Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64423

⸱

27 września 2022

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of California Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Streszczenie

Zrozumienie pełnego procesu folikulogenezy u ssaków jest kluczowe dla poprawy technologii wspomaganego rozrodu u zwierząt gospodarskich, ludzi i zagrożonych gatunków. Badania ograniczały się głównie do pęcherzyków antralnych i dużych pęcherzyków przedantralnych ze względu na trudności w izolacji mniejszych pęcherzyków przedantralnych, zwłaszcza u dużych ssaków, takich jak bydło. W pracy przedstawiono skuteczne podejście do pobierania dużej liczby małych pęcherzyków przedantralnych z pojedynczego jajnika bydlęcego. Korę poszczególnych jajników bydlęcych pokrojono w kostkę o wielkości 500 μm za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizowano przez 6 minut przy 9 000-11 000 obr./min za pomocą sondy o średnicy 10 mm. Duże zanieczyszczenia oddzielono od homogenatu za pomocą gazy serowej, a następnie przeprowadzono seryjną filtrację przez sitka o wielkości komórek 300 μm i 40 μm. Zawartość zatrzymaną w sitku o wielkości 40 μm przepłukano do naczynia poszukiwawczego, w którym zidentyfikowano mieszki włosowe i zebrano je w kropli pożywki. Żywotność pobranych mieszków włosowych badano za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Metoda ta umożliwia wyizolowanie dużej liczby żywotnych małych pęcherzyków przedantralnych z pojedynczego jajnika bydlęcego w ciągu około 90 minut. Co ważne, metoda ta jest całkowicie mechaniczna i pozwala uniknąć użycia enzymów do dysocjacji tkanki, co może spowodować uszkodzenie mieszków włosowych. Pęcherzyki uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak izolacja RNA do RT-qPCR, immunolokalizacja określonych białek i hodowla in vitro.

Wprowadzenie

Pęcherzyki jajnikowe są jednostkami funkcjonalnymi jajnika, odpowiedzialnymi za produkcję gamet (oocytów), a także hormonów krytycznych dla funkcji rozrodczych i ogólnego stanu zdrowia. Pęcherzyki pierwotne tworzą się w jajniku podczas rozwoju płodu lub w okresie noworodkowym, w zależności od gatunku1, i stanowią rezerwę jajnikową samicy. Wzrost pęcherzyków rozpoczyna się od aktywacji pierwotnych pęcherzyków, które opuszczają basen spoczynkowy i wchodzą w fazę wzrostu. Folikulogeneza preantralna, obejmująca wszystkie etapy pęcherzyków przed rozwojem antrum, jest wysoce dynamicznym procesem, który wymaga synchronicznych zmian morfologicznych i metabolicznych w oocycie i otaczających komórkach ziarnistych, napędzanych ścisłą komunikacją między tymi dwoma typami komórek2,3. Pęcherzyki przedantralne stanowią większość jednostek pęcherzykowych znajdujących się w jajniku w danym momencie4. Szacuje się, że rozwój przez preantralne etapy folikulogenezy jest o kilka tygodni dłuższy niż rozwój antralny5,6, a czas ten jest niezbędny, aby oocyt i komórki somatyczne osiągnęły wystarczającą dojrzałość, aby wejść w końcowy etap rozwoju (tj. etap antralny) i przygotować się do owulacji, zapłodnienia i rozwoju embrionalnego7,8,9.

Znaczna część obecnej wiedzy na temat folikulogenezy przedantralnej jajników pochodzi z modeli mysich10,11,12,13, częściowo ze względu na łatwość odzyskania dużej liczby tych pęcherzyków z mniejszego i mniej włóknistego jajnika. Chociaż doniesienia o izolacji dużej liczby pęcherzyków przedantralnych z jajników bydlęcych pochodzą sprzed około 30 lat14, pełniejsze zrozumienie procesów regulujących rozwój tych pęcherzyków we wczesnym stadium pozostało niezrealizowane, głównie z powodu braku zoptymalizowanych, wydajnych i powtarzalnych metod pobierania wystarczającej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych, szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju. Wraz z rosnącym zainteresowaniem zachowaniem rezerwy jajnikowej do wykorzystania w przyszłości w wspomaganym rozrodzie u ludzi, krowy stają się atrakcyjnym modelem ze względu na ich bardziej podobną budowę jajników15. Jednak jajnik bydlęcy jest znacznie bogatszy w kolagen w porównaniu do jajnika myszy 16, co sprawia, że izolacja mechaniczna przy użyciu metod opisanych dla myszy jest bardzo nieefektywna. Wysiłki mające na celu rozszerzenie technik zachowania płodności obejmują całkowity wzrost pęcherzyków przedantralnych in vitro do stadium antralnego, a następnie dojrzewanie in vitro (IVM) zamkniętych oocytów, zapłodnienie in vitro (IVF) oraz produkcję i transfer zarodków17. Do tej pory cały ten proces został osiągnięty tylko w myszach18. U bydła postęp w kierunku wzrostu pęcherzyków in vitro jest ograniczony do kilku raportów ze zmiennymi stadiami pęcherzyków na początku hodowli, a także zmienną długością hodowli między protokołami17,19.

Metody opisane w literaturze dotyczące pobierania pęcherzyków preantralnych z jajnika bydlęcego głównie wykorzystywały techniki mechaniczne i enzymatyczne, izolowane lub w kombinacji2,14,17,20. W pierwszym raporcie na temat protokołu izolacji pęcherzyków przedantralnych bydła wykorzystano homogenizator tkankowy i filtrację seryjną do przetwarzania całych jajników20. Po tym badaniu pojawiły się doniesienia łączące procedury mechaniczne i enzymatyczne, które wykorzystywały kolagenazę14. Powtarzającym się tematem podczas stosowania kolagenazy do trawienia tkanki jajnika jest potencjalne ryzyko uszkodzenia błony podstawnej pęcherzyka, co może zagrozić żywotności pęcherzyków14,21,22,23. W związku z tym zastosowano różne kombinacje metod mechanicznych, takie jak użycie rozdrabniacza tkanek i wielokrotnego pipetowania lub rozdrabniacza tkanek w połączeniu z homogenizacją20,24,25,26. Inna opisana technika mechaniczna wykorzystuje igły do wycinania pęcherzyków przedantralnych bezpośrednio z tkanki jajnika, co jest szczególnie przydatne do izolowania większych (>200 μm) pęcherzyków wtórnych. Jednak proces ten jest czasochłonny, nieefektywny w izolowaniu mniejszych pęcherzyków przedantralnych i zależy od zestawu umiejętności, gdy próbuje się go przeprowadzić w jajnikach bydła19,27,28.

