Artykuł metodologiczny

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

DOI:

10.3791/64404

⸱

23 grudnia 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akwakultura jest jednym z najszybciej rozwijających się sektorów produkcji żywności na świecie, a hodowla tilapii (Oreochromis spp.) stanowi główną odmianę ryb słodkowodnych w hodowli. Ponieważ praktyki akwakultury są podatne na zanieczyszczenie mikrobiologiczne pochodzące ze źródeł antropogenicznych, konieczne jest szerokie stosowanie antybiotyków, co prowadzi do tego, że systemy akwakultury stają się ważnym źródłem opornych na antybiotyki i chorobotwórczych bakterii o znaczeniu klinicznym, takich jak Escherichia coli (E. coli). W tym przypadku oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, zjadliwość i cechy mobilomu patogennego szczepu E. coli, odzyskanego z hodowli śródlądowej Oreochromis spp., wyjaśniono za pomocą sekwencjonowania całego genomu (WGS) i analizy in silico. Przeprowadzono badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) i WGS. Ponadto za pomocą różnych dostępnych narzędzi internetowych określono grupę filogenetyczną, serotyp, typowanie sekwencji wielolocus (MLST), nabytą oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, zjadliwość, plazmid i zawartość profagów. Izolat E. coli wykazywał jedynie pośrednią wrażliwość na ampicylinę i został scharakteryzowany jako szczep ONT:H21-B1-ST40 za pomocą typowania opartego na WGS. Chociaż wykryto tylko jeden gen związany z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe [mdf(A)], zidentyfikowano kilka genów związanych ze zjadliwością (VAG) z atypowego enteropatogennego patotypu E. coli (aEPEC). Dodatkowo wykryto ładunek replikonów plazmidowych z dużych grup plazmidowych i 18 regionów związanych z profagami. Podsumowując, charakterystyka WGS izolatu aEPEC, odzyskanego z hodowli ryb w Sinaloa w Meksyku, pozwala na wgląd w jego potencjał chorobotwórczy i możliwe ryzyko dla zdrowia ludzkiego związane ze spożywaniem surowych produktów akwakultury. Konieczne jest wykorzystanie technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) do badania mikroorganizmów środowiskowych oraz przyjęcie ram dla jednego zdrowia, aby dowiedzieć się, skąd biorą się problemy zdrowotne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akwakultura jest jednym z najszybciej rozwijających się sektorów produkcji żywności na świecie, a jej praktyki produkcyjne mają na celu zaspokojenie rosnącego popytu na żywność do spożycia przez ludzi. Światowa produkcja akwakultury potroiła się z 34 mln ton w 1997 r. do 112 mln ton w 2017 r1. Głównymi grupami gatunkowymi, odpowiadającymi za blisko 75% produkcji, były wodorosty, karpie, małże, sumy i tilapia (Oreochromis spp.)1. Jednak pojawienie się chorób wywołanych przez jednostki mikrobiologiczne jest nieuniknione z powodu intensywnej hodowli ryb, co prowadzi do potencjalnych strat ekonomicznych2.

Stosowanie antybiotyków w hodowli ryb jest dobrze znane w zapobieganiu i leczeniu infekcji bakteryjnych, co jest głównym czynnikiem ograniczającym produktywność3,4. Niemniej jednak pozostałości antybiotyków gromadzą się w osadach akwakultury i wodzie, wywierając selektywne ciśnienie i modyfikując społeczności związane z rybami i rezydującymi w nich bakteriami5,6,7,8. W związku z tym środowisko akwakultury służy jako rezerwuar genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (ARG) oraz dalszego pojawiania się i rozprzestrzeniania bakterii opornych na antybiotyki (ARB) w otaczającym środowisku9. Oprócz patogenów bakteryjnych powszechnie obserwowanych wpływających na praktyki hodowli ryb, często spotyka się członków rodziny Enterobacteriaceae, w tym ludzkie szczepy patogenów Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. i Salmonella spp.10. E. coli jest najpowszechniejszym mikroorganizmem izolowanym z mączki rybnej i wody w hodowli ryb11,12,13,14,15.

