Artykuł metodologiczny

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64403

⸱

5 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

Streszczenie

Inaktywacja genów jest kluczowa dla badania funkcji genów i stanowi obiecującą strategię leczenia szerokiego zakresu chorób. Wśród tradycyjnych technologii, interferencja RNA cierpi z powodu częściowego zniesienia celu i konieczności leczenia przez całe życie. W przeciwieństwie do tego, sztuczne nukleazy mogą narzucać stabilną inaktywację genów poprzez indukcję pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB), ale ostatnie badania kwestionują bezpieczeństwo tego podejścia. Ukierunkowana edycja epigenetyczna za pomocą zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) może stanowić rozwiązanie, ponieważ pojedyncze podanie określonych kombinacji ETR może prowadzić do trwałego wyciszenia bez wywoływania pęknięć DNA.

ETR to białka zawierające programowalną domenę wiążącą DNA (DBD) i efektory z naturalnie występujących represorów transkrypcji. W szczególności wykazano, że połączenie trzech ETR wyposażonych w domenę KRAB ludzkiego ZNF10, domenę katalityczną ludzkiego DNMT3A i ludzkiego DNMT3L, indukuje dziedziczne represyjne stany epigenetyczne w genie docelowym ETR. Charakter tej platformy typu "uderz i uciekaj", brak wpływu na sekwencję DNA celu oraz możliwość powrotu do stanu represyjnego poprzez demetylację DNA na żądanie, sprawiają, że wyciszanie epigenetyczne jest narzędziem zmieniającym zasady gry. Kluczowym krokiem jest identyfikacja właściwej pozycji eTR w genie docelowym, aby zmaksymalizować wyciszenie na celu i zminimalizować wyciszenie poza celem. Wykonanie tego etapu w końcowych warunkach przedklinicznych ex vivo lub in vivo może być uciążliwe.

Biorąc pod uwagę system CRISPR/katalitycznie martwy Cas9 jako paradygmatyczny DBD dla ETR, ten artykuł opisuje protokół składający się z badania in vitro przewodnikowych RNA (gRNA) sprzężonych z kombinacją potrójnego ETR w celu skutecznego wyciszania na celu, a następnie oceny profilu specyficzności dla całego genomu najlepszych trafień. Pozwala to na zredukowanie początkowego repertuaru potencjalnych gRNA do krótkiej listy obiecujących, których złożoność jest odpowiednia do ich ostatecznej oceny w terapeutycznie istotnym otoczeniu będącym przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Inaktywacja genów tradycyjnie odgrywała kluczową rolę w badaniu funkcji genów zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych. Co więcej, w ciągu ostatnich dwóch dekad, wraz z rozwojem terapii genowej, została ona zaproponowana jako potencjalnie przełomowe podejście do leczenia chorób spowodowanych mutacjami powodującymi wzmocnienie funkcji1, infectious diseases2, czyli patologie, w których wyciszenie jednego genu może zrekompensować dziedziczną wadę u innego3. Wreszcie, zaproponowano genetyczną inaktywację kluczowych regulatorów sprawności komórek i kontroli funkcjonalnej w celu zwiększenia skuteczności produktów komórkowych w immunoterapii nowotworów4 i medycyna regeneracyjna5.

Wśród różnych technologii do inaktywacji genów, jedną z najbardziej obiecujących jest ukierunkowane epigenetyczne wyciszanie6,7. U podstaw tej technologii leżą tak zwane inżynieryjne represory transkrypcyjne (ETR), chimeryczne białka składające się z programowalnej domeny wiążącej DNA (DBD) i domeny efektorowej (ED) o epigenetycznej funkcji represyjnej. Białka palca cynkowego (ZFPs)8, efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEs)9, lub DBD oparte na CRISPR/dCas910 mogą być zaprojektowane tak, aby selektywnie wiązać ED z sekwencją promotora/wzmacniacza docelowego genu, który ma zostać wyciszony. Po dotarciu na miejsce, ED ETR wykonuje swoją aktywność wyciszającą, nakładając represyjne znaczniki epigenetyczne indukujące heterochromatynę, takie jak modyfikacje histonów (H3K911,12 lub H3K2713 metylacja, deacetylacja H3 lub H414) i metylacja DNA CpG15, zgodnie z użytą domeną represyjną.

W szczególności, zainspirowany molekularnymi procesami permanentnej represji transkrypcyjnej endogennych retrowirusów występujących w preimplantacyjnym embryo16, wygenerowano kombinację trzech ETR w celu wykorzystania następujących ED: i) domena pola związanego z Krüppelem (KRAB) ludzkiego ZNF10; (ii) domena katalityczna metylotransferazy 3A de novo DNA człowieka (DNMT3A); oraz iii) metylotransferaza 3-podobna do ludzkiego DNA na pełnej długości (DNMT3L). KRAB jest konserwatywną domeną represyjną współdzieloną przez kilka ZFP u wyższych kręgowców17,18, którego działanie wyciszające opiera się głównie na zdolności do rekrutacji KAP119-białko rusztowania, które następnie oddziałuje z kilkoma innymi induktorami heterochromatyny20-zawierający kompleks przebudowy i deacetylacji nukleosomów (NuRD)21, metylotransferaza histonów H3K9 SETDB122, oraz czytnik metylacji H3K9 HP123,24, między innymi.

DNMT3A aktywnie przenosi grupy metylowe na DNA w sekwencjach CpG25. Aktywność katalityczna DNMT3A jest wzmocniona przez jego fizyczne powiązanie z DNMT3L, paralogiem DNMT3A ograniczonym do zarodka i komórek rozrodczych, pozbawionym domeny katalitycznej odpowiedzialnej za transfer grup metylowych26,27. Metylacja DNA w regionach bogatych w CpG - określanych jako wyspy CpG (CGI) - osadzonych w elementach promotora/wzmacniacza genów ssaków jest zwykle związana z wyciszaniem transkrypcji28. Co ważne, po zdeponowaniu, metylacja CpG może być stabilnie dziedziczona podczas mitozy przez kompleks molekularny oparty na UHRF1-DNMT129.

Stabilna nadekspresja ETR-ów w komórce docelowej może być problematyczna, prawdopodobnie z powodu rosnącego ryzyka aktywności niezamierzonej i wypierania endogennych interaktorów z ich fizjologicznych miejsc docelowych w miarę upływu czasu. Jednak przejściowa ekspresja pojedynczych ugrupowań ETR może nie wywołać długotrwałego wyciszenia z wysoką skutecznością30, utrudniając ich zastosowanie terapeutyczne. W związku z tym przełomem w tej dziedzinie był dowód na to, że połączenie trzech ETR opartych na KRAB, DNMT3A i DNMT3L może synergizować i, nawet jeśli są tylko przejściowo współdostarczane, narzucać sekwencję promotorową docelowego genu H3K9 i metylację CpG. Są one następnie odczytywane i rozmnażane przez komórkę podczas mitozy, co prowadzi do dziedzicznego wyciszenia w wielu ludzkich i mysich liniach komórkowych, a także w komórkach pierwotnych hodowanych ex vivo30.

Warto zauważyć, że epigenetyczne wyciszenie narzucone przez ETR może zostać cofnięte na żądanie przez celowe (np. rekrutacja demetylazy DNA TET1 opartej na CRISPR/dCas9 na wyciszone locus) lub farmakologiczne (podanie inhibitora metylotransferazy DNA 5-Aza) demetylacji DNA30, potencjalne antidotum w przypadku zdarzeń niepożądanych związanych z ETR. Opisano również uniwersalne ETR-y zawierające trzy ED-y oparte na KRAB, DNMT3A i DNMT3L, wykazujące znaczną skuteczność wyciszania w liniach komórkowych31,32 w stosunku do zdecydowanej większości genów kodujących białka. Co więcej, w kilku badaniach z zastosowaniem ETR stwierdzono wysoki profil bezpieczeństwa, bez istotnej aktywności niezgodnej z celem w zakresie metylacji de novo CpG lub zmiany dostępności chromatyny30,31,32. Przed zastosowaniem klinicznym zaleca się jednak przeprowadzenie dedykowanej analizy profilu swoistości ETR wyposażonych w nowo zaprojektowany DBD.