Korzystając z różnych technik opisanych w literaturze, protokół ten miał na celu optymalizację izolacji pęcherzyków preantralnych z pojedynczych jajników bydlęcych w prosty, spójny i efektywny sposób, który pozwala uniknąć inkubacji w roztworach enzymatycznych. Udoskonalenie metod izolacji pęcherzyków preantralnych będzie okazją do lepszego zrozumienia tego etapu folikulogenezy i umożliwi opracowanie skutecznych systemów hodowli w celu rozwoju pęcherzyków preantralnych do stadium antralnego. Opisane w niniejszym dokumencie szczegółowe procedury izolacji pęcherzyków przedantralnych od dużego ssaka, takiego jak bydło, będą miały kluczowe znaczenie dla naukowców dążących do zbadania wczesnej folikulogenezy u gatunku niemysiego, który można przetłumaczyć na ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Jajniki bydlęce (Bos taurus) pozyskano z lokalnej rzeźni i przetransportowano do laboratorium w ciągu 6 h od pobrania. Ze względu na dużą liczbę zwierząt przetwarzanych w zakładzie, wiek, rasa oraz stadium cyklu rujniczego zwierząt nie są znane. Ponieważ w eksperymentach nie wykorzystano żywych zwierząt, zatwierdzony protokół opieki i wykorzystania zwierząt nie był wymagany.

1. Przygotowanie sprzętu i odczynników

  1. Przykryj odcinek blatu laboratoryjnego o szerokości 2 ft papierem do blatów.
  2. Przygotuj uchwyt do skalpela, sterylne ostrze skalpela, kleszczyki hemostatyczne, pęsetę anatomiczną, strzykawkę Luer-Lock 20 mL, igłę 18 G, dwa zlewki 200 mL, kolbę Erlenmeyera 500 mL, plastikowy lejek o średnicy 104 mm, plastikową deskę do krojenia, jedną warstwę gazy o wymiarach 22 cm2 (gazę można wysterylizować w autoklawie przed użyciem) na każdy przetwarzany jajnik, sitko do komórek 300 µm oraz sitko do komórek 40 µm (patrz Tabela Materiałów).
  3. Przenieś cały sprzęt na papier do blatów.
  4. Za pomocą kleszczyków hemostatycznych zamocuj ostrze skalpela na uchwycie. Dopasuj skośną podstawę ostrza do skośnego wskaźnika na uchwycie, a następnie wsuń ostrze w rowek uchwytu.
  5. Umieść lejek w kolbie Erlenmeyera i przykryj otwór lejka gazą.
  6. Umieść jedną probówkę stożkową 50 mL na każdy przetwarzany jajnik w łaźni wodnej lub perłowej ustawionej na 38.5 °C.
  7. Umieść jedną kwadratową płytkę Petriego 100 mm x 15 mm na każdy przetwarzany jajnik na podgrzewaczu do szkiełek ustawionym na 38.5 °C.
  8. Dodaj 10 mL Penicyliny-Streptomycyny (PenStrep; 10 000 U/mL penicyliny i 10 000 µg/mL streptomycyny) do 1 L 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Podgrzej PBS + PenStrep w łaźni wodnej lub perłowej ustawionej na 38.5 °C co najmniej 2 h przed przetwarzaniem jajników.
    ​UWAGA: Roztwór PBS + PenStrep jest niezbędny do płukania jajników w przypadku, gdy izolowane pęcherzyki będą hodowane, a jego stosowanie jest zalecane również we wszystkich dalszych eksperymentach w celu ograniczenia kontaminacji mikrobiologicznej.
  9. Do zbierania przefiltrowanego materiału z przetworzonego jajnika należy użyć Medium do Płukania Pęcherzyków (FWM) składającego się z TCM199 z solami Hanksa (patrz Tabela Materiałów) zawierającego 3 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 25 mM buforu HEPES, 100 UI penicyliny/100 µg/mL streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu (NaPyr) oraz 100 nM nieistotnych aminokwasów (NEAA).
    1. Przenieś sterylny TCM199, butelkę 250 mL i menzurkę 100 mL do komory bezpiecznej (BSC). Przenieś 194 mL TCM199 do butelki.
    2. Wyjmij zlewkę z TCM199 z BSC i przenieś ją na mieszadło magnetyczne. Dodaj do butelki 600 mg BSA, 1,19 g buforu HEPES oraz autoklawowany magnes mieszający i mieszaj do czasu rozpuszczenia.
    3. Po całkowitym rozpuszczeniu BSA i buforu HEPES dodaj do medium 1 N wodorotlenek sodu (NaOH), aż osiągnie pH 7,6-7,8, mierzone pH-metrem.
    4. Przed przeniesieniem do BSC przetrzyj butelkę z medium, urządzenie do filtracji próżniowej, cztery probówki stożkowe 50 mL oraz butelki z PenStrep, NaPyr i NEAA 70% etanolem.
    5. Dodaj po 2 mL PenStrep (10 000 U/mL penicyliny i 10 000 µg/mL streptomycyny), 100 mM NaPyr oraz 100x NEAA do butelki z TCM199 + 3 mg/mL BSA + 25 mM HEPES. Przefiltruj końcowe medium przez filtr sterylizujący i rozdziel do probówek stożkowych 50 mL. Przechowuj medium w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 tygodnie.
    6. Podgrzej jedną probówkę stożkową 50 mL z medium na dwa jajniki w łaźni perłowej ustawionej na 38.5 °C co najmniej 1 h przed przetwarzaniem jajników.