E. coli to wszechstronna bakteria Gram-ujemna, która zamieszkuje przewód pokarmowy ssaków i ptaków jako komensalny element ich mikrobioty jelitowej. Jednak E. coli posiada wysoce adaptacyjną zdolność do kolonizacji i utrzymywania się w różnych niszach środowiskowych, w tym w glebie, osadach, żywności i wodzie16. Ze względu na przyrost i utratę genów w wyniku zjawiska horyzontalnego transferu genów (HGT), E. coli szybko przekształciła się w dobrze przystosowany patogen oporny na antybiotyki, zdolny do wywoływania szerokiego spektrum chorób u ludzi i zwierząt17, 18. Ze względu na pochodzenie izolacji, warianty chorobotwórcze definiuje się jako patogenne jelitowe E. coli (InPEC) lub patogenne pozajelitowe E. coli (ExPEC). Ponadto InPEC i ExPEC są podzielone na dobrze zdefiniowane patotypy w zależności od objawów choroby, tła genetycznego, cech fenotypowych i czynników wirulencji (VF)16,17,19.

Tradycyjne techniki hodowli i molekularne dla patogennych szczepów E. coli pozwoliły na szybkie wykrycie i identyfikację różnych patotypów. Mogą one być jednak czasochłonne, pracochłonne i często wymagać wysokiego poziomu szkolenia technicznego19. Co więcej, żadna pojedyncza metoda nie może być wykorzystana do wiarygodnego zbadania wszystkich patogennych wariantów E. coli ze względu na złożoność ich tła genetycznego. Obecnie te wady zostały przezwyciężone wraz z pojawieniem się technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (HTS). Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) i narzędzia bioinformatyczne usprawniły eksplorację DNA drobnoustrojów w przystępnej cenie i na dużą skalę, ułatwiając dogłębną charakterystykę drobnoustrojów w jednym przebiegu, w tym blisko spokrewnionych wariantów patogennych20,21,22. W zależności od pytań biologicznych, do analizy danych można wykorzystać kilka narzędzi bioinformatycznych, algorytmów i baz danych. Na przykład, jeśli głównym celem jest ocena obecności ARG, VF i plazmidów, narzędzia takie jak ResFinder, VirulenceFinder i PlasmidFinder, wraz z powiązanymi z nimi bazami danych, mogą być dobrym punktem wyjścia. Carriço et al.22 przedstawili szczegółowy przegląd różnych programów bioinformatycznych i powiązanych baz danych stosowanych do analizy mikrobiologicznej WGS, od wstępnego przetwarzania surowych danych po wnioskowanie filogenetyczne.

Kilka badań wykazało szeroką użyteczność WGS do badania genomu pod kątem cech oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, potencjału patogennego oraz śledzenia powstawania i ewolucyjnych powiązań klinicznie istotnych wariantów E. coli pochodzących z różnych źródeł23,24,25,26. Projekt WGS umożliwił identyfikację mechanizmów molekularnych leżących u podstaw fenotypowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, w tym rzadkich lub złożonych mechanizmów oporności. Odbywa się to poprzez wykrywanie nabytych wariantów ARG, nowych mutacji w genach docelowych dla leków lub regionach promotorowych27,28. Co więcej, WGS oferuje możliwość wnioskowania o profilach oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe bez konieczności posiadania wcześniejszej wiedzy na temat fenotypu oporności szczepu bakteryjnego29. Alternatywnie, projekt WGS umożliwił scharakteryzowanie ruchomych elementów genetycznych (MGE) niosących zarówno oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, jak i cechy wirulencji, co przyczyniło się do ewolucji genomu bakteryjnego istniejących patogenów. Na przykład zastosowanie WGS podczas dochodzenia w sprawie wybuchu epidemii E. coli w Niemczech w 2011 r. doprowadziło do odkrycia unikalnych cech genomowych pozornie nowego patotypu E. coli; Co ciekawe, te szczepy epidemiczne pochodziły z grupy enteroagregacyjnej E. coli (EAEC), która nabyła profag kodujący toksynę Shiga z patotypu enterokwotocznego E. coli (EHEC)30.

Ta praca przedstawia metodologiczną adaptację przepływu pracy dla bakteryjnych WGS przy użyciu sekwencera laboratoryjnego. Co więcej, za pomocą narzędzi internetowych zapewniony jest potok bioinformatyczny do analizy powstałych sekwencji i dalszego wspierania badaczy z ograniczoną wiedzą bioinformatyczną lub bez niej. Opisane metody pozwoliły na wyjaśnienie cech oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, zjadliwości i mobilomu patogennego szczepu E. coli ACM5, wyizolowanego w 2011 r. z hodowli śródlądowej Oreochromis spp. w Sinaloa, Meksyk12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Szczep E. coli ACM5 został odzyskany poprzez przetwarzanie i hodowlę próbki ryb do oznaczania bakterii z grupy coli (FC) w kale12. Podczas pobierania próbek ryb ryby nie wykazywały klinicznych objawów choroby, infekcji bakteryjnej lub grzybiczej, a średnia temperatura wynosiła 22,3 °C. Po izolacji izolat E. coli poddano testom biochemicznym i kriokonserwowano w bulionie z naparu do serca mózgu (BHI) z DMSO (8% v/v) jako środek krioprotekcyjny.

