie stosowano radiochemioterapii ani nie stwierdzono chorób endokrynologicznych lub rozrodczych. Komitet Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Weill Cornell Medicine zatwierdził pobranie tkanki, a zgodę rodziny dawcy narządu uzyskano po uzyskaniu świadomej zgody na wykorzystanie tkanki.

1. Pobieranie i postępowanie z tkanką jajnika

1. Zebrać całe jajniki i związane z nimi tkanki, a następnie spłukać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
2. Za pomocą sterylnej pęsety umieść jajniki w sterylnym pojemniku. Wlać sterylny, zbuforowany, zimny roztwór (np. pożywkę L-15 firmy Leibovitz) do pojemnika. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie pokryta płynem.
3. Zamknij pojemnik i zapakuj go podwójnie za pomocą sterylnych plastikowych torebek. Pojemnik należy transportować na lodzie w izolowanym pudełku (np. styropian). Przenieś próbki do laboratorium, które przetworzy jajniki tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w czasie nieprzekraczającym 5 h^3,4.

2. Przetwarzanie tkanki jajnika

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i narzędzia są przygotowane przed dostarczeniem tkanki do laboratorium, aby maksymalnie skrócić okres niedokrwienny. można przygotować do 1 tygodnia przed zamrożeniem i przechowywać w lodówce do czasu użycia.

1. Preparaty do przetwarzania i zamrażania jajników
   1. Zestaw wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu przygotowania do przetwarzania tkanek: jeden skalpel numer 21; jeden skalpel numer 11; ostre, drobno zakrzywione nożyczki; jeden długi kleszcz (~150 mm długości) i dwa średnie kleszcze (~110 mm długości).
   2. Przygotować 100 ml pożywki do przetwarzania tkanek (patrz tabela materiałów): pożywki L-15 firmy Leibovitz zawierającej roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i przefiltrowanej za pomocą filtra 0,2 μm. Utrzymuj podłoże schłodzone.
   3. Oznaczyć kriowialisty, dodać 1,5 ml roztworu do zamrażania (patrz Tabela Materiałów) do każdej fiolki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   4. Miej pod ręką płytkę 6-dołkową do użytku.
2. Po przybyciu tkanki
   1. Spryskaj pojemnik 70% roztworem etanolu, dokładnie wytrzyj i umieść go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Zakładając sterylne rękawiczki, otwórz pojemnik. Umieścić jajnik na sterylnej szalce Petriego i zalać schłodzonym podłożem (z kroku 2.1.2) w celu nawodnienia tkanki. Upewnij się, że jajnik jest do połowy zanurzony w pożywce.
   3. Usuń wszelkie szwy lub inny materiał i wypreparuj pozostałą otaczającą tkankę z dala od jajnika.

3. Izolacja pęcherzyków antralnych

1. Zidentyfikuj poszczególne mieszki włosowe do izolacji. Wybierając zdrowe mieszki włosowe, wyklucz wszelkie pęcherzyki wypełnione krwią, ciemne lub niesymetryczne, ponieważ mogą one być akretyczne.
2. Odizoluj wybrane pęcherzyki antralne od całego jajnika za pomocą skalpeli, utrzymując antrum w stanie nienaruszonym poprzez wycięcie tkanki korowej otaczającej pęcherzyk.
3. Umieść każdy wycięty nienaruszony pęcherzyk antralny w jednym dołku 6-dołkowej płytki. Jeśli jest to potrzebne do celów opisowych, użyj linijki umieszczonej pod naczyniem, aby określić średnicę mieszków włosowych.
4. Za pomocą skalpela przeciąć nienaruszony pęcherzyk antralny, aby uzyskać dostęp do jamy antralnej i dodać 4 ml enzymatycznego podłoża do oddzielania komórek. Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C przez 10 minut.
5. W razie potrzeby powtórz ekstrakcję dodatkowych pęcherzyków antralnych.