2. Przygotowanie siekacza do tkanek

  1. Upewnij się, że siekacz do tkanek (patrz Tabela materiałów) jest podłączony do zasilania i włączony.
  2. Zgodnie ze specyfikacją producenta ustaw grubość plastra na 500 µm, pokrętło kontroli siły ostrza na 20° oraz pokrętło regulacji prędkości na 90°.
  3. Włóż plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm do uchwytu na płytkę, a następnie umieść uchwyt na stole urządzenia.
  4. Podnosząc ramię siekające, obracaj pokrętło ręczne zgodnie z ruchem wskazówek zegara aż do maksymalnego wysięgu.
  5. Za pomocą pęsety umieść dwustronną żyletkę (patrz Tabela materiałów) na śrubie wkręconej w ramię siekające. Nałóż zacisk na ostrze i zabezpiecz go podkładką oraz nakrętką. Pozostaw nakrętkę poluzowaną o ćwierć obrotu.
  6. Obracaj pokrętło ręczne, aż ramię siekające dociśnie ostrze płasko do szalki Petriego. Dokręć nakrętkę do końca za pomocą klucza do nakrętek.
  7. Za pomocą pokrętła ręcznego podnieś ramię siekające do maksymalnej wysokości. Przesuń pokrętło zwalniające stół całkowicie w lewo, aż wskoczy na miejsce.

3. Przygotowanie jajnika

  1. Przenieść jajniki w laboratorium do ciepłego (38.5 °C) sterylnego PBS + PenStrep.
    UWAGA: Zaleca się przetwarzanie jajników w celu izolacji pęcherzyków tak szybko, jak to możliwe po ich pobraniu od zwierzęcia. W niniejszym protokole jajniki przetwarzano w ciągu 6 h od pobrania. Jajniki transportowano z rzeźni do laboratorium w termosach zawierających sterylny 0.9% roztwór soli fizjologicznej o temperaturze około 38.5 °C.
  2. Jeśli to możliwe, wybrać małe (≤ 4 cm x 3 cm x 3 cm) jajniki zawierające małe (3-5 mm) pęcherzyki antralne, bez dużych (≥8 mm) pęcherzyków antralnych i bez wyraźnych ciał żółtych (Rycina 1). Kryteria te są zalecane, aby zapewnić, że w końcowym naczyniu z izolowanymi pęcherzykami znajdzie się minimalna ilość zanieczyszczeń niebędących pęcherzykami, takich jak komórki zrębu i macierz pozakomórkowa.
    UWAGA: Pęcherzyki antralne można zidentyfikować jako sferyczne, wypełnione płynem struktury pęcherzykowe na powierzchni jajnika. Ciała żółte można zidentyfikować jako czerwone, pomarańczowe lub żółte sztywne struktury wystające z powierzchni jajnika.
  3. Za pomocą nożyczek usunąć nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu z jajników.
  4. Myć jajniki przez 30 s w 70% etanolu w zlewce.
  5. Myć jajniki 3x po 2 min w zlewkach z ciepłym (38.5 °C) PBS + PenStrep, używając świeżego PBS + PenStrep do każdego płukania.
  6. Przechowywać jajniki w ciepłym (38.5 °C) PBS + PenStrep do momentu rozpoczęcia przetwarzania.
    UWAGA: Odległość między laboratorium a źródłem jajników może być różna. Dlatego ważne jest niezwłoczne przeprowadzenie protokołu, aby zapewnić utrzymanie żywotności pęcherzyków.

Schemat równowagi statycznej, siły, wektory; ilustracja koncepcji równowagi na wycinku żelu.
Rysunek 1: Anatomia jajnika bydlęcego. Jajnik bydlęcy składa się z dwóch głównych obszarów zamkniętych w warstwie nabłonkowej. Kora, obejmująca tkankę po lewej stronie linii przerywanej, zawiera pęcherzyki jajnikowe od stadium pierwotnego do stadium antralnego. Pęcherzyki przedantralne są zbyt małe, aby można je było dostrzec gołym okiem; pęcherzyki antralne zaznaczono gwiazdkami. Rdzeń, obejmujący tkankę po prawej stronie linii przerywanej, zawiera naczynia krwionośne, naczynia limfatyczne i nerwy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Procedura cięcia

UWAGA: Przetwarzać tylko jeden jajnik naraz. Przetwarzanie jajników należy przeprowadzić szybko, aby uniknąć spadku temperatury, co może wpłynąć na żywotność mieszków płucnych.