1. Reaktywacja zamrożonej kultury E. coli ACM5

  1. Z zamrożonego bulionu bakteryjnego otwórz probówkę i użyj sterylnej pętli, końcówki pipety lub wykałaczki, aby zeskrobać powierzchnię zamrożonej kultury bakteryjnej.
  2. Umieścić bakterie na płytce agarowej Luria-Bertani (LB) i inkubować w temperaturze 37 ± 2 °C przez 24 godziny.

2. Określenie wrażliwości na działanie przeciwbakteryjne

UWAGA: Opisane tutaj testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe odpowiadają metodzie dyfuzji krążków opartej na wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. Bakteria E. coli Szczep ATCC 25922 jest wymagany do celów kontroli jakości.

  1. Przygotowanie inokulum metodą zawiesiny kolonii
    1. Z płytki LB inkubowanej w kroku 1.2 rozprowadzić jedną lub dwie kolonie na płytce agarowej Muellera-Hintona (MH) i inkubować w temperaturze 37 ± 2 °C przez 18-24 godziny.
    2. Użyj sterylnej pętli, aby wybrać dwie lub trzy kolonie ze świeżo wyhodowanego izolatu E. coli na płytce agarowej MH i ponownie zawiesić je w 3 ml sterylnego bulionu MH lub 0,85% (w/v) roztworu soli fizjologicznej, dokładnie mieszając przez wirowanie w celu uzyskania jednolitej zawiesiny bakteryjnej.
    3. Za pomocą spektrofotometru UV-widzialnego (patrz tabela materiałów) dostosuj zawiesinę bakteryjną do zmętnienia porównywalnego z wzorcem 0,5 MacFarlanda (co odpowiada około 1-2 x 108 komórek/ml). Jeśli zawiesina bakteryjna jest zbyt lekka lub zbyt ciężka, dodaj odpowiednio więcej kolonii E. coli lub bulionu MH. Przygotowane inokulum należy zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania.
  2. Zaszczepianie badanych płytek agarowych
    1. Zanurz sterylny bawełniany wacik w dostosowanej zawiesinie bakteryjnej. Obróć wacik kilka razy i mocno dociśnij go do wewnętrznej ścianki probówki, aby usunąć nadmiar płynu z wacika.
    2. Zaszczepij płytkę agarową MH, przesuwając wacik 3x po całej powierzchni agaru, obracając płytkę o 60° za każdym razem. Przetrzyj również brzeg agaru, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum.
    3. Pozostaw uchyloną pokrywkę szalki Petriego na 3-5 minut, aby wilgoć odparowała.
  3. Nakładanie krążka przeciwbakteryjnego na zaszczepione płytki agarowe
    1. Rozprowadzić równomiernie i docisnąć każdy krążek przeciwdrobnoustrojowy (patrz Tabela Materiałów) do powierzchni zaszczepionych płytek agarowych, aby zapewnić pełny kontakt. Odwrócić płytki w ciągu 15 minut po nałożeniu krążka i inkubować w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16-18 h.
      UWAGA: Na płytkach Petriego o średnicy odpowiednio 150 mm i 100 mm należy użyć maksymalnie 12 i 6 krążków.
  4. Po inkubacji zmierz strefę rozmiarów inhibicji za pomocą suwmiarki z noniuszem i zinterpretuj wynikowe średnice zgodnie z kryteriami punktu granicznego CLSI (M100 - Tabela 2A)32.

