Artykuł metodologiczny

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

DOI:

10.3791/64425

⸱

16 września 2022

 ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gatunki Candida są czwartą najczęstszą przyczyną ogólnoustrojowych zakażeń szpitalnych. Kandydoza układowa lub inwazyjna często wiąże się z tworzeniem się biofilmu na wszczepionych urządzeniach lub cewnikach, co wiąże się ze zwiększoną zjadliwością i śmiertelnością. Biofilmy wytwarzane przez różne gatunki Candida wykazują zwiększoną odporność na różne leki przeciwgrzybicze. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania skutecznych immunoterapii lub leczenia wspomagającego przeciwko biofilmom Candida. Podczas gdy rola odporności komórkowej jest dobrze znana w ochronie przed Candida, rola odporności humoralnej została zbadana w mniejszym stopniu.

Postawiono hipotezę, że hamowanie tworzenia i dojrzewania biofilmu jest jedną z głównych funkcji przeciwciał ochronnych, a wcześniej wykazano, że przeciwciała przeciwko cewie zarodkowej Candida albicans (CAGTA) hamują wzrost in vitro i tworzenie biofilmu C. albicans. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół oceny roli przeciwciał w biofilmach tworzonych przez C. tropicalis. Metodologia tego protokołu obejmuje tworzenie biofilmu C. tropicalis na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych, które następnie inkubowano w obecności lub bez przeciwciał specyficznych dla antygenu, a następnie test 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilido-2H-tetrazolium (XTT) w celu pomiaru aktywności metabolicznej komórek grzybów w biofilmie.

Specyficzność została potwierdzona przez użycie odpowiednich kontroli surowicy, w tym surowicy zubożonej w przeciwciała Sap2. Wyniki pokazują, że przeciwciała obecne w surowicy uodpornionych zwierząt mogą hamować dojrzewanie biofilmu Candida in vitro. Podsumowując, artykuł ten dostarcza ważnych spostrzeżeń na temat potencjału przeciwciał w opracowywaniu nowych immunoterapii oraz synergicznych lub wspomagających terapii przeciwko biofilmom podczas inwazyjnej kandydozy. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kandydoza układowa jest czwartą główną przyczyną zakażeń szpitalnych, które są związane z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością na całym świecie. Na całym świecie kandydoza układowa dotyka około 700 000 osób1. Gatunki Candida, a mianowicie C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata i C. auris, są najczęstszą przyczyną inwazyjnych zakażeń Candida2. Gatunki Candida są oportunistycznymi patogenami, które wytwarzają biofilmy3. Biofilmy są głównie związane ze zjadliwością Candida, a Candida może wytrzymać warunki stresu oksydacyjnego i osmotycznego poprzez indukowanie tworzenia biofilmu4. Biofilmy dodatkowo modulują ekspresję czynników wirulencji i składników ściany komórkowej oraz tworzą egzopolimerową matrycę ochronną, pomagając Candida przystosować się do różnych nisz gospodarza4. Biofilmy przyczyniają się do przylegania drożdży do tkanek gospodarza i instrumentów medycznych5. W związku z tym tworzenie biofilmu wiąże się z przewagą drożdży, ponieważ komórki drożdży w biofilmach mogą unikać odpowiedzi immunologicznej gospodarza6. Tworzenie biofilmu chroni również chorobotwórcze drożdże przed działaniem leków przeciwgrzybiczych5. Zmniejszona wrażliwość biofilmów C. albicans na amfoterycynę B została wykazana przez Pierce et al.7,8. Ponadto biofilmy wykazują lekooporność przeciwgrzybiczą na flukonazol, co upośledza skuteczne leczenie kandydozy układowej9,10.