Z klinicznego punktu widzenia, ukierunkowane wyciszanie epigenetyczne może przynieść kluczowe korzyści zarówno dla knockdownu opartego na interferencji RNA (RNAi)33, jak i sztucznego zakłócenia genów opartego na nukleazie8. W przeciwieństwie do RNAi, ukierunkowane wyciszanie epigenetyczne może powodować pełne zniesienie celu na komórkę i nie wymaga okresowego leczenia w celu zapewnienia długotrwałego wyciszenia; w przeciwieństwie do rozerwania genu, pozostawia sekwencję DNA niezmienioną, unikając generowania pęknięć dwuniciowych DNA (DSB). DSB mogą następnie indukować apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego, potencjalnie prowadząc do selekcji przeciwko komórkom z funkcjonalnym szlakiem p5334,35 i, szczególnie w ustawieniach edycji genów multipleksowych, rearanżacje chromosomów35. Ponadto, przekazując nieodwracalny wynik mozaiki naprawy DSB za pośrednictwem niehomologicznego łączenia końców DNA36, zakłócenie genu nie może uniknąć naprawy celu w ramce do funkcjonalnych sekwencji kodujących jako jednego z końcowych wyników i, w przeciwieństwie do wyciszania epigenetycznego, nie może zostać usunięte na żądanie.

Wreszcie, wyciszanie epigenetyczne ma potencjał, aby poszerzyć zakres docelowych elementów genetycznych do klas całkowicie lub przynajmniej częściowo opornych na RNAi i zakłócenia genów, takich jak nietranskrybowane elementy regulatorowe i niekodujące RNA30,32. Pierwszym krytycznym krokiem dla każdego ukierunkowanego zastosowania wyciszania epigenetycznego jest zaprojektowanie panelu ETR obejmującego różne sekwencje regulatorowe genu docelowego i zidentyfikowanie tych najbardziej wydajnych. Liczba ETR-ów do przetestowania może być kluczowa, biorąc pod uwagę rosnącą część genomu, która może być celem programowalnych technologii wiązania DNA, które są stale rozwijane37. Przeprowadzenie badań przesiewowych ETR bezpośrednio na typie komórki, w którym można by terapeutycznie wyciszyć gen docelowy, stanowiłoby najodpowiedniejszą opcję. Jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe mogą być technicznie kłopotliwe w komórkach pierwotnych ze względu na ich ograniczoną przeżywalność w hodowli i często nieoptymalną zdolność inżynieryjną. Ekrany na dużą skalę mogą być jeszcze bardziej niewykonalne in vivo.

Bardziej praktyczna alternatywa polega na przeprowadzeniu wstępnego badania przesiewowego dużego panelu ETR-ów w łatwych do inżynierii liniach komórkowych, a następnie walidacji tylko tych najbardziej obiecujących w terapeutycznie istotnym typie komórki. Równoległą kwestią jest dobór odpowiedniego odczytu do pomiaru skuteczności wyciszania ETR-ów. Bezpośrednia ocena poziomów transkryptu lub białka docelowego genu za pomocą RT-qPCR, western blot lub ELISA może być kosztowna i czasochłonna oraz może nie mieć wystarczającej czułości, co ogranicza ich zastosowanie w skalach wysokoprzepustowych. Generowanie ad hoc zmodyfikowanych linii komórek reporterowych, w których fluorofor jest umieszczany pod kontrolą transkrypcyjną sekwencji regulatorowych genu docelowego, pozwala na wykorzystanie podejścia opartego na cytometrii przepływowej do odczytu wyciszenia epigenetycznego na poziomie pojedynczej komórki i w tempie wysokiej przepustowości.

Zgodnie z tymi ogólnymi rozważaniami, ten artykuł opisuje protokół składający się z in vitro uporządkowanego ekranu ETR dla skuteczności wyciszania na celu, a następnie oceny aktywności poza celem w całym genomie najlepszych trafień. Taki przebieg pracy pozwala na zredukowanie początkowego repertuaru potencjalnych ETR-ów do krótkiej listy obiecujących, których złożoność jest odpowiednia do ich ostatecznej oceny w terapeutycznie istotnym typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania.

Wśród różnych programowalnych DBD, które mogą być wykorzystane do generowania ETR, ten protokół skupi się na technologii opartej na CRISPR/dCas9, ze względu na łatwość projektowania gRNA obejmujących promotor docelowego genu w skali wysokoprzepustowej. Jednak ten sam koncepcyjny przepływ pracy opisany poniżej można zastosować do oceny wydajności i specyfiki ETR wyposażonych w inne DBD.