  1. Przenieś jeden jajnik na deskę do cięcia na papierze roboczym (Rysunek 2A) i przygotuj krojarkę do tkanek (Rysunek 2B).
  2. Za pomocą pęsety i skalpela przetnij jajnik na pół i usuń szpik z każdej połowy, pozostawiając jedynie korę o grubości około 1 mm, jak pokazano na Rysunku 2C.
    1. Przetnij jajnik wzdłużnie na pół, od jednego miejsca przyczepu więzadła do przeciwległego miejsca przyczepu.
    2. Jedną połowę jajnika pozostaw na desce do cięcia w celu obróbki, a drugą połowę jajnika umieść z powrotem w ciepłym (38.5 °C) PBS + PenStrep.
    3. Z odsłoniętym szpikiem skierowanym do góry, wykonaj nacięcie wzdłuż krzywizny jajnika w odległości około 2 mm od jego powierzchni, nie przecinając kory.
    4. Wykorzystaj nacięcie wzdłuż krzywizny jajnika jako prowadnicę do pogłębienia cięcia, nadal podążając za krzywizną jajnika, aby oddzielić korę od szpiku.
    5. Wypreparuj i usuń z jajnika wszystkie ciała żółte, tnąc wzdłuż krawędzi ciała żółtego.
    6. Obróć połowę jajnika tak, aby nabłonek był skierowany do góry, i za pomocą skalpela dokończ oddzielanie szpiku od kory. Odetnij pozostałą białą tkankę łączną wokół krawędzi fragmentu jajnika, który był połączony z więzadłami.
    7. Po usunięciu większości szpiku użyj skalpela, aby dociąć korę do grubości około 1 mm. Poruszaj skalpelem małymi ruchami w przód i w tył, aby zeskrobać pozostałości szpiku.
      UWAGA: Szpik jest wewnętrzną częścią jajnika zawierającą duże naczynia krwionośne. Kora jest zewnętrzną częścią jajnika, znajdującą się bezpośrednio pod zewnętrznym nabłonkiem powierzchniowym. W jajniku bydlęcym kora ma około 1 mm grubości, zatem docięcie jajnika do grubości 1 mm usunie szpik.
  3. Pokrój korę na kawałki nie większe niż 2.5 cm x 2.5 cm. Przechowuj fragmenty kory w ciepłym (38.5 °C) PBS + PenStrep do momentu krojenia.
  4. Napełnij zlewkę co najmniej 50 mL ciepłego (38.5 °C) PBS + PenStrep i przygotuj plastikową pipetę transferową.
  5. Przenieś pojedynczy fragment kory do szalki Petriego na krojarce do tkanek i zwilż tkankę trzema lub czterema kroplami ciepłego (38.5 °C) PBS + PenStrep.
  6. Unieruchom fragment tkanki pęsetą i naciśnij raz przycisk resetu, aby uruchomić krojarkę do tkanek. Stabilizuj szalkę Petriego jedną ręką, nadal unieruchamiając tkankę pęsetą. Przesuwaj pęsetę w lewo wzdłuż tkanki w razie potrzeby, aby ostrze nie uderzyło w pęsetę. Powstałe paski będą miały długość około 500 µm.
  7. Gdy cały fragment kory zostanie pocięty na paski, użyj pokrętła uchwytu ostrza, aby podnieść ostrze nad szalką Petriego, a następnie pęsetą usuń wszelką tkankę z ostrza.
  8. Obróć uchwyt płytki o 90°.
  9. Naciśnij raz przycisk resetu. Stabilizuj szalkę Petriego jedną ręką, jednocześnie przesuwając pęsetą paski tkanki na drogę ostrza.
  10. Przecnij paski tkanki całkowicie ostrzem. Użyj pokrętła uchwytu ostrza, aby podnieść ostrze nad szalką Petriego, a następnie pęsetą usuń wszelką tkankę z ostrza.
  11. Za pomocą pipety transferowej i ciepłego (38.5 °C) PBS + PenStrep wypłucz pokrojoną tkankę (docelowy rozmiar tkanki: kostki 500 µm x 500 µm x 1 mm) do uprzednio ogrzanej (38.5 °C) stożkowej probówki 50 mL. Umieść probkę stożkową z powrotem w łaźni wodnej lub koralikowej, aby utrzymać pokrojoną tkankę w cieple (38.5 °C).
  12. Użyj klucza nasadowego, aby odkręcić nakrętkę z ramienia krojarki, a następnie zdejmij podkładkę i zacisk ostrza. Za pomocą pęsety wyjmij ostrze z ramienia krojarki, obróć je tak, aby nieużywana krawędź była skierowana w stronę szalki Petriego i umieść je z powrotem na ramieniu krojarki. Zamontuj z powrotem zacisk ostrza, podkładkę i nakrętkę, a następnie zresetuj pokrętło zwalniania stołu zgodnie z opisem w krokach 2.5-2.7.
  13. Powtórz kroki 4.5-4.12 dla wszystkich pozostałych fragmentów kory z jajnika, wymieniając ostrza na nowe po wykorzystaniu każdej krawędzi tnącej.
  14. Wszystkie zużyte ostrza wyrzuć do plastikowego pojemnika na odpady ostre z twardymi ściankami.

5. Procedura homogenizacji

  1. Upewnij się, że homogenizator (patrz Tabela materiałów) jest podłączony do zasilania, a prędkość ustawiono na drugą kreskę (9,000-11,000 rpm). Włóż sondę generatora 10 mm do urządzenia zgodnie ze specyfikacją producenta.
  2. Ustaw czasomierz na 1 min i włóż sondę do stożkowej probówki 50 mL zawierającej posiekane tkanki kory jednego jajnika (krok 4.11) oraz wystarczającą ilość PBS + PenStrep, aby wypełnić probówkę do linii 25 mL. Głębokość wprowadzenia sondy musi wynosić 1/3 wysokości cieczy mierzonej od dna komory. Umieść sondę lekko poza centrum, aby zminimalizować powstawanie wiru.
  3. Uruchom czasomierz i włącz homogenizator. Upewnij się, że dno sondy nie dotyka ścianek probówki i trzymaj probówkę nieruchomo podczas pracy homogenizatora.
  4. Po 1 min homogenizacji wyjmij sondę z probówki. Za pomocą pęsety usuń wszelkie tkanki łączące blokujące otwory wentylacyjne oraz przestrzeń między nożem a rurką rotora. Jeśli w sondzie utknęły fragmenty kory, usuń je pęsetą i przełóż z powrotem do probówki.
  5. Powtórz kroki 5.2-5.4 dodatkowo 5 razy, aby uzyskać łącznie 6 min homogenizacji.
  6. Umieść probówkę z zhomogenizowaną tkanką w łaźni wodnej lub koralikowej, aby utrzymać ciepłotę tkanki (38.5 °C). Po przetworzeniu ostatniego jajnika niezwłocznie rozmontuj, wyczyść i osusz sondę generatora zgodnie ze specyfikacją producenta.

