Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Summary

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Abstract

Akwakultura jest jednym z najszybciej rozwijających się sektorów produkcji żywności na świecie, a hodowla tilapii (Oreochromis spp.) stanowi główną odmianę ryb słodkowodnych w hodowli. Ponieważ praktyki akwakultury są podatne na zanieczyszczenie mikrobiologiczne pochodzące ze źródeł antropogenicznych, konieczne jest szerokie stosowanie antybiotyków, co prowadzi do tego, że systemy akwakultury stają się ważnym źródłem opornych na antybiotyki i chorobotwórczych bakterii o znaczeniu klinicznym, takich jak Escherichia coli (E. coli). W tym przypadku oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, zjadliwość i cechy mobilomu patogennego szczepu E. coli, odzyskanego z hodowli śródlądowej Oreochromis spp., wyjaśniono za pomocą sekwencjonowania całego genomu (WGS) i analizy in silico. Przeprowadzono badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) i WGS. Ponadto za pomocą różnych dostępnych narzędzi internetowych określono grupę filogenetyczną, serotyp, typowanie sekwencji wielolocus (MLST), nabytą oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, zjadliwość, plazmid i zawartość profagów. Izolat E. coli wykazywał jedynie pośrednią wrażliwość na ampicylinę i został scharakteryzowany jako szczep ONT:H21-B1-ST40 za pomocą typowania opartego na WGS. Chociaż wykryto tylko jeden gen związany z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe [mdf(A)], zidentyfikowano kilka genów związanych ze zjadliwością (VAG) z atypowego enteropatogennego patotypu E. coli (aEPEC). Dodatkowo wykryto ładunek replikonów plazmidowych z dużych grup plazmidowych i 18 regionów związanych z profagami. Podsumowując, charakterystyka WGS izolatu aEPEC, odzyskanego z hodowli ryb w Sinaloa w Meksyku, pozwala na wgląd w jego potencjał chorobotwórczy i możliwe ryzyko dla zdrowia ludzkiego związane ze spożywaniem surowych produktów akwakultury. Konieczne jest wykorzystanie technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) do badania mikroorganizmów środowiskowych oraz przyjęcie ram dla jednego zdrowia, aby dowiedzieć się, skąd biorą się problemy zdrowotne.

Introduction

Akwakultura jest jednym z najszybciej rozwijających się sektorów produkcji żywności na świecie, a jej praktyki produkcyjne mają na celu zaspokojenie rosnącego popytu na żywność do spożycia przez ludzi. Światowa produkcja akwakultury potroiła się z 34 mln ton w 1997 r. do 112 mln ton w 2017 r¹. Głównymi grupami gatunkowymi, odpowiadającymi za blisko 75% produkcji, były wodorosty, karpie, małże, sumy i tilapia (Oreochromis spp.)¹. Jednak pojawienie się chorób wywołanych przez jednostki mikrobiologiczne jest nieuniknione z powodu intensywnej hodowli ryb, co prowadzi do potencjalnych strat ekonomicznych

Protocol

UWAGA: Szczep E. coli ACM5 został odzyskany poprzez przetwarzanie i hodowlę próbki ryb do oznaczania bakterii z grupy coli (FC) w kale¹². Podczas pobierania próbek ryb ryby nie wykazywały klinicznych objawów choroby, infekcji bakteryjnej lub grzybiczej, a średnia temperatura wynosiła 22,3 °C. Po izolacji izolat E. coli poddano testom biochemicznym i kriokonserwowano w bulionie z naparu do serca mózgu (BHI) z DMSO (8% v/v) jako środek krioprotekcyjny.

1. Reaktywacja zamrożonej kultury E. coli ACM5

1. Z zamrożonego bulionu bakteryjnego otwórz probówkę i użyj sterylne....

Results

Podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe została określona metodą dyfuzji krążkowej i zinterpretowana przez kryteria punktu granicznego CLSI dla 12 antybiotyków obejmujących sześć różnych klas przeciwdrobnoustrojowych, tj. aminoglikozydy, β-laktamy, fluorochinolony, nitrofurany, fenikole i antagoniści szlaku kwasu foliowego. Bakterie E. coli ACM5 wykazywały wrażliwość na wszystkie antybiotyki z wyjątkiem jednego leku β-laktamowego. Badano cztery leki β-laktamowe: ampicylinę, karbenicylinę, cefalotynę i cefotak.......

Discussion

W niniejszym badaniu przedstawiono adaptację przepływu pracy bakteryjnego WGS przy użyciu sekwenatora laboratoryjnego i procesu charakterystyki genomowej patogennego wariantu E. coli . W zależności od zastosowanej platformy sekwencjonowania, czasy realizacji (TAT) dla mokrych procedur laboratoryjnych (hodowla bakterii, ekstrakcja gDNA, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie) oraz analizy sekwencji mogą się różnić, szczególnie jeśli badane są wolno rosnące bakterie. Zgodnie z opisanym powyżej protokołem dla .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accublock Mini cyfrowa sucha kąpiel	Labnet	D0100	Sucha kąpiel do inkubacji probówek
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Koraliki magnetyczne w roztworze do oczyszczania biblioteki DNA
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		Spektofotometr UV-Vis do sprawdzania jakości wyekstrahowanych
gDNA DNA LoBind Probówki	Eppendorf	0030108418	1,5 ml do PCR do łączenia bibliotek DNA
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetyczny stojak na mikroprobówki używany podczas oczyszczania DNA na bazie kulek magnetycznych
Gram-ujemny identyfikator Multibac	Badanie diagnostyczne (Meksyk)	PT-35	Komercyjne standardowe krążki antybiotykowe do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
MiniSeq Mid Output Kit (300 cykli)	Illumina	FC-420-1004	Kartridżka odczynników do sekwencjonowania sparowanych końców (2x150)
MiniSeq System	Instrument Illumina	SY-420-1001	Sekwencer stołowy używany do sekwencjonowania nowej generacji
Wirówka	MiniSpinEppendorf	5452000816	Standardowa wirówka do probówek
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Odczynniki do wykonywania bibliotek DNA do sekwencjonowania. Zawiera odczynniki do 24 próbek
Zestaw indeksów Nextera XT v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Zestaw indeksów A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	Kontrola biblioteki DNA do sekwencjonowania
Precyzyjna kąpiel wodna	LabCare America	51221081	Wytrząsarka do kąpieli wodnej używana do hodowli bakterii
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Odczynniki do oznaczania ilościowego DNA na podstawie fluorescencji
Fluorometr Qubit 2.0	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometr używany do oznaczania fluorescencji
Probówki do testów kubitowych	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0,5 ml probówki PCR do oznaczania ilościowego DNA na podstawie fluorescencji
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Termocykler używany do amplifikacji biblioteki DNA
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spektrofotometr używany do zawiesiny bakteryjnej w testowaniu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA (50 przygotowań)