Protokół

1. Inżynieria opartej na fluorescencji linii komórek reporterowych do monitorowania aktywności transkrypcyjnej docelowego genu za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zidentyfikuj linie komórkowe wykazujące ekspresję docelowego genu, który ma zostać wyciszony. Przejrzyj gen docelowy, który ma zostać wyciszony w Human Protein Atlas38 i przejdź przez jego sekcję "Linia komórkowa", aby zidentyfikować te linie, które reprezentują tkankę somatyczną będącą przedmiotem zainteresowania (np. linię komórkową wątroby, jeśli końcowymi celami są hepatocyty wątroby). Alternatywnie, przeszukaj publicznie dostępną bazę danych sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) (np. NCBI GEO).
  2. Wśród kandydatów priorytetowo należy wybrać linie komórkowe, dla których dostępne są skuteczne protokoły dostarczania genów przejściowych - kluczowe dla dostarczania ETR.
    UWAGA: Wśród różnych modalności, nukleofekcja stanowi jedną z najlepszych opcji, ponieważ zapewnia wysoką wydajność transfekcji. W tym przypadku ludzkie komórki erytroluksemii K-562 zostały wybrane do wygenerowania linii komórkowej raportującej aktywność transkrypcyjną genu beta-2-mikroglobuliny (B2M) (zwanego dalej komórkami B2MTdTomato K-562).
  3. Ponadto należy nadać priorytet kandydatom, aby uniknąć linii komórkowych, w których gen docelowy jest niezbędny do żywotności komórki, ponieważ upośledza to utrzymanie komórek ze stabilnym wyciszeniem genu docelowego w hodowli. Jeśli nie zostało to wcześniej zgłoszone, aby mieć poczucie istotności docelowego genu w wybranym typie komórki, wygeneruj kontrolę zakłóceń genetycznych poprzez transfekcję komórek nukleazą Cas9 i gRNA ukierunkowanym na jeden z pierwszych kodujących eksonów genu.
    UWAGA: Zakłócenie genetyczne jest z definicji zdarzeniem stabilnym; Kontrselekcja zaburzonych komórek w czasie wskazuje, że gen docelowy jest niezbędny dla fizjologii wybranej komórki.
    1. Zidentyfikuj docelową izoformę splicingu, która jest preferencyjnie stosowana w wybranej linii komórkowej (izoforma NM_004048.4 genu B2M jest ukierunkowana w tym protokole).
    2. Zidentyfikuj gRNA, które może skutecznie i specyficznie ciąć w pierwszym egzonie kodującym docelowej izoformy (np. Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, które jest ważnym i przyjaznym dla użytkownika narzędziem do selekcji gRNA online).
    3. W przypadku komórek K-562 należy transfekować 1 μg plazmidu kodującego spCas9 (hCas9; patrz tabela materiałów) i 250 ng plazmidu kodującego gRNA (phU6-gRNA; patrz tabela materiałów) na 5 × 105 komórek poprzez nukleofekcję (zgodnie z instrukcjami producenta).
    4. Hoduj komórki (komórki K-562 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w RPMI-1640 uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], L-glutaminą i penicyliną/streptomycyną [100 U/ml]) i monitoruj poziomy zakłóceń genów w czasie, wykorzystując zestaw do wykrywania mutacji (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).
  4. Sklonuj matrycę dawcy do integracji za pośrednictwem rekombinacji homologicznej reportera fluorescencyjnego pod kontrolą transkrypcyjną docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania (Ryc. 1).
    1. Zidentyfikuj region docelowego genu, aby zintegrować kasetę ekspresji fluoroforu.
      UWAGA: Unikaj celowania w elementy istotne dla transkrypcji, takie jak wyspy CpG i regiony wzbogacone o acetylację H3K27 (marker aktywnych promotorów i wzmacniaczy). Zmiana tych elementów regulacyjnych (potencjalnie ważnych, które powinny być celem ETR w celu poinstruowania wyciszania epigenetycznego) sprawia, że linia komórkowa reporterowa jest mniej predykcyjna w zakresie fizjologicznej regulacji genu docelowego.
      1. Jeśli gen docelowy nie koduje wydzielanego białka, należy połączyć reporter z ostatnim kodonem genu docelowego za pomocą peptydu samorozszczepiającego 2A, aby utrzymać funkcjonalność genu docelowego.
      2. Jeśli gen docelowy koduje wydzielane białko, aby uniknąć potencjalnego wydzielania reportera, umieść reporter w regionie intronowym genu docelowego. Integracja siły reportera w splicingowanym transkryptie przez miejsce akceptora splicingu (SA), a następnie translacja przez wewnętrzną sekwencję wejściową rybosomu (IRES) upośledza funkcjonalność genu docelowego.
    2. Użyj Chopchop, aby wybrać cięcie gRNA w regionie docelowym (tutaj gRNA jest wybierane tak, aby celować w sekwencję 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ pierwszego intronu genu B2M).
    3. Zaprojektuj matrycę dawcy dla miejsca cięcia gRNA, składającą się z: i) lewego ramienia homologicznego (n par zasad [bp] pasujących do regionu tuż przed miejscem cięcia gRNA); ii) kaseta ekspresji transgenu bez promotora (w przedstawionym tu przypadku poli(A) SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH faworyzująca splicing z pierwszym intronem genu B2M); oraz iii) prawe ramię homologiczne (n bp pasujące do regionu poniżej miejsca cięcia gRNA).
      UWAGA: Długość ramion homologii niezbędnej do skutecznego wywołania rekombinacji homologicznej może się różnić w zależności od typu komórek (100-500 pz to właściwy zakres dla komórek K-562).
  5. Dostarczyć system nukleazy CRISPR/Cas9 i matrycę dawcy do docelowej linii komórkowej. W przypadku komórek K-562 należy przetransfekować 1 μg plazmidu kodującego spCas9 (hCas9; patrz tabela materiałów), 250 ng plazmidu kodującego gRNA (phU6-gRNA; patrz tabela materiałów) i 1 μg plazmidu kodującego matrycę dawcy na 5 × 105 komórek poprzez nukleofekcję (zgodnie z instrukcjami producenta).
  6. Hodować komórki przez co najmniej 14 dni (w przypadku komórek K-562) i monitorować poziomy ekspresji fluorescencyjnego reportera w czasie za pomocą cytometru przepływowego (aktywować kanał fikoerytryny (PE) w celu pomiaru intensywności fluorescencji reportera tdTomato i postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykonywania cytometrii przepływowej).
    UWAGA: Matryca dawcy - zwłaszcza jeśli jest oparta na plazmidzie - może zawierać tajemnicze sekwencje promotorowe, prowadzące do ekspresji fluorescencyjnego reportera z niezintegrowanych kopii dawcy. Hodowla komórek pozwala na rozcieńczenie tych niezintegrowanych kopii przez podział komórki i ostatecznie utrzymanie ekspresji reportera tylko z kopii dawcy zintegrowanych z genomem docelowym.
  7. Klonuj komórki reporterowo-dodatnie poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) na poziomie pojedynczej komórki. W przypadku tego protokołu aktywuj kanał PE, aby zmierzyć intensywność fluorescencji reportera tdTomato i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby posortować pojedyncze tdTomato-dodatnie komórki K-562 na dołek 96-dołkowej płytki.
  8. Po namnażaniu komórek w hodowli (zwykle 20-30 dni w przypadku komórek K-562), należy przeprowadzić badanie przesiewowe klonów reporterowych za pomocą PCR, aby wybrać taki, który ma bialleliczną integrację kasety reporterowej wewnątrz locus docelowego.
    UWAGA: Maksymalizuje to ekspresję reporterową i ułatwia dalszą rozdzielczość między komórkami wyrażającymi reporter i wyciszonymi reporterowo za pomocą cytometrii przepływowej po leczeniu ETR.
    1. Ekstrahować genomowe DNA z 1 × 105 komórek na klon z dodatnim wynikiem reporterowym za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (zgodnie z instrukcjami producenta).
    2. Amplifikuj obszar docelowy B2M za pomocą starterów do przodu (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') i do tyłu (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') zgodnie z instrukcjami zestawu do amplifikacji PCR. Temperatura wyżarzania dla tej pary starterów wynosi 47,7 °C przy polimerazach DNA na bazie Taq i stężeniach starterów 0,5 μM.
    3. Przeanalizować produkt PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym (zgodnie z instrukcjami producenta). Ekran dla klonów pokazujący pasmo związane z integracją tdTomato w locus celu B2M (3 413 pz), bez pasma związanego z locus celu typu dzikiego (1 027 pz).

2. Projektowanie gRNA do epigenetycznego wyciszania docelowego genu opartego na CRISPR/dCas 9

  1. Przeglądaj gen docelowy w przeglądarce genomu UCSC40 i wyodrębnij sekwencję nukleotydów regionów potencjalnie regulujących jego aktywność transkrypcyjną, takich jak wyspy CpG i miejsca wzbogacone o acetylację H3K27 (marker aktywnych promotorów i wzmacniaczy).
    UWAGA: Zgodnie z niedawnym badaniem, najlepszym regionem docelowym jest okno o długości 1 kilozasady (kb) wyśrodkowane w miejscu rozpoczęcia transkrypcji docelowego genu 32.
  2. Wklej wybrane sekwencje w narzędziu online Chopchop i wybierz represję jako cel odzyskania gRNA. Poczekaj, aż Chopchop dostarczy listę gRNA zmapowanych na interesującej nas sekwencji genetycznej i wymienionych zgodnie z wynikiem uwzględniającym zarówno liczbę dopasowań poza celem, jak i przewidywaną skuteczność w celu (Rysunek 2).
  3. Wybierz co najmniej 10 gRNA na sekwencję docelową. Jeśli to możliwe, spróbuj wybrać gRNA obejmujące cały region do przesłuchania, bez pełnych dopasowań z innymi sekwencjami wewnątrzgenowymi w całym genomie.