6. Procedura filtracji

  1. Przeleć zdyspergowaną tkankę do lejka wyłożonego gazą, umieszczonego w kolbie Erlenmeyera. Przepłucz zawartość probówki do lejka, używając ciepłego (38,5 °C) PBS + PenStrep, aż w probówce nie pozostaną żadne fragmenty tkanki.
  2. Wymuś przejście fragmentów tkanki przez otwory w materiale, skręcając gazę wokół fragmentów tkanki i wyciskając ją, aż z gazy zostanie usunięty cały nadmiar płynu i tkanki.
  3. Ponownie rozprostuj gazę nad lejkiem, przepłucz ją za pomocą pipety transferowej przy użyciu PBS + PenStrep, a następnie ponownie wyciśnij wszelkie pozostałe fragmenty tkanki przez materiał.
  4. Używając kleszczyków hemostatycznych, przytrzymaj sitko komórkowe 300 µm nad zlewką o pojemności 200 mL. Przelej filtrat z kolby Erlenmeyera przez sitko komórkowe. Przepłucz zawartość kolby do sitka, używając ciepłego (38,5 °C) PBS + PenStrep, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanki.
    1. Jeśli sitko komórkowe zostanie zapchane tkanką, delikatnie uderz nim o zlewkę, aby upewnić się, że cały płyn przefiltrował się do zlewki, a następnie odwróć sitko dnem do góry i wytrzep duże resztki tkanki na papier ochronny. Umieść sitko ponownie nad zlewką i kontynuuj przelewanie filtratu. Powtarzaj czynność w razie potrzeby, aż cały filtrat z kolby Erlenmeyera zostanie przefiltrowany.
  5. Używając kleszczyków hemostatycznych, przytrzymaj sitko komórkowe 40 µm nad drugą zlewką o pojemności 200 mL. Przelej filtrat z pierwszej zlewki 200 mL przez sitko komórkowe. Przepłucz zawartość zlewki do sitka, używając ciepłego (38,5 °C) PBS + PenStrep, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanki. Nie wyrzucaj zawartości sitka komórkowego 40 µm.
  6. Załóż igłę 18 G do strzykawki 20 mL. Napełnij strzykawkę medium FWM. Odwróć sitko komórkowe 40 µm dnem do góry nad kwadratową szalką Petriego i za pomocą strzykawki wypłucz zawartość sitka do szalki. Ponownie napełnij strzykawkę i płucz sitko komórkowe w razie potrzeby, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanki.
    UWAGA: Zazwyczaj 25 mL FWM jest wystarczające do całkowitego wypłukania zawartości sitka komórkowego 40 µm.

Układ przetwarzania tkanek; mikrotom i blender; schemat przygotowania tkanek do analizy.
Rycina 2: Organizacja stanowiska pracy do przetwarzania jajników i schemat procedury. (A) Stanowisko do przecinania jajników przed siekaniem oraz do filtrowania homogenatu jajnika. (B) Układ siekaczki do tkanek i homogenizatora, z podkładką ze styropianu w celu zmniejszenia wibracji platformy homogenizatora. (C) Schemat ilustrujący przebieg procesu przetwarzania jednego całego jajnika. Jajniki są oczyszczone z nadmiaru tkanki łącznej, a następnie przekrojone na pół i usuwa się rdzeń, aż do pozostawienia warstwy kory o grubości ~1 mm. Korę tnie się na kawałki o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm i sieka w siekaczce do tkanek ustawionej na interwał cięcia 500 µm. Następnie fragmenty są homogenizowane, a homogenat filtrowany przez gazę, a następnie przez sita komórkowe o rozmiarze oczek 300 µm i 40 µm. Zawartość sita 40 µm jest płukana do kwadratowej szalki Petriego, w której za pomocą stereomikroskopu wyszukiwane są pęcherzyki. Utworzono za pomocą BioRender.com. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

7. Poszukiwanie i zbieranie mieszków

  1. Przenieś kwadratową płytkę Petriego (krok 6.6) pod stereomikroskop z podgrzewanym stołikiem ustawionym na 38,5 °C. Powiększenie stereomikroskopu powinno zostać ustawione w zakresie od 1,25x do 3,2x, w zależności od preferencji operatora.
  2. Nanieś krople po 10 µL medium FWM do 60 mm płytki Petriego i przykryj krople olejem mineralnym, aby zapobiec ich wysychaniu. Umieść płytkę Petriego z kroplami mediów na płycie grzewczej ustawionej na 38,5 °C.
    UWAGA: Do zbierania pęcherzyków można użyć płytki 4-dołkowej. Do jednego lub dwóch dołków należy dodać 500 µL medium płuczącego. Umieścić płytkę na płycie grzewczej ustawionej na 38,5 °C.
  3. Przygotuj tłok i końcówkę mikropipety.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie szklanej mikropipety o objętości 1-5 µL (patrz Tabela materiałów), ponieważ pęcherzyki z mniejszym prawdopodobieństwem przylegają do szklanej pipety, co zapobiega ich utracie podczas przenoszenia między roztworami. Jest to również narzędzie wystarczająco małe, aby umożliwić łatwiejsze i bardziej precyzyjne mikromanipulacje pęcherzykami.
  4. Zlokalizuj pęcherzyki w kwadratowej płytce Petriego i przenieś je do kropel medium (FWM) za pomocą mikropipety. Wiele pęcherzyków może być zatopionych w szczątkach tkankowych i można je odzyskać za pomocą jednej z dwóch poniższych metod.
    UWAGA: Pęcherzyki mają kształt wydłużony, a nie idealnie sferyczny, i zazwyczaj posiadają oocyt, który przy ciemniejszym kontraście widoczny jest jako białe, lite koło w pobliżu centrum pęcherzyka (Rysunek 3A-C). Należy uważać, aby nie pomylić pęcherzyków z oocytami pozbawionymi komórek ziarnistych. Oocyty mają tendencję do przyjmowania kształtu idealnych sfer i są otoczone grubą, przezroczystą błoną (błoną przejrzystą). Do dokładniejszego zbadania pęcherzyków można użyć mikroskopu odwróconego z powiększeniem 10x (lub większym) (Rysunek 3D).
    1. Ostrożnie oddziel pęcherzyki od szczątków, używając końcówki mikropipety lub cienkich igieł (27 G).
    2. Alternatywnie, użyj szklanej pipety Pasteura z gumową gruszką, aby wielokrotnie wsysać i wypuszczać szczątki w płytce, w celu uwolnienia pęcherzyków z resztek tkankowych.
  5. Przeszukuj płytkę Petriego szybko, nie poświęcając na to więcej niż 30 min, aby pomóc zachować żywotność pęcherzyków.
  6. Umieść maksymalnie pięć pęcherzyków na jedną kroplę 10 µL, ponieważ większa gęstość może zwiększyć prawdopodobieństwo sklejania się pęcherzyków.