4. Izolacja komórek rezydujących w pęcherzykach

1. Po inkubacji dodać 4 ml dostępnej pożywki zawierającej 20% FBS i przepłukać przez wielokrotne, energiczne pipetowanie pożywki na półdzielone pęcherzyki za pomocą mikropipety P1,000.
2. Zebrać pożywkę i przepuścić ją przez filtr 100 μm.
3. Odwirować przefiltrowany supernatant w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odessać supernatant i odłożyć osad komórkowy (wzbogacony o GC) na lodzie w celu znakowania i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
4. Umieścić pozostałą tkankę w mieszaninie kolagenazy (100 U/ml) i dyspazy (1 U/ml) rozcieńczonej w zrównoważonym roztworze soli fizjologicznej (np. Hanks) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C, mechanicznie niszcząc tkankę przez rozcieranie i energiczne pipetowanie (tj. 10-15 przejść przez końcówkę pipety) dwa razy po 10 minutach i 20 minutach.
5. Odzyskaj pożywkę zawierającą tkankę, przepłucz przez pipetowanie przez końcówkę mikropipety P1 000 i przecedź przez filtr 100 μm.
6. Wirować w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 min. Odessać supernatant i odłożyć na bok osad komórkowy (wzbogacony o TC i komórki zrębu) na lodzie w celu znakowania i FACS.

5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

1. Zawiesić osady komórkowe w roztworze blokującym (PBS + 0,1% FBS) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
2. Odwirować w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 minuty i odessać sklarowany nad osadem.
3. Zawiesić osady komórkowe w roztworze blokującym zawierającym bezpośrednio sprzężone przeciwciała (patrz Tabela 1 w celu uzyskania odpowiednich kombinacji przeciwciał w celu identyfikacji GC i TC) i inkubować na lodzie przez 10 minut.
4. Umyć i odwirować komórki w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS zawierającym 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i przepuścić zawiesinę komórkową przez przyrząd FACS w celu wychwycenia małej populacji komórek (500-1000) przy użyciu intensywności fluorescencji przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do bramkowania.
5. W celu identyfikacji unikalnych subpopulacji wykorzystaj następujące strategie bramkowania:
   1. W celu oczyszczenia GC narysuj bramkę wokół komórek CD45⁺ (Rysunek 1B) i wyklucz tę populację z populacji CD99⁺ (Rysunek 1A i Rysunek 1C); następnie dalej podziel pozostałą frakcję CD99⁺ na frakcje PVRL^+/- ( Rysunek 1A i Rysunek 1C).
   2. W celu oczyszczenia TC i zrębu należy przeszukać całkowitą populację ENG⁺ (Rysunek 1A) lub CD55⁺ (Figura 1D), aby wykluczyć frakcję śródbłonka CD34 ⁺ (Figura 1E) i rozróżnić komórki steroidogenne (ANPEP⁺) i niesteroidogenne (ANPEP^-). Należy uważać, aby skompensować przenikanie między fluoroforami, które znajdują się blisko widm emisyjnych.
6. Aby zweryfikować czystość posortowanej frakcji komórek, przepuść 5% całkowitej przechwyconej objętości przez instrument FACS i upewnij się, że komórki wypełniają oczekiwane bramki i mają czystość >95%.

6. Przetwarzanie tkanki korowej jajnika

1. Przeciąć pozostałą część jajnika na pół i wyciąć rdzeń za pomocą zakrzywionych cienkich nożyczek i skalpeli, uważając, aby uniknąć uszkodzenia kory jajnika.
2. Kontynuuj przetwarzanie i rozrzedzanie kory jajnika poprzez delikatne skrobanie, aż pozostanie minimalny rdzeń. Upewnij się, że używasz minimalnej wymaganej siły.
   UWAGA: Grubość tkanki korowej powinna wynosić od 1 mm do 1,5 mm.
3. Podziel tkankę korową na paski o szerokości 2-3 mm wzdłuż jajnika.