Mikroby mają wrodzoną tendencję do przylegania do różnych powierzchni biotycznych i abiotycznych, co powoduje powstawanie biofilmu. Candida albicans, który jest grzybem dymorficznym, występuje w postaci drożdży i strzępek, a jego tworzenie biofilmu zostało scharakteryzowane w różnych systemach modelowych in vitro i in vivo11. Etapy tworzenia biofilmu obejmują przyleganie komórek Candida do podłoża, filamentację, proliferację i dojrzewanie biofilmu11. Początkowo forma drożdżowa C. albicans przylega do substratów, w tym wyrobów medycznych i tkanek ludzkich, następnie następuje filamentacja i proliferacja C. albicans do postaci strzępkowych i pseudostrzępkowych, a na końcu dojrzewanie biofilmów osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej11. Powstawanie biofilmu w dużej mierze przyczynia się do mechanizmów patogenezy C. albicans12. Gatunki Candida tworzą biofilmy odporne na leki, co sprawia, że ich eliminacja jest trudna13. Niewielka podgrupa populacji wytwarzającej biofilm C. albicans została opisana jako wysoce odporna na leki przeciwgrzybicze amfoterycyna B i chlorheksydyna14. Warto zauważyć, że komórki drożdży w biofilmach wykazują wysoką oporność na terapię wielolekową w porównaniu z komórkami drożdży w fazie planktonu i fazie proliferacji14. Zasugerowano, że komórki drożdży występujące w biofilmach są wysoce tolerancyjne na leki przeciwgrzybicze, co przyczynia się do przetrwania C. albicans w biofilmach14. Stwierdzono, że te istniejące komórki są fenotypowymi wariantami C. albicans, a nie mutantami14. Co więcej, komórki biofilmów Candida, znane jako "komórki trwałe", są tolerancyjne na wysokie dawki amfoterycyny-B i przyczyniają się do przeżycia Candida, stanowiąc tym samym duże obciążenie nawracającymi ogólnoustrojowymi infekcjami Candida u osób z grupy wysokiego ryzyka15.

Wzrost oporności na leki przeciwgrzybicze u szczepów Candida wymaga badań nad nowymi środkami przeciwgrzybiczymi i immunoterapiami. Jak wynika z wyżej wymienionych badań, biofilmy Candida wykazują zmniejszoną podatność na leki przeciwgrzybicze. Dlatego istnieje potrzeba poprawy immunoterapii w celu kontrolowania tworzenia biofilmu Candida. Wcześniejsze badania wykazały, że CAGTA może zapewnić skuteczną ochronę przed ogólnoustrojowymi infekcjami Candida poprzez hamowanie tworzenia biofilmu C. albicans in vitro16. Inne badanie wykazało, że immunizacja myszy białkiem rAls3-N C. albicans indukuje wysokie miana przeciwciał, które zakłócają tworzenie biofilmu C. albicans in vitro17. Przeciwciała anty-Als3-N wywierały również hamujący wpływ na rozprzestrzenianie się C. albicans z biofilmów17. Szczepionka NDV-3A oparta na C. albicans jest obecnie w fazie badań klinicznych i stwierdzono również, że surowice anty-NDV-3A zmniejszają tworzenie biofilmu C. auris18. Niedawne badanie zidentyfikowało hamowanie tworzenia biofilmu przez przeciwciała Sap2 jako mechanizm ochronny w mysim modelu kandydozy układowej19.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół in vitro do oceny wpływu przeciwciał specyficznych dla antygenu obecnych w surowicy poliklonalnej uzyskanej z różnych grup myszy szczepionych Sap2 na wstępnie uformowane biofilmy Candida tropicalis. Aby to osiągnąć, zoptymalizowano i opracowano w laboratorium metodę opartą na teście redukcji XTT, która może mierzyć żywotność biofilmu w szybki, czuły i wysokoprzepustowy sposób, w obecności lub braku przeciwciał.

Test XTT służy do pomiaru komórkowej aktywności metabolicznej jako wskaźnika żywotności komórek, proliferacji komórkowej i cytotoksyczności20. Ten test kolorymetryczny opiera się na redukcji żółtej soli tetrazolowej, 3'-[1-(fenyloaminokarbonylo)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksy-6-nitro)benzenosulfonowego hydratu (XTT) do pomarańczowego barwnika formazanu przez metabolicznie aktywne komórki. Ponieważ tylko żywe komórki mogą redukować XTT, ilość zredukowanego formazanu XTT jest proporcjonalna do intensywności koloru i żywotności komórek. Utworzony barwnik formazanu jest rozpuszczalny w wodzie i jest bezpośrednio oznaczany ilościowo za pomocą czytnika płytek. Ze względu na swoją rozpuszczalność w wodzie, test XTT pozwala na badanie nienaruszonych biofilmów, a także badanie wrażliwości biofilmu na leki, bez naruszania struktury biofilmu21. Dodatkowo metoda ta jest wdrażana w ocenach żywotności grzybów Candida ze względu na łatwość użycia, szybkość, dokładność, wysoką przepustowość i wysoki stopień odtwarzalności7,22.