8. Test żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu

UWAGA: We wszystkich poniższych krokach należy używać pokrywki szalki Petriego lub płytki 4-dołkowej, ponieważ mieszkiki mniej przywierają do plastiku pokrywki niż do plastiku samej szalki.

  1. Przygotować PBS + 0,2% poliwinylopirolidonu (PVP), rozpuszczając 100 mg PVP w 50 mL PBS.
    UWAGA: PVP jest tutaj stosowane w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa przywierania mieszków do naczynia.
  2. Za pomocą mikropipety przenieść wszystkie pęcherzyki (średnio 40) z kropel medium do 50 µL kropli PBS + 0,2% PVP.
  3. Przemyć pęcherzyki 2x, przenosząc je sekwencyjnie do świeżych 50 µL kropel PBS + 0,2% PVP.
  4. Przenieść pęcherzyki do 285 µL kropli PBS + 0,2% PVP.
  5. Dodać 15 µL błękitu trypanu do 285 µL kropli PBS + 0,2% PVP (końcowe stężenie błękitu trypanu 0,05%) i ostrożnie wymieszać kroplę, używając końcówki pipety 200 µL ustawionej na 100 µL.
    UWAGA: W przypadku użycia płytki 4-dołkowej do testu żywotności błękitem trypanu, dodać 475 µL PBS + 0,2% PVP i 25 µL błękitu trypanu do jednego dołka.
  6. Inkubować pęcherzyki przez 1 min w kropli błękitu trypanu, a następnie przenieść pęcherzyki do 50 µL kropli (lub dołka 500 µL) PBS + 0,2% PVP.
  7. Przemyć pęcherzyki 3x zgodnie z krokiem 8.3, używając świeżych 50 µL kropel (lub 500 µL na dołek) PBS + 0,2% PVP.
  8. Odrzucić wszystkie pęcherzyki, które nadal wykazują niebieskie zabarwienie po trzech przemyciach w PBS + 0,2% PVP, ponieważ są one nieżywotne. Pęcherzyki, które nie zatrzymują niebieskiego zabarwienia po trzech przemyciach, są żywotne i mogą być wykorzystane do immunofluorescencji, hodowli lub innych procedur (Rysunek 3E). Zamrozić pęcherzyki gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia, jeśli jest to wymagane.
  9. Przeprowadzić analizę RT-qPCR oraz barwienie immunofluorescencyjne pęcherzyków zgodnie z opisem w krokach 9 i 10.

Obraz mikroskopowy gatunków mikroalg, przedstawiający struktury komórkowe i wymiary do badania taksonomicznego.
Rycina 3: Wyizolowane pęcherzyki i test wykluczania błękitu trypanowego. (A-C) Wyizolowane pęcherzyki obrazowano za pomocą stereomikroskopu przy różnych powiększeniach. (A) Wyizolowane pęcherzyki wśród zanieczyszczeń w początkowej szalce poszukiwawczej. Pojedyncze pęcherzyki zaznaczono czerwonym okręgiem. Pasek skali = 2 000 µm. (B) Wyizolowane pęcherzyki i zanieczyszczenia w kropli medium do płukania pęcherzyków pokrytej olejem mineralnym. Pasek skali = 1 000 µm. (C) Wyizolowane pęcherzyki bez zanieczyszczeń przy większym powiększeniu. Pasek skali = 1 000 µm. (D) Wyizolowane pęcherzyki obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu w polu jasnym. Pasek skali = 100 µm. (E) Reprezentatywne obrazy pęcherzyków żywotnych (niebarwionych) i nieżywotnych (barwionych na niebiesko) obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu w polu jasnym i obiektywu 20x. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

9. Analiza RT-qPCR

  1. Wyizolować RNA z żywotnych mieszków (z kroku 8.8) przy użyciu odczynnika do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Oczyścić RNA i potraktować DNazą, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Eluować RNA w 14 µL wody wolnej od RNaz i określić jego ilość za pomocą spektrofotometru. RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu syntezy cDNA.
  3. Przeprowadzić syntezę cDNA z równych ilości RNA wyekstrahowanego z mieszków pierwotnych i wczesnych wtórnych, używając dostępnego komercyjnie zestawu do syntezy cDNA (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 5 min w 25 °C, a następnie przez 60 min w 42 °C, po czym zakończyć reakcję poprzez ogrzewanie w 70 °C przez 5 min.
  4. Przeprowadzić RT-qPCR z zsyntetyzowanym cDNA (5 ng na reakcję) i starterami (Tabela 1) przy użyciu dostępnego komercyjnie miksu reakcyjnego (patrz Tabela materiałów). Zastosować następujące warunki cyklicznego termostatowania: 30 s w 95 °C dla aktywacji polimerazy, a następnie 40 cykli amplifikacji, gdzie każdy cykl obejmował 15 s w 95 °C dla denaturacji oraz 30 s w 60 °C dla przyłączania/elongacji. Przeanalizować wyniki RT-qPCR poprzez wyznaczenie wartości progu cyklu (Ct) i/lub zwizualizować produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    UWAGA: W niniejszym badaniu oceniono ekspresję transkryptu markera komórek granulozy FSHR oraz markera komórek linii zarodkowej DAZL . Genami referencyjnymi były H2A oraz ACTB.
  5. Przeprowadzić analizę krzywej topnienia, zwiększając temperaturę od 65 °C w przyrostach 0,5 °C co 5 s, aż do osiągnięcia 95 °C.