7. Powolne zamrażanie tkanki jajnikowej

1. Przygotowanie do zamrażania
   1. Umieścić jeden pasek korowy w każdej schłodzonej fiolce kriogenicznej zawierającej roztwór do zamrażania.
   2. Potrząsać fiolkami kriogenicznymi zawierającymi paski korowe na obracającej się płytce przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
2. Powolne zamrażanie tkanki jajnikowej⁵
   1. Umieścić kriowiale zawierające tkankę jajnika w programowalnej zamrażarce ustawionej na start w temperaturze 0 °C.
   2. Schłodzić z prędkością 2 °C/min do -7 °C.
   3. Utrzymuj kriowiale w tej temperaturze przez 10 minut.
   4. Zanukleatyzować tworzenie się kryształków lodu, dotykając każdego kriowialu bawełnianą końcówką, która została na krótko zanurzona w ciekłym azocie (LN₂).
   5. Schłodzić z szybkością 0,3 °C/min, aż temperatura próbki osiągnie -40°C.
   6. Zwiększać szybkość chłodzenia do 10 °C/min, aż temperatura próbki osiągnie −140 °C.
   7. Przenieść kriowiale do przechowywania w LN₂.

Wyniki

Izolowaliśmy pęcherzyki z powierzchni jajnika i potraktowaliśmy je enzymatycznie, aby wyizolować GCs, jak również komórki osłonki i zrębu otaczające jamę antralną. Komórki zostały zebrane, a frakcje komórek zostały posortowane z pęcherzyków antralnych (średnice w zakresie od 0,5 mm do 4 mm) za pomocą FACS do czystości >95% (Rysunek 1).

Aby oznaczyć i oczyścić unikalne frakcje komórkowe w ludzkich pęcherzykach antralnych, połączyliśmy trawienie enzymatyczne z sort...

Dyskusja

Lepsza rozdzielczość różnorodności komórkowej w pęcherzykach jajnikowych jest klinicznie ważna z kilku powodów. Stosując powyższy protokół do izolacji unikalnych podtypów fenotypowych, które znajdują się w pęcherzykach w stadium antralnym, należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Po pierwsze, zdrowie i żywotność tkanki jajnika, z której pochodzi pęcherzyk antralny, ma kluczowe znaczenie dla określenia jakości komórek i powodzenia dalszych zastosowań. Można to zoptymalizować, minimalizując interwał niedokrwienny, pracując ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemikalia, odczynniki
Antybiotyk-Antybiotyk 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Anti Anti Mountant roztwór	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenaza od  Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, proszek	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimetylosulfotlenek
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Thermo Fisher Scientific	14190144
Medium do odrywania komórek enzymatycznych	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Zbilansowany roztwór soli	Thermo Fisher Scientific	14175079	bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej
Leibovitz' s L-15 średni	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normalna jakość soli	fizjologicznej Biologiczna	114-055-101
Milipore sacharozy	Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 ml, przefiltrowane przez filtr 0,2 mikrona)
- 69,64 ml L-15-17,66
ml bydła płodowego
- 3,42 g sacharozy
- 10,65 ml DMSO-
1 ml antybiotykowo-przeciwgrzybiczo
laboratoryjne wyroby i materiały do tworzyw sztucznych
6-dołkowe przezroczyste płaskie dno nieleczone	Corning	351146
Falcon Cell Sitko 100 & mikro; m	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1,8 ml
szalka Petriego, gł. x wys. 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Probówki z polistyrenu z okrągłym dnem i zatrzaskiem z sitkiem komórkowym, 5 ml	Fisher scientific	352235	Corning,
System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania Falcon, 0,22 i mikro; m	Corning	431154
przeciwciała
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R& D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
narzędzia chirurgiczne
długie kleszcze (~150 mm długości)	Fisherbrand	12-000-128	Kleszcze średnie Fisher Scientific
(długość ~110 mm)	Fisherbrand	12-000-157
Skalpel Fisher Scientific numer 21	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
skalpel numer 11	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
ostre, drobno zakrzywione nożyczki	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Aktywowany fluorescencją sortownik komórek	BD
LSM 710 META Mikroskop konfokalny	Zeiss