3. Tablicowe przejściowe dostarczanie ETR opartych na CRISPR/dCas 9 w linii komórki reporterowej

  1. Spośród systemów dostarczania transgenów zgłoszonych wcześniej dla docelowej linii komórkowej, wybierz te, które pozwalają tylko na przejściową ekspresję transgenu, maksymalizując wydajność dostarczania i minimalizując toksyczność związaną z manipulacją komórkami. W przypadku komórek K-562 wysoce zalecana jest zarówno nukleofekcja plazmidu, jak i mRNA, przy czym produkcja plazmidu stanowi technicznie łatwiejszą i tańszą alternatywę.
  2. Sklonuj zarówno gRNA wybrane w sekcji 2, jak i ETR oparte na CRISPR/dCas9 w wybranym systemie dostarczania transgenu. Zapoznaj się z poniższymi krokami, aby zapoznać się z protokołem klonowania ETR w plazmidowych DNAs.
    UWAGA: Plazmidy kodowane oddzielnie dla dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A i dCas9:DNMT3L30 nie są dostępne w Addgene. Zostały one sklonowane przez zastąpienie transaktywatora VP160 z plazmidu pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (patrz Tabela materiałów) sekwencją kodującą domenę KRAB, DNMT3A lub DNMT3L30. Kodowanie plazmidu dla ETR typu "wszystko w jednym", oznaczone jako CRISPRoff-v2.132, jest dostępne (patrz Tabela materiałów).
    1. Przekształć plazmidy kodujące ETR w chemicznie kompetentnych komórkach E. coli (zgodnie z instrukcjami producenta). Przebadaj kolonie pod kątem obecności plazmidu zawierającego ETR poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowanie Sangera, a na koniec wybierz jedną z dodatnich kolonii do produkcji plazmidowego DNA Midiprep (zgodnie z instrukcjami producenta).
    2. Sklonuj gRNA wewnątrz szkieletu phU6-gRNA (Rysunek 3).
      1. Korzystając z oprogramowania do projektowania biologii molekularnej, dołącz sekwencję 5'-CACCG-3' przed protospacerem (pierwsza zmienna 20 nukleotydów [nt] wybranego gRNA), aby wygenerować oligo in silico o długości 25 nt, określany jako SGfw.
      2. Podobnie, dołącz sekwencję 5'-AAAC-3' przed odwrotnym dopełnieniem protospaceru wybranego gRNA i 5'-C-3' za nim, aby wygenerować oligonus o długości 25 nt, określany jako SGrv.
      3. Uporządkuj zarówno sekwencje SGfw, jak i SGrv jako jednoniciowe oligonukleotydy DNA bez soli, zawieszone w wodzie o stężeniu 100 μM.
      4. Dodać 1 μl każdego oligo do 2 μl buforu do wyżarzania (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) i 16 μl wody.
      5. Wyżarzanie oligonucyklocytowe należy przeprowadzić, umieszczając roztwór w termocyklerze zaprogramowanym na rozpoczęcie pracy w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Następnie stopniowo schładzać do temperatury 25 °C przez 45 minut.
      6. Rozcieńczyć 1 μl wyżarzonych oligonukleotydów 99 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie podwiązać 1 μl tego rozcieńczenia 50 ng plazmidu phU6-gRNA uprzednio strawionego enzymem restrykcyjnym BsaI (postępuj zgodnie z instrukcjami dostawców BsaI i zestawów ligazy dotyczących procedury trawienia i ligacji).
      7. Przekształć 20 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli z 2 μl produktu ligacji (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi procedury transformacji).
      8. Wybierz wiele kolonii do produkcji plazmidowego DNA Miniprep (postępuj zgodnie z instrukcjami sprzedawcy) i kontroluj pomyślne klonowanie protospaceru przez sekwencjonowanie Sangera z następującym starterem pasującym do promotora U6 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Wybierz jedną z dodatnich kolonii do produkcji plazmidowego DNA Midiprep (postępując zgodnie z instrukcjami producenta).
  3. Dostarcz wybrane gRNA i ETR oparte na CRISPR/dCas9 do linii komórek reporterowych w macierzy (jeden specyficzny gRNA na warunek) (Rysunek 3).
    UWAGA: Jako reprezentatywny przypadek, przepływ pracy dla nukleofekcji plazmidów kodujących dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L i gRNA ukierunkowanych na wyspę B2M CpG w komórkach B2MTdTomato K-562 pokazano w następujących krokach.
    1. Przygotuj oddzielne probówki zawierające 500 ng każdego z plazmidów kodujących dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- i dCas9:DNMT3L, ale różniących się dla badanego gRNA (125 ng plazmidu kodującego gRNA na probówkę). Uwzględnij warunek nukleofekcji wolny od gRNA i ETR jako próbkę poddaną próbie. Przeprowadzić badanie przesiewowe z co najmniej trzema kontrpróbami technicznymi na próbkę.
    2. Osad 5 × 105 komórekB2M TdTomato K-562 w probówce i nukleofekt ich mieszanką plazmidów (zgodnie z instrukcjami producenta).
    3. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl wcześniej podgrzanej pożywki do hodowli komórek ssaków RPMI-1640 i umieścić je z powrotem w inkubatorze.

4. Analiza aktywności transkrypcyjnej docelowego genu w czasie

  1. Użyj cytometrii przepływowej, aby zmierzyć procent wyciszonych komórek w różnych punktach czasowych po dostarczeniu ETR (Rysunek 4). Użyj komórek typu dzikiego (WT) - niezawierających sekwencji kodującej fluorofor - aby ustawić próg komórek reporterowo-ujemnych. Użyj próbnej próbki, aby ustawić bramkę dla komórek reporterowo-dodatnich.
    UWAGA: Jak zasugerowano w kroku 1.3, uwzględnij w eksperymencie kontrolę zakłóceń genetycznych. Może to być przydatne zarówno do monitorowania wydajności dostarczania CRISPR, jak i kondycji komórek pozbawionych genu docelowego; Utrata zarówno wyciszenia transkrypcji, jak i zakłócenia genetycznego w czasie może być przypisana istotności genu docelowego w wybranym typie komórki. Uwzględnij zarówno krótko- (dzień 3, dzień 7, dzień 10), jak i długoterminowe (dzień 21, dzień 35) punkty czasowe, aby uzyskać wskazanie zarówno ostrej, jak i długoterminowej skuteczności wyciszania.
  2. Zidentyfikuj trzy najważniejsze gRNA pod względem długoterminowej skuteczności wyciszania. Użyj FACS, aby wybrać subpopulację reportero-ujemną, stabilnie utrzymywaną w tych próbkach. Należy również wykonać FACS dla próbek poddanych próbie masowej, aby utrzymać je pod taką samą obróbką jak próbki testowe, aby umożliwić właściwe porównanie w kolejnych analizach.