Oprócz testu redukcji XTT, zidentyfikowano również wiele alternatywnych technik pomiaru ilości biofilmu. Niektóre z nich obejmują zastosowanie testu redukcji MTT, barwienie fioletem krystalicznym, kwantyfikację DNA, ilościową PCR, kwantyfikację białek, pomiar masy suchych komórek i liczenie żywotnych kolonii. Procedury te różnią się znacznie pod względem wymagań czasowych i kosztowych. Taff i in. przeprowadzili analizę porównawczą siedmiu różnych testów ilościowych biofilmu Candida i stwierdzili, że test XTT zapewnił najbardziej powtarzalną, dokładną i wydajną metodę ilościowego szacowania biofilmów C. albicans23. Techniki barwienia, takie jak fiolet krystaliczny, mają pewne ograniczenia; Test fioletu krystalicznego pośrednio określa ilość biofilmu, mierząc gęstość optyczną matrycy i komórek biofilmu barwionego fioletem krystalicznym. Chociaż test fioletu krystalicznego zapewnia dobrą miarę masy biofilmu, nie daje miary żywotności biofilmu, ponieważ barwi zarówno komórki drobnoustrojów, jak i macierz zewnątrzkomórkową24. Dhale i in. stwierdzili ponadto, że test redukcji XTT był najbardziej czułą, powtarzalną, dokładną, wydajną i specyficzną metodą wykrywania produkcji biofilmu w porównaniu z testem fioletu krystalicznego25. Doniesienia literaturowe wykazały, że test XTT dobrze koreluje z parametrem CFU/ml w metodzie liczenia CFU. Jednak w porównaniu z testem XTT, metoda CFU jest pracochłonna i powolna26. Co więcej, frakcja oderwanych żywych komórek może nie być reprezentatywna dla początkowej populacji biofilmu27. Chociaż test redukcji XTT wydaje się najlepszą dostępną opcją do ilościowego określenia żywotności, istnieje kilka ograniczeń tej techniki. Chociaż metoda XTT jest przydatna do porównań obejmujących jeden szczep grzyba, jej zastosowanie może być ograniczone w przypadku porównywania różnych szczepów i gatunków grzybów. Porównania między szczepami mogą być trudne ze względu na brak szczegółowej standaryzacji, ponieważ różne szczepy metabolizują substraty o różnych możliwościach21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

myszy BALB/c były trzymane w Obiekcie dla Małych Zwierząt w IIT Roorkee. Wszystkie zwierzęta utrzymywano w cyklu 12 godzin i 12 godzin światło i ciemność w temperaturze 25 °C i podawano im dietę granulowaną i wodę ad libitum. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Etyki Zwierząt (IAEC) IIT Roorkee.

1. Przygotowanie C. tropicalis

UWAGA: Grzyb Candida tropicalis należy do grupy ryzyka 2 patogenów i jest klasyfikowany jako mikroorganizm BSL2. Podczas pracy z gatunkami Candida należy zawsze używać certyfikowanych Szaf Bezpieczeństwa Biologicznego II klasy. Podczas pracy z C. tropicalis należy stosować techniki aseptyczne i sterylne oraz przestrzegać zalecanych procedur bezpieczeństwa biologicznego w celu prawidłowego usunięcia tego patogenu.

  1. Smugę C. tropicalis (szczep ATCC 750) na płytce agarowej z dekstrozą Sabouraud (SAB).
  2. Przygotować wyhodowaną przez noc kulturę C. tropicalis, zaszczepiając pojedynczą kolonię z płytki agarowej SAB do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki bulionowej SAB. Alternatywnie, użyć zamrożonego bulionu glicerolowego C. tropicalis i zaszczepić 100 μl bulionu glicerolu do sterylnej stożkowej kolby o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki bulionowej SAB.
  3. Inkubować kulturę C. tropicalis w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min w temperaturze 30 °C przez 24-48 godzin.
  4. Odwirować kulturę grzybów (komórki w fazie logarytmicznej) w temperaturze 2,150 × g przez 15 minut w temperaturze 21 °C.
  5. Odrzucić sklarowany osad i dodać do osadu 50 ml sterylnego 1x PBS. Umyj i ponownie zawieś granulat w sterylnym 1x PBS z delikatnym wirowaniem.
  6. Ponownie odwirować w stężeniu 2 150 × g przez 15 minut w temperaturze 21 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad grzybów w 10 ml sterylnego 1x PBS.
  7. Oblicz stężenie komórek, licząc za pomocą hemocytometru.
  8. Przygotować zapasy grzybów o końcowej gęstości 1,0 × 106 komórek/ml w pożywce RPMI 1640 kwasu morfolinowo-propanosulfonowego (MOPS). Zawiesinę komórek z kroku 1.6 należy natychmiast zużyć.
    UWAGA: Aby ustawić jedną 96-dołkową płytkę, całkowita potrzebna objętość wywaru grzybów wynosi 10 ml (100 μL/dołek). Skaluj zgodnie z potrzebami.