10. Analiza immunofluorescencyjna

  1. Utkwić żywe pęcherzyki (z kroku 8.8) przez 15 min w 100 µL kropli 4% (v/v) paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przemyć 3x w 100 µL kroplach PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20.
  2. Zablokować pęcherzyki przez 1 h w RT w buforze blokującym składającym się z 1x PBS + 5% (v/v) normalnego surowicy osiołkowej (NDS). Po blokowaniu inkubować pęcherzyki przez noc w 4 °C w 100 µL kropli 4 µg/mL przeciwciała króliczego anty-ludzkiego CX37 lub 4 µg/mL króliczego IgG izotypowego (kontrola negatywna) rozcieńczonego w buforze blokującym.
  3. Przemyć pęcherzyki 3x w 100 µL kroplach PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20, a następnie inkubować je przez 1 h w RT w ciemności w 100 µL kropli 2 µg/mL wtórnego przeciwciała osiołkowego anty-króliczego AlexaFluor 488 rozcieńczonego w buforze blokującym.
  4. Inkubować pęcherzyki przez 5 min w RT w ciemności w 100 µL kropli 1 µg/mL Hoechst 33342 rozcieńczonego w buforze blokującym w celu znakowania DNA.
  5. Przenieść pęcherzyki do 5 µL kropli medium montażowego (patrz Tabela Materiałów) na szklany preparat mikroskopowy i przykryć szkiełkiem podstawowym. Pozostawić preparaty do utrwalenia w RT przez noc, a następnie zabezpieczyć lakierem do paznokci. Przechowywać w 4 °C do czasu obrazowania.
  6. Wykonać obrazowanie wszystkich preparatów w ciągu 48 h od przykrycia szkiełkiem. Obrazowanie przeprowadzić za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego (patrz Tabela Materiałów) przy użyciu filtrów DAPI (pobudzenie 380 nm i emisja 450 nm) oraz FITC (pobudzenie 470 nm i emisja 525 nm).
  7. Ustawić stały czas ekspozycji dla obu kanałów. Dostosować czas ekspozycji FITC (CX37) na podstawie króliczej kontroli negatywnej izotypowej. Użyć obiektywu 20x i ustawić czas ekspozycji kanału DAPI na 50 ms, aby zidentyfikować pęcherzyki znakowane izotypem króliczym.
  8. Obrazować te pęcherzyki w kanale FITC i zmniejszać czas ekspozycji aż do całkowitego usunięcia zielonego sygnału tła. Zapisać ten czas ekspozycji.
  9. Obrazować wszystkie pęcherzyki znakowane przeciwciałem CX37, stosując czas ekspozycji ustawiony dla kanału FITC izotypowego oraz czas ekspozycji 50 ms dla kanału DAPI.
  10. Przetworzyć intensywność sygnału, mierzoną jako średnia wartość szarości obszaru po progowaniu, korzystając z programu komputerowego do przetwarzania obrazów29 (patrz Tabela Materiałów).
    1. Dostosować plik tiff obrazu DAPI dla każdego pęcherzyka tak, aby cały pęcherzyk był obrysowany. Użyć funkcji Analyze Particles programu, aby zaznaczyć cały pęcherzyk jako obszar zainteresowania (ROI).
    2. Otworzyć plik tiff obrazu FITC dla odpowiadającego pęcherzyka i nałożyć ROI wygenerowany z obrazu DAPI na obraz FITC. Użyć funkcji Measure programu, aby określić średnią wartość szarości obrazu FITC, która reprezentuje intensywność sygnału.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd i kluczowe etapy
Stosując niniejszy protokół, można niezawodnie wyizolować małe przedantralne pęcherzyki jajnikowe bydła z pojedynczych jajników w ilościach istotnych eksperymentalnie. Z łącznej liczby 30 powtórzeń uzyskano średnio 41 pęcherzyków na powtórzenie, w zakresie od 11 do 135 pęcherzyków (Rysunek 4A). W 14 powtórzeniach określono stopień rozwoju pęcherzyków zgodnie z wcześniejszym opisem26, mierząc średnicę pęcherzyków za pomocą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje powtarzalną metodę pobierania pęcherzyków przedantralnych we wczesnym stadium, szczególnie w stadium pierwotnym i wczesnym stadium wtórnym, z jajnika bydlęcego. Protokół ten opiera się na poprzednich raportach 20,25,30,34,35,36 i zapewnia optymalizacje, które skutkują izolacją znaczącej liczby pęcherzyków z pojedynczego jajnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt został częściowo sfinansowany przez wielostanowy projekt USDA W4112 i UC Davis Jastro Shields przyznane SM.