5. Ocena swoistości leczenia ETR za pomocą sekwencji RNA i immunoprecypitacji metylowanego DNA (MeDIP)-seq

  1. Użyj sekwencji RNA, aby ocenić ewentualną deregulację transkrypcji w całym genomie po dostarczeniu ETR.
    1. Zarówno w przypadku wyciszonej reporterowo subpopulacji próbek potraktowanych trzema wysokowydajnymi gRNA, jak i komórek pozorowanych, należy wyekstrahować RNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów. Oceń jakość i stężenie RNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów.
    2. Wykonaj fragmentację RNA, retrotranskrypcję i przygotowanie biblioteki przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do przygotowania bibliotek sekwencyjnych RNA (zgodnie z instrukcjami producenta).
    3. Wykonuj kwantyfikację biblioteki i kontrolę jakości za pomocą przyrządów kontroli jakości kompatybilnych z sekwencjonowaniem nowej generacji i elektroforezą cyfrową.
    4. Biblioteki sekwencji na sekwenserze nowej generacji zgodnie z instrukcjami producenta, z protokołem sparowanym końcem 100 bp i dążące do średniej 45 mln odczytów na próbkę.
    5. Dopasuj odczytane znaczniki do odpowiedniego genomu referencyjnego i określ ilościowo ekspresję transkryptu. Wykonaj wyrównanie na sekwencji tdTomato i określ ją ilościowo oddzielnie.
      UWAGA: Tutaj używany jest STAR aligner (v 2.3.0)43, z domyślnymi parametrami, sprzężony z Rsubread package44.
    6. Przeprowadź analizę danych sekwencyjnych RNA zgodnie z opublikowanymi najlepszymi praktykami45.
      UWAGA: Pakiet R/Bioconductor edgeR46 jest tutaj używany, stosując filtr co najmniej jednego zliczenia na milion (cpm) w co najmniej trzech próbkach w celu odrzucenia genów o niskiej ekspresji. Alternatywnie można użyć funkcji filterByExpr w edgeR.
    7. Oceń różnicową ekspresję genów za pomocą ujemnego dwumianowego uogólnionego modelu logarytmiczno-liniowego zaimplementowanego edgeR (funkcja glmFit)47. Ustaw próg 0,01 dla skorygowanych wartości p (poprawka Benjaminiego-Hochberga [BH]), aby zachować geny regulowane różnicowo.
  2. Oceń ewentualną aktywność metylacji CpG poza celem ETR za pomocą MeDIP-seq.
    1. Zarówno w przypadku subpopulacji próbek potraktowanych trzema górnymi gRNA, jak i komórek pozorowanych należy wyekstrahować genomowe DNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów (zgodnie z instrukcjami producentów).
    2. Sonikacja 500 ng genomowego DNA przy użyciu ultradźwięków i następujących parametrów: Cło: 20 %; : 175; Cykle na serię: 200; Czas trwania: 40 s.
    3. Przygotuj biblioteki sekwencjonowania z dostępnymi na rynku zestawami dla MeDIP-seq (zgodnie z instrukcjami producenta).
    4. Po etapie ligacji adaptora, należy określić ilościowo biblioteki za pomocą testu fluorometrycznego i sprawdzić skuteczność ligacji za pomocą qPCR, korzystając z dostępnych na rynku bibliotecznych zestawów do oznaczania ilościowego (zgodnie z instrukcjami producenta).
    5. Pule bibliotek można uzyskuć, mieszając losowo wybrane biblioteki w celu zmniejszenia błędów technicznych. Użyj równej ilości biblioteki (ng) dla każdej biblioteki, aby zrównoważyć pule. Do każdej puli dodaj metylowane i niemetylowane DNA kontrolne z kolcami dostarczone w zestawie. Do celów kontrolnych zachowaj 10% objętości biblioteki, oznaczoną jako "wejściowa" i nie poddana immunoprecypitacji. Przeprowadzić immunoprecypitację na pozostałych 90% biblioteki przy użyciu przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko 5-metylocytozynie dostarczonej w zestawie MeDIP-seq.
    6. Oczyść wzbogacone i wejściowe biblioteki za pomocą zestawów do oczyszczania produktu immunoprecypitacji 5-metylocytozyny, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Oceń skuteczność wzbogacania, wykonując ilościowy PCR w czasie rzeczywistym na wewnętrznym skoku w kontrolach przy użyciu starterów dostarczonych z zestawem. Dla każdej immunoprecypitacji (IP) należy obliczyć swoistość wzbogacania na podstawie odzysku metylowanego i niemetylowanego DNA, wykorzystując wartości progu cyklu (Ct) MeDIP i frakcji wejściowych uzyskanych z reakcji qPCR (patrz równania 1 i 2):
      figure-protocol-1 (1)
      figure-protocol-2 (2)
      UWAGA: Biblioteki IP należy uznać za pomyślne, jeśli wartości specyficzności wynoszą ≥0,95.
    8. Wzmocnij biblioteki za pomocą zestawów do przygotowania biblioteki MeDIP-seq, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przeprowadź analizę ilościową i dystrybucję rozmiaru biblioteki produktu.
    9. Wykonuj sekwencjonowanie biblioteki na sekwencerach nowej generacji. Stosować sekwencjonowanie sparowanych końców o długości odczytu 100 pz, dążąc do uzyskania średnio 30 mln odczytów na próbkę.
    10. Dopasuj znaczniki odczytu sekwencjonowania do odpowiedniego genomu referencyjnego (np. hg38) za pomocą bwa (v 0.7.5 lub wyższego)48, a następnie zidentyfikuj piki za pomocą MACS (v 2.0.10 lub wyższy)49, co pozwoli na identyfikację szerokich pików (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Utwórz wspólny zestaw regionów z różnych próbek za pomocą narzędzia do wielu przecięć BEDTools50, włączając opcję grupowania.
    12. Oblicz pokrycie na próbkę na końcowej liście regionów za pomocą multicov BEDTools, odrzucając zduplikowane odczyty.
    13. Wykonaj analizę liczby macierzy za pomocą edgeR. Zastosuj filtr o wartości co najmniej jednej liczby na milion (cpm) w co najmniej trzech próbkach, aby odrzucić regiony o niskim wzbogaceniu.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć funkcji filterByExpr w edgeR.
    14. Zidentyfikuj metylację różnicową, przyjmując uogólniony model logarytmiczno-liniowy zaimplementowany w edgeR (funkcja glmFit) i normalizując za pomocą normalizacji warunkowego kwantylu51 w celu skorygowania zawartości GC w regionie. Wybierz regiony zróżnicowanie metylowane, stosując próg 0,01 dla wartości p skorygowanych o BH. Wykonaj analizę powtarzających się sekwencji w następujący sposób.
      UWAGA: Zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika edgeR, aby uzyskać pełną listę opcji i parametrów (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).
      1. Przefiltruj wyniki MeDIP-seq dla nominalnej wartości p <0,01 i utwórz dwa zestawy regionów: wybierz regiony o logFC >1 w pierwszym zestawie i regiony o logFC <-1 w drugim zestawie.
      2. Pobierz adnotację RepeatMasker dla wybranego genomu jako plik podstawowy i policz liczbę elementów w każdym zestawie. Przekonwertuj liczbę jako stosunek liczby regionów dla każdego zestawu danych.
      3. Wyekstrahuj stosunek metylomu, który nakłada się na każdą klasę powtórzeń i wykonaj test chi-kwadrat, aby wykryć wszelkie znaczące wzbogacenia.
  3. Oceń, czy różnie transkrybowane lub różnie metylowane regiony między próbkami potraktowanymi ETR i próbami mapują się na przewidywane przez krzem wiązanie gRNA poza celem.
    1. Użyj pakietu projektowego CRISPR52 jako narzędzia do przewidywania wiązań gRNA poza celem.
    2. Dla każdego przypuszczalnego regionu poza celem spójrz na najbliższe miejsce rozpoczęcia transkrypcji (TSS) i najbliższy region metylowany. Rozważmy jako prawdziwy efekt off-target region związany albo z genem regulowanym przez FDR <0,01 i odległość do TSS mniejszą niż 10 Kb, albo region metylowany regulowany przez FDR <0,01 i odległość mniejszą niż 1 Kb.
    3. Zidentyfikuj liczbę i cechy regionów zmienionych transkrypcyjnie lub nadmiernie metylowanych w próbkach traktowanych każdym z trzech najbardziej wydajnych gRNA w porównaniu z próbkami potraktowanymi próbnie (Rysunek 5), aby zidentyfikować najbardziej specyficzne spośród gRNA. Uszereguj potencjalny wpływ miejsca poza celem na fizjologię komórek docelowych w następującej kolejności (od najbardziej wpływającego do mniej wpływowego):
      i) Wewnątrzgenowy gen o ekspresji fizjologicznej w regionie regulatorowym
      ii) Wewnątrzgenowy, egzotyczny region o ekspresji fizjologicznej
      iii) Intrageniczny gen o ekspresji fizjologicznej w regionie intronicznym
      iv) Gen wewnątrzgenowy, bez ekspresji w regionie regulatorowym
      v) Wewnątrzgenowy, region egzoniczny bez ekspresji genu
      vi) Gen intrageniczny, nieulegający ekspresji w regionie intronicznym
      vii) Region międzygenowy

Wyniki

Po dostarczeniu szablonu dawcy do integracji fluorescencyjnego reportera w docelowym locus za pośrednictwem rekombinacji homologicznej sprzężonej z systemem CRISPR/Cas9 (np. przez nukleofekcję plazmidu w przypadku komórek K-562), w badanej próbce pojawiają się komórki reporterowo-dodatnie (Rysunek 1, na dole). Jeśli tak się nie stanie, należy ponownie sprawdzić dokładność projektu i klonowania zarówno matrycy dawcy, jak i odczynników CRISPR/Cas9. Jeśli to się potwierdzi, spróbuj zoptymalizować dawki odczynników i sam protokół podawania.

Po uzyskaniu linii komórek reporterowych, wybierz sekwencje promotora/wzmacniacza docelowego genu i zaprojektuj panel pasujących gRNA. Użyj narzędzi do przewidywania in silico, takich jak Chopchop, zarówno do identyfikacji sekwencji gRNA, jak i uszeregowania ich pod względem przewidywanej wydajności i swoistości (Rysunek 2). Jeśli nie zostaną pobrane żadne gRNA, należy kontrolować obecność kanonicznego motywu sąsiadującego z protospacerem Cas9 (PAM) (5'-NGG-3') w sekwencji docelowej. Jeśli nie ma żadnych sekwencji PAM, rozważ przejście na ETR oparte na alternatywnych, niezależnych od PAM wariantach Cas9 (nie opublikowano jeszcze ETR z tymi wariantami) lub przejście na alternatywne platformy domen wiążących DNA, takie jak ZFPs53 lub TALEs30. Jeśli jednak pobierane są tylko gRNA o niskiej przewidywanej skuteczności/swoistości, rozważ 1) przetestowanie tych gRNA niskiej jakości lub 2) rozszerzenie docelowej sekwencji DNA w poszukiwaniu lepszych gRNA. Po przejściowym dostarczeniu potrójnej kombinacji ETR (lub CRISPRoff; v2.1) wraz z gRNA, wykonaj analizy cytometrii przepływu podłużnego pod kątem ekspresji reportera fluorescencyjnego, często obserwując szczyt represji reporterowej podczas ostrych analiz, który jest następnie przynajmniej częściowo ponownie wchłaniany z powodu mitotycznego rozcieńczenia plazmidów kodujących ETR w czasie (Rysunek 4C). Jeśli kombinacja ETRs/gRNA skutecznie deponuje metylację CpG w locus docelowym, trwała represja reportera nastąpi w znacznej frakcji leczonych komórek (Figura 4C). Różne gRNA mogą wykazywać zmienną długoterminową skuteczność wyciszania (Rysunek 4B,C).