3. Ekstrakcja i kwantyfikacja genomowego DNA (gDNA)

  1. Ekstrakcja genomowego DNA
    1. Zawiesić pętlę świeżo wyhodowanych kolonii E. coli w 5 ml bulionu LB i inkubować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem (180 obr./min) w temperaturze 37 ± 2 °C.
    2. Odwirować zawiesinę bakteryjną o sile 3 500 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant.
    3. Wyekstrahuj gDNA zgodnie z wytycznymi zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów).
    4. Sprawdź czystość gDNA, mierząc gęstość optyczną przy 260/280 nm (stosunek: >1,8) i 260/230 nm (stosunek: 2,0-2,2) za pomocą spektrofotometru UV-visible. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%, aby zweryfikować integralność gDNA.
  2. Kwantyfikacja genomowego DNA
    UWAGA: Używaj wyłącznie cienkościennych, przezroczystych probówek PCR o pojemności 0.5 ml zatwierdzonych przez producenta zestawu do oznaczania fluorescencji (patrz Tabela materiałów).
    1. Ustaw wymaganą liczbę probówek dla próbek i wzorców testów. Przygotować roboczy roztwór do oznaczania, mieszając składnik A i składnik B dostarczony w zestawie, postępując zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Przygotować wzorce testu, dodając 190 μl roztworu roboczego i 10 μl każdego wzorca do odpowiedniej probówki (wymagane są dwa wzorce).
    3. Dodać 198 μl roztworu roboczego i 2 μl próbki DNA do odpowiedniej probówki. Energicznie mieszaj, wirując wszystkie probówki przez 5 sekund. Uważaj, aby nie tworzyć bąbelków.
    4. Inkubować wszystkie probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zmierz fluorescencję wszystkich probówek w oparciu o wytyczne producenta za pomocą fluorometru (patrz Tabela materiałów).
    5. Prawidłowo dostosuj stężenie próbki gDNA do procesu sekwencjonowania.

4. Przygotowanie biblioteki DNA

UWAGA: Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki DNA zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami producenta (patrz Tabela Materiałów). Wyjściowe stężenie gDNA wynosi 4,0 ng.

  1. Tagowanie, amplifikacja PCR i indeksowanie
    1. Do probówki o pojemności 0,2 ml dodaj 2,5 μl buforu do znakowania i 2 μl wejściowego gDNA (2,0 ng/μl). Delikatnie wymieszać, pipetując.
    2. Dodać 1 μl buforu do amplifikacji i delikatnie wymieszać pipetując. Wirować w temperaturze 280 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    3. Umieścić próbki w termocyklerze (patrz tabela materiałów) i uruchomić następujący program PCR: 55 °C przez 5 minut, a następnie utrzymać w temperaturze 10 °C. Gdy próbki osiągną temperaturę 10 °C, należy natychmiast przystąpić do neutralizacji reakcji.
    4. Dodać 1 μl buforu neutralizującego do probówek z próbkami i delikatnie wymieszać pipetując. Wirować w temperaturze 280 x g przez 1 minutę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 1,7 μl każdego adaptera indeksującego (tj. indeksy i7 i i5) i 3 μl indeksującej mieszanki wzorcowej PCR. Delikatnie wymieszać, pipetując. Wirować w temperaturze 280 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    6. Umieścić próbki w termocyklerze i przeprowadzić drugą reakcję PCR w następujący sposób: 72 °C przez 3 minuty, 95 °C przez 30 s, 18 cykli po 95 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s, 72 °C przez 5 minut i utrzymywać w temperaturze 10 °C.
  2. Wzmocnione czyszczenie biblioteki
    1. Wymieszaj poprzez wirowanie komercyjnego roztworu kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) w oparciu o wytyczne producenta.
    2. Przenieś oznakowaną/zindeksowaną próbkę gDNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 0,6 μl kulek magnetycznych na każdy μl końcowej objętości próbki gDNA (≈13 μL). Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieścić probówki z próbkami na stojaku magnetycznym (patrz tabela materiałów) na 2 minuty, aż supernatant się oczyści. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, nie naruszając kulek.
    4. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu bez mieszania. Inkubować przez 30 s, aż eluat się oczyści, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
    5. Wykonaj drugi krok prania. Dodaj 200 μl 80% etanolu do kulek i inkubuj przez 30 s. Po oczyszczeniu eluatu, usunąć i wyrzucić supernatant i suszyć kulki na powietrzu przez 10 minut.
    6. Dodać 15 μl 10 mM buforu tris (pH 8) do kulek i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umieścić probówki z próbkami ponownie na stojaku magnetycznym na 2 minuty, pozwalając supernatantowi się oczyścić.
    7. Ostrożnie przenieść 14 μl supernatantu z probówki z próbką do nowej probówki o pojemności 0,2 ml. To jest oczyszczona biblioteka.
      UWAGA: W tym momencie oczyszczoną bibliotekę można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni.
  3. Normalizacja biblioteki
    1. Przystąpić do ilościowego oznaczania oczyszczonych bibliotek za pomocą testu fluorescencyjnego, jak opisano w kroku 3.2, z wyjątkiem kroku 3.2.5.
    2. Wizualizacja oczyszczonych bibliotek na elektroforezie z 1% żelu agarozowym, aby określić średnie rozmiary fragmentów.
    3. Oblicz wartość molarności biblioteki, korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-1
    4. Korzystając z wartości molowości, oblicz odpowiednie objętości buforu do respensji (RSB) i oczyszczonych bibliotek, aby rozcieńczyć pojedynczą bibliotekę przy początkowym stężeniu 10 nM.