2. Tworzenie biofilmu C. tropicalis

  1. Przygotuj biofilmy Candida w 96-dołkowej płaskodennej płytce do mikromiareczkowania z polistyrenu, jak opisano wcześniej (Rysunek 1)28,29.
  2. Dodać 100 μl kultury C. tropicalis (z 10 6 komórek/ml bulionu, przygotowanego jak wyżej) do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania za pomocą pipety wielokanałowej (ryc. 2A). Zachowaj dwie ostatnie kolumny (11 i 12) jako kontrole ujemne "bez grzyba plus surowica" i "bez grzyba i bez surowicy", nie dodając komórek grzyba. Napełnij kolumny 11 i 12 100 μl samego podłoża RPMI 1640 MOPS.
  3. Przykryj płytkę do mikromiareczkowania pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w warunkach stacjonarnych.
  4. Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej (bez dotykania i przerywania biofilmów). Delikatnie postukaj w płytkę w pozycji odwróconej o bibułę, aby usunąć resztki nośnika.
  5. Umyj płytkę 200 μl 1x PBS (na dołek) za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać PBS bardzo delikatnie wzdłuż bocznych ścian studzienki, aby uniknąć przerwania biofilmu. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Powtórz pranie PBS 2x (w sumie trzy prania).
  6. Aby usunąć nadmiar PBS, należy wysuszyć płytkę na powietrzu (bez pokrywki) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

3. Leczenie biofilmu przeciwciałami

UWAGA: Biofilmy mogą być teraz przetwarzane w celu oceny zahamowania dojrzewania biofilmu przez przeciwciała. Jako źródło przeciwciał poliklonalnych wykorzystano surowicę mysie. Różne grupy myszy immunizowanych Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis i Sap2-parapsilosis) wraz z myszami immunizowanymi pozorowanym wykrwawiono retro-orbitalnie, a surowicę izolowano, jak opisano wcześniej19. Obecność przeciwciał anty-Sap2 potwierdzono za pomocą testu ELISA specyficznego dla Sap2, jak opisano wcześniej19.

  1. Przed użyciem przeprowadzić inaktywację termiczną surowicy (źródła przeciwciał poliklonalnych) w temperaturze 56 °C przez 30 minut, aby wykluczyć rolę dopełniacza w aktywności hamującej. Inaktywuj serum na gorąco przed rozcieńczeniem surowicy.
    UWAGA: Użyj surowicy od myszy pozorowanych, myszy przedimmunologicznych i surowicy zubożonej w przeciwciała Sap2 jako dodatkowych kontroli19. Surowicę zubożoną w przeciwciała przygotowano zgodnie z poprzednim badaniem19. Wśród seryjnych rozcieńczeń (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 i 1:12,800) dla surowicy badanej w tym protokole, zahamowanie dojrzewania biofilmu obserwowano w 1:25, 1:50 i 1:100; W związku z tym wybrano 1:50, aby zachować równowagę między hamowaniem a spożyciem surowicy.
  2. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek surowicy inaktywowanej termicznie w sterylnym pożywce RPMI 1640 MOPS (1:50). Stosować wspólne rozcieńczenie surowicy (1:50) dla wszystkich próbek surowicy, które mają być badane pod kątem hamowania dojrzewania biofilmu30.
  3. Dodać 100 μl wybranego rozcieńczenia surowicy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Dla każdej próbki dodaj rozcieńczenia surowicy w dwóch egzemplarzach, zgodnie z załączonym układem (Rysunek 2B).
    1. W kolumnie 10 nie dodawać rozcieńczenia surowicy; dodać tylko pożywkę RPMI 1640 MOPS do kontroli pozytywnej tylko na obecność grzyba.
      UWAGA: Kolumna 10, rzędy G1-G8 i H1-H8 początkowo zawierały komórki grzybów w RPMI-MOPS. Jednakże, podczas gdy RPMI-MOPS został dodany do kolumny 10 nawet po 24 godzinach, wiersze G1-G8 służyły jako kontrola PBS, a wiersze H1-H8 jako kontrola bez surowicy po 24 godzinach.
    2. W kolumnie 11 dodać rozcieńczenie surowicy w stosunku 1:50 do wszystkich studzienek, aby służyły jako kontrola ujemna surowicy bez grzyba i surowicy.
    3. W kolumnie 12 nie dodawać rozcieńczenia surowicy do żadnego studzienka; zachowaj to jako kontrolę ujemną bez grzybów i surowicy.
  4. Przykryj talerz pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.