Autorzy chcieliby wyrazić swoje uznanie dla Central Valley Meat, Inc. za dostarczenie jajników bydlęcych używanych we wszystkich eksperymentach. Autorzy dziękują również Olivii Silverze za pomoc w przetwarzaniu jajników i izolacji mieszków włosowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-3/4 "Jednorazowa szklana pipeta Pasteura z sodą wapniowąDuran Wheaton Kimble63A54Pipeta Pasteura, której można używać do usuwania mieszków włosowych z gruzu podczas wyszukiwania na szalce Petriego
16% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15710Rozcieńczony do 4%; utrwalanie pęcherzyków do barwienia immunologicznego
20 ml Strzykawka Luer-lockFisher ScientificZ116882-100EAStrzykawka używana z igłą 18 G do usuwania pęcherzyków z 40 μ m Sitko komórkowe
# 21 Sterylne ostrze skalpelaFisher Scientific50-365-023Służy do cięcia jajników i usuwania medula
40 μ m Sitko komórkoweFisher Scientific 22-363-547Służy do filtrowania filtratu z 300 μ m sitko komórkowe
104 mm Plastikowy lejekFisher Scientific10-348CRozmiar może się różnić, ale upewnij się, że gaz serowy jest odpowiednio przycięty i że homogenat jajnika nie rozleje się ponad
300 μ m Sitko do komórekpluriSelect 43-50300-03Służy do filtrowania filtratu z gazy serowej 
500 ml Kolba ErlenmeyeraFisher ScientificFB500500Lejek i kolba służące do wyłapywania filtratu z gazy serowej 
Sterylne igły Air-Tite 18 GThermo Fisher Scientific14-817-15118 G zapewniają wystarczający nacisk, aby usunąć mieszki włosowe z 40 μ m sitko komórkowe
Sterylne igły Air-Tite 27 G 13 mmFisher Scientific14-817-171Igły, których można używać do manipulowania wszelkimi zanieczyszczeniami, w których utknęły mieszki
BD Hoechst 33342 RoztwórFisher ScientificBDB561908Fluorescencyjne barwienie DNA
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7030-100G Składnik mediów do płukania mieszków włosowych
Cheese ClothMikroskopia elektronowa Nauki71748-00Pierwszy etap filtracji homogenatu jajnikowego przeznaczony do usuwania dużych zanieczyszczeń tkankowych
Klasyczne maszynki do golenia z podwójną krawędziąWilkinson SwordN/AŻyletki, które najlepiej pasują do rozdrabniacza tkanek McIlwain i nie tępią się szybko
Przeciwciało wtórne osła-anty-królika, Alexa Fluor 488Fisher ScientificA-21206Przeciwciało wtórne do barwienia immunologicznego
Eisco Latex Pipette BulbsFisher ScientificS29388Gumowa gruszka do stosowania z pipetami Pasteura
HEPES BufferSigma-AldrichH3375Składnik pożywki do płukania mieszków
HomogenizatorVWR10032-336Homogenizacja tkanki jajnika w celu uwolnienia pęcherzyków 
ImageJ/FijiNIHv2.3.1Oprogramowanie używane do analizy immunolokalizacji fluorescencyjnej
McIlwainTissue Chopper Ted Pella10184Służy do cięcia tkanki jajnikowej wystarczająco małej do homogenizacji
Mikroskop - StereoskopOlympusSZX2-ILLTMikroskop preparacyjny używany do wyszukiwania i pobierania pęcherzyków z filtratu
Mikroskop - OdwróconyNikonDiaphot 300Mikroskop odwrócony używany do wizualizacji izolowanych mieszków włosowych w dużym powiększeniu w jasnym polu
Mikroskop - odwróconyECHORevolve R4Mikroskop odwrócony używany do wizualizacji dużego powiększenia jasnego pola i epifluorescencji izolowanych mieszków włosowych
Olej mineralnySigma-AldrichM8410-1LOlej do pokrywania kropli pożywki do płukania mieszków włosowych, aby zapobiec parowaniu podczas wyszukiwania
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140-050Składnik pożywki do płukania mieszków
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-001Odczynnik do buforu blokującego barwienie
immunologiczne Nunc 4-dołkowe naczynia do IVFThermo Fisher Scientific1444444-dołkowe naczynia do izolacji pęcherzyków i mycia
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100xGibco15-140-122Składnik pożywki do płukania mieszków
szalka Petriego 60 mm OD x 13,7 mmTed Pella10184-04Szalka Petriego, która najlepiej pasuje do McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificBP665-1Bufor do płukania jajników i mieszków
Plastikowa deska do krojeniaFisher Scientific09-002-24A Deskado krojenia o rozmiarach wystarczających do bezpiecznego cięcia jajniki
Poliwinylopirolidon (PVP)Fisher ScientificBP431-100Dodatek PVP (0,1% w/v) do PBS zapobiega przywieraniu pęcherzyków do płytki lub siebie nawzajem 
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Podłoże montażowe do fluorescencyjnie znakowanych komórek lub tkanek
Qiagen RNeasy Micro KitQiagen74004Zestaw do czyszczenia kolumny RNA
RThe R Foundationv4.1.2Oprogramowanie do analizy statystycznej
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-ludzkie Cx37 / GJA4Abcamab181701Cx37 do barwienia immunologicznego
Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT Zestaw dosyntezy cDNAThermo Fisher ScientificK1691
RstudioRStudio, PBCv2021.09.2Oprogramowanie do analizy statystycznej
Roztwór wodorotlenku sodu (1N/certyfikowany)Fisher ScientificSS266-1Służy do zwiększania pH podłoża do 7,6-7,8
Pirogronian sodu (NaPyr)Gibco11360-070Składnik medium do mycia mieszków włosowych
Kwadratowa szalka Petriego 100 mm x 15 mm Thermo Fisher Scientific60872-310Kratkowe szalki Petriego pozwalają na skuteczniejszą identyfikację mieszków włosowych 
SsoAdvanced Uniwersalny SYBR Green SupermixBioRad1725271Mastermix do reakcji PCR
Filtr butelkowy z gwintem SteritopSigma-AldrichS2GPT02RESłuży do sterylizacji podłoża do mycia mieszków włosowych
Bezpieczny dla SYBR barwnik żelowy DNAThermo Fisher ScientificS33102Barwienie do wizualnych produktów PCR na żelu agarozowym
TCM199 z Hank' s SoleGibco12-350-039Składnik medium do płukania mieszków włosowych
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100Detergent do immunologicznego buforu permeabilacyjnego
Odczynnik TrizolThermo Fisher Scientific15596026Odczynnik do izolacji RNA
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15-250-061Służy do badania żywotności izolowanych pęcherzyków
Tween 20Detergent do immunologicznego buforu do płukania
Podgrzewacz UniwersalnyWTA20931Ciepła płytka do utrzymywania mieszków włosowych na poziomie 38,5 & deg; C podczas poszukiwań pod mikroskopem
Wiretrol II Kalibrowane mikropipetyDrummond50002-005Szklane mikropipety do manipulowania mieszkami włosowymi
włosowe włosowych włosowych włosowych włosowych

Bibliografia

  1. Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
  2. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
  3. Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
  4. Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
  5. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  6. Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
  7. Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
  8. Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
  9. Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
  10. Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  11. Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
  12. McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
  13. Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706(2020).
  14. Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
  15. Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
  16. Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186(2021).
  17. Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
  18. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
  19. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  20. Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
  21. Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
  22. Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
  23. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
  24. Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
  25. Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
  26. Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
  27. vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
  28. Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277(2020).
  31. Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
  32. Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
  33. Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
  34. Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
  35. Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
  36. Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
  37. Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
  38. Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
  39. Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
  40. Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
  41. Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the 'holy grail' for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
  42. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
  43. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
  44. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  45. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja p cherzyk w preantralnychhomogenizacja tkankifolikulogenezakom rki granulozybarwienie b kitem trypanuRT qPCRlokalizacja immunofluorescencyjnakora jajnika
Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.