5. Łączenie bibliotek, denaturalizacja i inicjowanie sekwencera

  1. Rozmrozić wkład z odczynnikiem zgodnie ze wskazówkami producenta. Wyciągnąć kuwetę przepływową z lodówki (4 °C) i doprowadzić ją do temperatury pokojowej przed sekwencjonowaniem.
  2. Zebrać 5 μl z każdej znormalizowanej biblioteki (10 nM) do probówki o niskim wiązaniu 1,5 ml. Rozcieńczyć bibliotekę w puli przy 4 nM odpowiednią objętością RSB.
  3. Dodać 5 μl połączonej biblioteki (4 nM) i 5 μl 0,2 N NaOH do nowej probówki o niskim wiązaniu 1,5 ml. Krótko wymieszać przez wirowanie, wirować przy 280 x g przez 1 minutę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zdenaturować połączoną bibliotekę na pojedyncze pasma.
  4. Delikatnie wymieszać 10 μl zdenaturowanej biblioteki zbiorczej i 990 μl wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego przez pipetowanie i umieścić na lodzie do momentu wykonania ostatecznego rozcieńczenia w celu załadowania sekwenatora. Stężenie zdenaturowanej biblioteki zbiorczej wynosi 20 pM.
  5. Rozmrozić i przygotować bibliotekę kontrolną (patrz tabela materiałów) w stężeniu 4 nM, mieszając 2 μl biblioteki kontrolnej (10 nM) i 3 μl wody wolnej od nukleaz.
  6. Zmieszać 5 μl z biblioteki kontrolnej (4 nM) i 5 μl świeżo przygotowanego 0,2 N NaOH. Krótko wymieszać przez wirowanie, odwirować przy 280 x g przez 1 minutę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zdenaturować bibliotekę kontrolną na pojedyncze nici.
  7. Delikatnie wymieszać 10 μl denaturowanej biblioteki kontrolnej i 990 μl wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego przez pipetowanie i umieścić na lodzie aż do zakończenia końcowego rozcieńczenia do ładowania sekwenatora. Stężenie zdenaturowanej biblioteki kontrolnej wynosi 20 pM.
  8. W nowej probówce o pojemności 1,5 ml o niskim poziomie wiązania połącz 594 μl zdenaturowanej biblioteki zbiorczej przy 20 pM i 6 μl zdenaturowanej biblioteki kontrolnej przy 20 pM. Dokładnie wymieszaj.
  9. Rozcieńczyć końcową mieszaninę biblioteczną (20 pM) do końcowego stężenia ładowania 1,2 pM w objętości 600 μL, używając wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego.
  10. Przed załadowaniem końcowej mieszanki bibliotecznej na wkład z odczynnikiem należy przeprowadzić dodatkową wstępną obróbkę termiczną, aby uzyskać efektywne ładowanie do komory przepływowej. Inkubować końcową mieszankę biblioteczną przez 2 minuty w temperaturze 96 °C. Odwrócić probówkę do wymieszania i umieścić probówkę na lodzie na 5 minut.
  11. Załaduj 500 μl końcowej mieszanki bibliotecznej do zaprojektowanego zbiornika na kartridżu z odczynnikiem. Rozpocznij sekwencjonowanie zgodnie z wytycznymi. Załaduj komórkę przepływową i wkład z odczynnikiem i skonfiguruj sekwencjonowanie.

6. Analiza danych sekwencyjnych

UWAGA: Sprawdź Plik Uzupełniający 1, aby uzyskać dalszy opis ogólnego wstępnego przetwarzania danych WGS, oprogramowania, ustawień parametrów i analizy sekwencji genomu E. coli.