Do oceny specyficzności całego genomu, użyj MeDIP-seq do identyfikacji różnicowo metylowanych regionów między komórkami, w których cel był przez długi czas wyciszany i nieleczony. Idealnie, wysoce specyficzne gRNA indukuje pik metylacji de novo CpG tylko w miejscu docelowym (Rysunek 5). Jeśli nie, można rozważyć scharakteryzowanie aktywności poza celem gRNA znajdujących się na niższej pozycji na liście skuteczności on-target.

figure-results-1
Rysunek 1: Integracja reportera tdTomato z elementami regulacyjnymi ludzkiego genu B2M poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię. U góry: Schematy strategii integracji fluorescencyjnego reportera tdTomato w pierwszym intronie ludzkiego genu B2M poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię indukowaną przez CRISPR/Cas9. U dołu: reprezentatywne wykresy punktowe komórek K-562 przed i po integracji reportera tdTomato w pierwszym intronie genu B2M. Skróty: HA = ramię homologii; HDR = naprawa ukierunkowana na homologię; IRES = wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu; pa = BGH poli(A); SA = miejsce akceptora spawów; WT = typ dziki; 3XSTOP = trzy tandemowe kodony stop. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Identyfikacja in silico gRNA ukierunkowanych na wyspę CpG genu B2M, uszeregowana pod kątem przewidywanej skuteczności i specyficzności. Interfejs wyjściowy Chopchop pokazujący gRNA ukierunkowane na wyspę CpG osadzone w sekwencji promotorowej genu B2M, uszeregowane zarówno pod względem liczby sekwencji poza celem z 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2), lub 3 (MM3) niedopasowania i przewidywanej skuteczności realizacji celu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Klonowanie i ugrupowanie jądra gRNA dla epigenetycznego wyciszania za pośrednictwem dCas9 ETR. U góry: klonowanie protospaceru za pośrednictwem oligo-medialnego w ludzkim plazmidzie eksprymującym U6-gRNA. Na dole: ugrupowany ekran gRNA ukierunkowanych na B2M do epigenetycznego wyciszania opartego na CRISPR/dCas9 przez nukleofekcję plazmidu w K-562B2M / tdTomato. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ekran pod kątem gRNA skutecznie indukujących długotrwałe wyciszenie genu B2M. (A) U góry: schematy genuB2M tdTomato przedstawione na powiększonym obszarze, względna kolejność i orientacja wiązania ETR opartych na dCas9 skompleksowanych z gRNA. Na dole: reprezentatywne wykresy punktowe komórek B2MtdTomato K-562 przed (po lewej) lub po (prawej) wyciszeniu ETR. Analizy po 30 dniach od transfekcji z plazmidami kodującymi gRNA i potrójną kombinacją dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Aktywność wyciszająca wskazanych gRNA (zarówno w pulach, jak i jako pojedyncze gRNA) ukierunkowana na wyspę CpG B2M (czerwone strzałki na górnym schemacie wskazują orientację gRNA) w komórkachtdTomato K-562 B2M w 30 dniu po transfekcji. Dane pokazują odsetek komórek tdPomidorowo-ujemnych (średnia ± SEM; n = cztery niezależne transfekcje dla każdego warunku leczenia). (C) Analiza przebiegu w czasie komórek B2MtdTomato K-562 po transfekcji plazmidami wyrażającymi potrójną kombinację ETR i wskazane gRNA B2M CpG skierowane na wyspę lub pozorowane (transfekcja wolna od gRNA i ETR). Dane pokazują odsetek komórek tdPomidorowo-ujemnych (średnia ± SEM; n = trzy niezależne transfekcje dla każdego warunku leczenia). Dane niepublikowane. Panele A i B zaadaptowane z Amabile et al.30. Skróty: CGI = wyspa CpG; IRES = wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu; pa = BGH poli(A); SA = miejsce akceptora spawów; SD = miejsce dawcze splotu; TSS = miejsce rozpoczęcia transkrypcji; UT = nietransfekowany; 3XSTOP = 3 kodony stop w tandemie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza specyficzności ETR w całym genomie za pomocą RNA-seq i MeDIP-seq. Po lewej: porównanie poziomów ekspresji w próbowanych komórkachB2M tdTomato K-562 i komórkach traktowanych potrójną kombinacją ETR dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L i gRNA ukierunkowaną na wyspę CpG B2M gen. Wartości są wyrażone w log2 odczytów na kilobazę na milion (RPKM) zmapowanych odczytów. Czarne kropki reprezentują geny wyrażane na porównywalnych poziomach we wszystkich warunkach; żółte kółka reprezentują geny regulowane w różny sposób w ramach FDR <0,01; czerwone kółko reprezentuje transkrypt B2M-IRES-tdTomato. U góry po prawej: wykres circos przedstawiający całogenomowe profile MeDIP-seq pozorowanych komórekB2M tdTomato K-562 (niebieski) lub komórek traktowanych potrójną kombinacją dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR oraz gRNA ukierunkowanym na wyspę CpG (CGI) genu B2M (zielony). U dołu po prawej: pokazany jest status metylacji locusB2M tdTomato we wskazanych próbkach. W każdym pileupie reprezentowane są trzy powtórzenia; Stos wyrównanych odczytów został wygładzony za pomocą okna Gaussa. Ten rysunek został zaadaptowany z Amabile et al.30. Skrót: TSS = miejsce rozpoczęcia transkrypcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ukierunkowane wyciszanie epigenetyczne może stanowić obiecujące rozwiązanie w leczeniu zaburzeń, które mogą skorzystać z trwałej inaktywacji genów, w tym chorób spowodowanych mutacjami wynikającymi ze wzmocnieniafunkcji1, chorób zakaźnych2 oraz patologii, w których wyciszenie jednego genu może albo zrekompensować dziedziczną wadę winnym3, albo uwolnić pełny potencjał adoptywnych terapii komórkowych4. Rozdział 5. Działając na poziomie chromatyny i będąc automatycznie propagowanym przez komórkę 7,30,32, wyciszanie epigenetyczne może uniknąć toksycznych zmian (np. rearanżacji chromosomów) sekwencji DNA genu docelowego i częściowego, przejściowego wyciszenia celu, które są ograniczeniami odpowiednio rozerwania genu opartego na sztucznej nukleazie 8,34,35 i knockdownu opartego na RNAi33.

Jednym z kluczowych wstępnych kroków w każdym epigenetycznym protokole wyciszania jest zidentyfikowanie właściwej pozycji na genie docelowym, aby skierować ETR, które zdeponują represyjne znaki epigenetyczne niezbędne do wyłączenia aktywności transkrypcyjnej celu. Różne elementy regulatorowe miejsca rozpoczęcia transkrypcji - proksymalne i dystalne mogą się zgadzać, aby wspierać wyjście transkrypcyjne danego ludzkiego genu54. Co więcej, dzięki rosnącej liczbie programowalnych technologii wiązania DNA można obecnie zidentyfikować różne miejsca docelowe dla każdego określonego elementu regulacyjnego6. W związku z tym protokoły, takie jak ten opisany tutaj w zmodyfikowanych liniach komórkowych, mogą być wykorzystywane do wyznaczania poszczególnych miejsc docelowych i / lub regionów genomu podatnych na wyciszanie epigenetyczne za pośrednictwem ETR, przed rozpoczęciem uciążliwych i czasochłonnych wysiłków ewaluacyjnych najlepszych kandydatów w ostatecznym środowisku terapeutycznym. Niektóre krytyczne aspekty protokołu opisano bardziej szczegółowo poniżej.

Inżynieria reporterowej linii komórkowej predykcyjnej ostatecznego celu terapeutycznego
Pomimo ciągłej optymalizacji protokołów inżynierii komórkowej – wymaganych do wprowadzenia kodowania kasety dla reportera fluorescencyjnego do genu docelowego i dostarczenia ETR – nie można przyjąć za pewnik, że mogą one być już dostępne dla linii komórkowej, która najbardziej przypomina ostateczny cel terapeutyczny. W takim przypadku można zastosować różne strategie łagodzące: a) korzystając z zestawów optymalizacyjnych dostarczonych przez dostawców w celu optymalizacji protokołu transfekcji dla docelowej linii komórkowej; b) przejście na inne linie komórkowe nadal wykazujące ekspresję tego genu docelowego, ale należące do tkanek innych niż ostateczny cel terapeutyczny - dla których protokoły inżynieryjne zostały znacznie zoptymalizowane. W przypadku, gdy te opcje nie są dostępne, można rozważyć przejście na pierwotne typy komórek lub organoidy reprezentujące ostateczny cel. Jako ogólne rozważania zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i zastosowaniach terapeutycznych wyciszania epigenetycznego opartego na ETR, należy odrzucić scenariusze, w których gen docelowy jest niezbędny dla docelowego typu komórki. Pełne, długotrwałe wyciszenie niezbędnego genu narzucone przez ETR doprowadzi z czasem do kontrselekcji komórek docelowych (i potencjalnie do toksyczności leczenia). W takich przypadkach preferowane są alternatywne technologie zapewniające częściowe zniesienie celu, takie jak RNAi33.

Ocena celowej skuteczności wyciszania ETR
ETR oparte na kombinacji domen efektorowych KRAB, DNMT3A i DNMT3L okazały się skuteczne przeciwko zdecydowanej większości genów kodujących białka, z szerokim oknem docelowym o długości około 1 kilozasady, wyśrodkowanym w miejscu rozpoczęcia transkrypcji32. Aby zorientować się, jak wygląda dobrze przeprowadzony eksperyment wyciszania epigenetycznego, poniżej przedstawiono szczegóły techniczne i wyniki wyciszania genu B2M w komórkach K-562. Można to uznać za ważną kontrolę pozytywną, która powinna zostać uwzględniona nie tylko przez badaczy pracujących z komórkami K-562, ale także przez tych, którzy po raz pierwszy zbliżają się do technologii opartej na ETR. Jak stwierdzono w protokole, przerwanie genu oparte na sztucznej nukleazie (np. CRISPR/Cas9) jest zalecane jako dodatkowa kontrola zarówno skuteczności dostarczania genów w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania, jak i fenotypu komórek pozbawionych genu docelowego. Po wstępnym badaniu przesiewowym gRNA, które mają być sprzężone z ETR opartymi na CRISPR/dCas9, jeśli żadne z badanych gRNA nie jest w stanie trwale wyciszyć docelowego genu, należy rozważyć, w następującej kolejności: 1) zwiększenie ilości dostarczanych gRNA i ETR; 2) testowanie pul najlepszych gRNA w poszukiwaniu efektów synergicznych między nimi. Jeśli nadal nie zostanie osiągnięte długoterminowe wyciszenie, należy rozważyć: 3) przetestowanie dodatkowych gRNA, które mogą być ukierunkowane na miejsca bardziej odpowiednie do instruowania wyciszania epigenetycznego; 4) przejście na platformy DBD oparte na ZFP8 lub TALE9, które mogą mieć lepszą zdolność wiązania z chromatyną docelową; 5) przejście z stanu przejściowego na stabilny - na przykład integracja ekspresji ETR opartej na wektorach wirusowych (konstrukty fuzyjne gRNA lub dCas9, lub oba te konstrukty przy zastosowaniu technologii CRISPR/dCas9). Ponieważ nasza grupa opracowała i ma solidne doświadczenie w tym zakresie we wspólnym dostarczaniu trzech oddzielnych ETR30, protokół i przedstawione tutaj wyniki opierają się na tym podejściu. Jednak podobny koncepcyjny przepływ pracy można prawdopodobnie zastosować do systemu opartego na CRISPR typu "wszystko w jednym"32.

Ocena niezgodnej z celem działalności ETR
Liczne badania wykazały wstępne wskazania in vitro dotyczące swoistości ETR w oparciu o kombinację domen efektorowych KRAB, DNMT3A i DNMT3L 30,31,32. Jeśli jednak spośród badanych gRNA żadne z nich nie wykazuje zadowalającego profilu swoistości w zakresie regulacji transkrypcji i/lub metylacji DNA de novo, można zastosować dwie niewykluczające się wzajemnie strategie: a) skrócenie czasu przebywania ETR wewnątrz komórki (a w konsekwencji ich potencjalnej aktywności poza celem) poprzez zmniejszenie dawek ETR lub przetestowanie alternatywnych systemów dostarczania. Na przykład, w porównaniu z plazmidami, oczekuje się, że zarówno dostarczanie mRNA, jak i białka skróci czas ekspozycji komórek na ETR, a co za tym idzie, prawdopodobieństwo aktywności poza celem55; b) przejście na nowsze warianty Cas9, zoptymalizowane w celu zmniejszenia wiązania platformy56 poza celem, lub na alternatywne technologie wiązania DNA oparte na ZFP8 lub TALE9. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że w porównaniu z próbkami poddanymi próbie, na aktywność wyciszania genów w miejscu docelowym i poza nim ma wpływ nie tylko wiązanie DBD z sekwencją docelową, ale także potencjalna zdolność epigenetycznych domen efektorowych do rekrutacji do innych loci przez ich naturalne, endogenne kofaktory. W związku z tym skrócenie czasu przebywania ETR w komórce docelowej może zmniejszyć nie tylko prawdopodobieństwo wiązania DBD z miejscami poza celem, ale także prawdopodobieństwo, że ETR będą wchodzić w interakcje z endogennymi kofaktorami, co może przynieść korzyści pod względem swoistości i wady pod względem aktywności docelowej. Wreszcie, w porównaniu z próbkami poddanymi próbie, niektóre z transkrypcyjnych i mniej prawdopodobnych zmian metylacji CpG mierzonych w wyciszonych komórkach można po prostu uzyskać przez pozbawienie docelowego genu. Nie są one uważane za niezgodne z technologią wyciszania. Aby je zidentyfikować, należy również uwzględnić w panelu eksperymentalnymzaburzenia genów przez sztuczną nukleazę 8,9,10. Zmiany biologiczne spowodowane funkcjonalną utratą genu docelowego będą wspólne dla wyciszania epigenetycznego i tej alternatywnej technologii.

Oświadczenia

AL jest współzałożycielem, posiadaczem limitu i konsultantem firmy Chroma Medicine, Inc.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica i Deborah Cipria za wspólny wysiłek nad rozwojem technologii wyciszania epigenetycznego przez te wszystkie lata; Dejan Lazarevic i Francesca Giannese za krytyczny przegląd analiz RNA-seq i MeDIP-seq opisanych w protokole. Prace te zostały wsparte grantami dla A.L. z Fundacji Telethon (grant TIGET nr F1) oraz unijnym programem Horyzont 2020 (UPGRADE). Ilustracje zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