  1. Połącz się z serwerem danych sekwencjonowania i pobierz pliki FASTQ.
  2. Oceń początkową jakość surowych danych sekwencji za pomocą oprogramowania innych firm. Usuń resztki sekwencji adapterów, bazy niskiej jakości (plik uzupełniający 1).
  3. Zbierz sprawdzone pod kątem jakości dane sekwencjonowania na poziomie kontigu lub rusztowania za pomocą oprogramowania innych firm (patrz plik uzupełniający 1).
  4. Wykonaj adnotację genomu, przesyłając plik FASTA zawierający złożony genom do serwera RAST (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Prześlij plik FASTA na platformy internetowe Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) i ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) w celu zidentyfikowania cech epidemiologicznych, ARG, VAG i plazmidów (patrz Plik uzupełniający 1).
  6. Prześlij plik FASTA na serwer PHASTER w celu zidentyfikowania sekwencji profagów (https://phaster.ca/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe została określona metodą dyfuzji krążkowej i zinterpretowana przez kryteria punktu granicznego CLSI dla 12 antybiotyków obejmujących sześć różnych klas przeciwdrobnoustrojowych, tj. aminoglikozydy, β-laktamy, fluorochinolony, nitrofurany, fenikole i antagoniści szlaku kwasu foliowego. Bakterie E. coli ACM5 wykazywały wrażliwość na wszystkie antybiotyki z wyjątkiem jednego leku β-laktamowego. Badano cztery leki β-laktamowe: ampicylinę, karbenicylinę, cefalotynę i cefotak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu przedstawiono adaptację przepływu pracy bakteryjnego WGS przy użyciu sekwenatora laboratoryjnego i procesu charakterystyki genomowej patogennego wariantu E. coli . W zależności od zastosowanej platformy sekwencjonowania, czasy realizacji (TAT) dla mokrych procedur laboratoryjnych (hodowla bakterii, ekstrakcja gDNA, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie) oraz analizy sekwencji mogą się różnić, szczególnie jeśli badane są wolno rosnące bakterie. Zgodnie z opisanym powyżej protokołem dla ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do Narodowej Rady Nauki i Technologii Meksyku (CONACyT według akronimu w języku hiszpańskim) za stypendium doktoranckie przyznane José Antonio Magaña-Lizárraga [nr 481143].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Accublock Mini cyfrowa sucha kąpielLabnetD0100Sucha kąpiel do inkubacji probówek
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Koraliki magnetyczne w roztworze do oczyszczania biblioteki DNA
DeNovix DS-11DeNovix Inc.Spektofotometr UV-Vis do sprawdzania jakości wyekstrahowanych
gDNA DNA LoBind ProbówkiEppendorf00301084181,5 ml do PCR do łączenia bibliotek DNA
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DMagnetyczny stojak na mikroprobówki używany podczas oczyszczania DNA na bazie kulek magnetycznych
Gram-ujemny identyfikator MultibacBadanie diagnostyczne (Meksyk)PT-35Komercyjne standardowe krążki antybiotykowe do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
MiniSeq Mid Output Kit (300 cykli)IlluminaFC-420-1004Kartridżka odczynników do sekwencjonowania sparowanych końców (2x150)
MiniSeq SystemInstrument IlluminaSY-420-1001Sekwencer stołowy używany do sekwencjonowania nowej generacji
WirówkaMiniSpinEppendorf5452000816Standardowa wirówka do probówek
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1024Odczynniki do wykonywania bibliotek DNA do sekwencjonowania. Zawiera odczynniki do 24 próbek
Zestaw indeksów Nextera XT v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Zestaw indeksów A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001Kontrola biblioteki DNA do sekwencjonowania
Precyzyjna kąpiel wodnaLabCare America51221081Wytrząsarka do kąpieli wodnej używana do hodowli bakterii
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Odczynniki do oznaczania ilościowego DNA na podstawie fluorescencji
Fluorometr Qubit 2.0Invitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometr używany do oznaczania fluorescencji 
Probówki do testów kubitowychInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ328560,5 ml probówki PCR do oznaczania ilościowego DNA na podstawie fluorescencji 
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Termocykler używany do amplifikacji biblioteki DNA
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spektrofotometr używany do zawiesiny bakteryjnej w testowaniu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA (50 przygotowań)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Tagi

Escherichia ColiWhole Genome SequencingAntimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Powiązane artykuły