AUTHORS CONTRIBUTION
A.M, M.A.C., F.G. i A.C. przyczynili się do zaprojektowania protokołu i napisania manuskryptu; S.V., I.M. i D.C. zaprojektowali sekcje bioinformatyczne protokołu i poprawili manuskrypt; A.M. i A.L. zaprojektowali protokół, opracowali i napisali rękopis przy udziale wszystkich autorów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4200 System TapeStationAgilentG2991BAkwantyfikacja DNA
4D-Nucleofector X UnitLonza Bioscience AAF-1003XNukleofekcja
B2M wyciszanie gRNA #1   Laboratorium Lombardo GCAATCAGGACAAGGCCCGCWyciszanie genów
B2M wyciszanie gRNA #2  Laboratorium Lombardo GGGGTAGGAGAGACTCACGCWyciszanie genów
B2M wyciszanie gRNA #3  Laboratorium Lombardo GAGTCCAGGGCTGGATCTCGWyciszanie genów
BD FACSAria Cytometr przepływowy fuzyjnyBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusionNarzędzia do sortowania komórek aktywowane fluorescencją
Narzędzia do spaniahttp://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Przetwarzanie interwałów genomowych
bwaIh3https://github.com/lh3/bwaWyrównanie MeDIP-seq brzmi
Chopchop Laboratorium Valenahttp://chopchop.cbu.uib.no/oprogramowanie do selekcji gRNA
Corning  RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x z L-glutaminąCorning10-040-CVHodowla komórkowa
cqnBioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.htmlNormalizacja regionalna za pomocą
pakietu projektowego CRISPRzawartością GC Laboratorium Zhangahttps://zlab.bio/resources-2przewidywanie wiązania gRNA poza celem 
Addgene plazmidu CRISPRoff-v2.1 167981wyciszający geny
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Beckman CoulterC01161Cytometria przepływowa
Sekwencja matrycy dawcy do integracji tdTomato w pierwszym intronie genu B2M  Laboratorium Lombardo 

ctcctcctgacctgtttttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcaaattcaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctctc ttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatattttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagctctct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttctct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggccccgacgagggc
cggcgccgggcgggctacgtattccgc
cccccccccccccctctcctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaaggccg
gtgtgcttttgtctattattattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggggaaacct
ggcccttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggaagccacacg
gcgacaggtgcctctgccaagccacgbr/
cccagtgccacgttgttgtggagatagttgggga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatgatgcccagaaggtaccccbr/ attgtatgggatctggggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggacggtttt
cctttgaaaaacgatgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggagcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtggcatggaggg
< ctccatgaacggggccacgagttcgagatcgagggbr/> cgagggcgaggggcctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaagggtgaccaaggg
cggcccccttctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagcttcaagtgggg
cgcgtgatgaacttcgaggacggggtgtggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtaccacccccgccgcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggctgaagctgaa
ggacggcggactacctggtggagttcaag
Accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactacgtggacacaagctg
gacatcacctcccacacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggggg
ccaccaccttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcaggg ctccggcaccgcctc
ctccgaggacacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgccatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgaggggcccccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaagggac
caagggcggccccctgcccttcgcctggg
atcctgtccccccagcatgtacggctccaaa
ggcgtacgtgaagcaccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggagac
ggcggtctggtgaccgaccgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaagaccatggg
ctgggaggtcctccaccgagcgcctgtaccacc
cgcgacgtgctgaagggatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggc
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgagaggaaccaagctggcaccccabr/ caacgaga" ggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccccccaccttcctct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgccttgccccatc
tgttgtttgcccctcccctc
ggaaggtgccactccccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctgggggg
gacagcaagggattgggaagacaat
agcaggcatgctggatggggctctat
ggcttaagtgatggggctagcctttccttaa
tgatagggtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtcccccacagc
ctcccagagaaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaatttaa> ttagtagcactaacacttctctccattttcaatga
aaaatatagagtttataatttcttcccacttc
cccatggatggttctcattttgg
aaagtactttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

Inżynieria genetyczna
E220 UltradźwiękowyCovaris500239Sonikacja DNA
edgeRBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.htmlRóżnicowe badanie liczebności
Zestaw do wykrywania mutacji EnGenNEBE3321Kwantyfikacja zaburzeń genów
Surowica bydlęcapłodu Sigma-AldrichF2442Hodowla komórkowa
FlowjoBD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjoOprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej
Gel Loading Dye, fioletowy (6x)NEBB7024SŁadowanie żelu DNA
Go Taq G2 Hot Start DNA PolymerasePromegaM7401Amplifikacja
PCR Sekwencja gRNA do integracji dTomato w pierwszym intronie genu B2M  Laboratorium Lombardo AGGCTACTAGCCCCATCAAGInżynieria genetyczna
plazmid hCas9Addgene 41815Inżynieria genetyczna
Odczynniki D1000 o wysokiej czułościAgilent5067-5585Kwantyfikacja DNA
Taśma ekranowa o wysokiej czułości D1000Agilent5067-5584Kwantyfikacja DNA
Taśma ekranowa RNA o wysokiej czułościAgilent5067-5579Kwantyfikacja RNA
wysokiej czułościAgilent5067-5581Kwantyfikacja RNA
Bufor do próbek RNA ScreenTape o wysokiej czułościAgilent5067-5580Kwantyfikacja RNA
Zestaw IPureDiagenodeC03010011 Oczyszczanie produktu immunoprecypitacji 5-metylocytozyny
Ogniwa K-562ATCCCCL-243Inżynieria komórkowa
Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki KAPARocheKK4824Przygotowanie bibliotek MeDIP-Seq
MACS2Taoliuhttps://github.com/macs3-project/MACSIdentyfikacja regionów wzbogaconych metylem
Zestaw MagMeDIPDiagenodeC02010020 Immunoprecypitacja 5-metylocytozyny
NastępnyZestaw Methylseq 1 Bioo Scientific5118-01Przygotowanie bibliotek MeDIP-Seq
NextSeq 500 / NovaSeq 6000IlluminaSY-415-1002 / 20012850sekwencjonowania nowej generacji
NucleoBond Xtra Midi do transfekcji plazmidu DNAMacherey-nagel740410.50Preparat plazmidu Midiprep
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny  komórki ThermoFisherC404010Transformacja plazmidu
pAC154-dual-dCas9VP160-sgAddgen plazmidu ekspresji 48240Aktywacja genu
pcDNA.CMV.dCas9:plazmid KRAB  Laboratorium Lombardo dostępne na zamówienie (lombardo.angelo@hsr.it)Wyciszanie genów
pcDNA.CMV.dCas9:Plazmid KRABLaboratorium Lombardo dostępne na zamówienie (lombardo.angelo@hsr.it)Wyciszanie genów
pcDNA.CMV.dCas9:plazmid KRAB  Laboratorium Lombardo dostępne na zamówienie (lombardo.angelo@hsr.it)Wyciszanie genów
Penicylina/StreptomycynaSigma-AldrichP0781Hodowla komórkowa
plazmid phU6.sgRNAAddgene 53188Inżynieria genetyczna
PowerPac Basic Power SupplyBiorad1645050Elektroforeza w żelu agarozowym
Sekwencja przednia startera w celu sprawdzenia integracji tdTomato w pierwszym intronie genu B2M  Laboratorium Lombardo GTATTTGCTGGTTATGTTAGOdwrotna
sekwencja elementarza inżynierii genetycznej w celu sprawdzenia integracji tdTomato w pierwszym intronie genu B2M  Laboratorium Lombardo AATGGTTGAGTTGGACInżynieria genetyczna
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen51304Ekstrakcja DNA
QubitThermo FisherQ33238Kwantyfikacja DNA
Qubit dsDNA HS (wysoka czułość) Zestaw testowyThermo FisherQ32851Kwantyfikacja DNA
Qubit RNA HS (wysoka czułość) Zestaw testowyThermo FisherQ32852Kwantyfikacja RNA
Enzymy restrykcyjneTrawienie DNANEB
Zestaw RNeasy Mini Qiagen74106Ekstrakcja RNA
RsubreadBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.htmlKwantyfikacja ekspresji genów
Linia komórkowa SF 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT)Lonza Bioscience V4XC-2032Nucleofection
SnapGeneDotmaticshttps://www.snapgene.com/Oprogramowanie do projektowania biologii molekularnej
STARAlexander Dobinhttps://github.com/alexdobin/STARWyrównanie sekwencji RNA odczytuje
T100 Thermal CyclerBiorad1861096amplifikację PCR
Ligaza DNA T4PromegaM1801Ligacja DNA
TAE BufferFisher BP1332500 naukowyElektroforeza w żelu agarozowym
TruSeq Stranded Total RNA kit Przygotowanie biblioteki Illumina 20020597 RNA-Seq
UltraPureAgaroza ThermoFisher16500500Żel agarozowy 
z Cytometr przepływowy Drabinka taśmowa o Zestaw do

Bibliografia

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911(2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442(2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215(2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O'leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147(2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13(2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137(2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR dCas9skrining gRNAinaktywacja gen wkondensacja chromatynycytometria przep ywowanaprawa kierowana homologimetylacja CpGrepresja transkrypcyjna

Powiązane artykuły