4. Oszacowanie aktywności metabolicznej biofilmu

  1. Następnego dnia ostrożnie odessaj surowicę za pomocą pipety wielokanałowej (bez dotykania i przerywania biofilmu). Delikatnie postukaj w płytkę w pozycji odwróconej o bibułę, aby usunąć resztki surowicy.
  2. Przemyć płytkę 200 μl 1x PBS (na studzienkę) za pomocą pipety wielokanałowej, dodając PBS wzdłuż bocznych ścianek studzienki, aby uniknąć przerwania biofilmu. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej i powtórzyć płukanie PBS 2x (w sumie trzy płukania). Suszyć płytkę na powietrzu (bez pokrywki) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć nadmiar PBS.
  3. Przygotowanie XTT/menadionu:
    1. Preparat XTT należy przygotować w sterylnym mleczanie Ringers w postaci roztworu o stężeniu 0,5 g/l. Rozpuścić 25 mg XTT w 50 ml sterylizowanego przez filtr mleczanu Ringersa. Podaniec 10 ml w oddzielnych probówkach pokrytych folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotuj menadione jako zapas 10 mM. Rozpuścić 8,6 mg menadionu w 5 ml acetonu i rozprowadzić 50 μl w 100 oddzielnych mikroprobówkach. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotuj roztwór XTT/menadionu tuż przed użyciem, biorąc 10 ml XTT i dodając 1 μl menadionu, aby uzyskać 1 μM roztwór roboczy.
  4. Dodać 100 μl roztworu XTT/menadionu do dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Przykryj talerz pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w ciemności.
  5. Przenieść 80 μl barwnego supernatantu z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej. Odczyt płytki przy długości fali 490 nm.
  6. Obliczyć średnią wartości absorbancji studzienek w kolumnie 10 (kontrola dodatnia tylko w odniesieniu do grzybów), która posłuży jako wartość odniesienia do obliczenia procentowego zahamowania biofilmu przez każdą próbkę surowicy, stosując równanie (1).
    % zahamowania biofilmu = 100 - figure-protocol-1 × 100 (1)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy Candida tropicalis zostały wyhodowane na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych i zobrazowane z prędkością 40x za pomocą odwróconego mikroskopu (Rysunek 1A). Biofilm był następnie barwiony przy użyciu fioletu krystalicznego i obserwowany przy 40x za pomocą odwróconego mikroskopu (Ryc. 1B). Skaningowa mikroskopia elektronowa pokazuje reprezentatywny obraz biofilmu C. tropicalis (Ryc. 1C). W celu przeprowadzenia testu hamowania biofilm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje grzybicze wywoływane przez gatunki Candida są związane z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością na całym świecie. Rosnące zagrożenie inwazyjną infekcją grzybiczą wymaga wczesnego leczenia takich zagrażających życiu chorób. Większość zakażeń Candida wiąże się z tworzeniem biofilmów, które przylegają do różnych urządzeń medycznych i są odpowiedzialne za utrzymywanie się i nawroty infekcji grzybiczych w warunkach szpitalnych31. Biofilmy składają się z komórek drożdży lub ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departament Biotechnologii, Rząd Indii) oraz Nagrodę Badań nad Wczesną Karierą SER-1058-BIO (Rada Badań Naukowych i Inżynieryjnych, Rząd Indii) dla S.R. Autorzy potwierdzają przyznanie grantu ICMR-JRF dla P.C oraz grantu DBT-JRF dla P.S. Autorzy dziękują dr Ravikantowi Ranjanowi za sugestie dotyczące manuskryptu i pomoc techniczną ze strony pana Pradeepa Singha Thakura podczas SEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml stożkowe probówki wirówkoweBD Falcon546021
1x PBS-Przygotowanew laboratoriumNaCl : 4 g
KCl : 0,1 g
Na2HPO4:  0,72 g
KH2PO4 : 0,12 g
Woda 500 ml. Dostosuj pH do 7,4
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml BDFalcon546041
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowaniaNunc
Ogólny
Czytnik płytek do mikromiareczkowania
szalki PetriegoTarson460090
mleczan Ringersa,przygotowany w laboratoriumchlorek sodu 0,6 g, mleczan sodu 0,312 g, chlorek potasu 0,035 g, chlorek wapnia 0,027 g, woda 100 ml. Dostosuj do pH 7,0 
RPMI 1640 MOPSHimediaAT180
Dekstroza Sabouraud AgarSRL24613
Bulion dekstroza SabouraudSRL24835
XTT InvitrogenX6493
Inkubator 442404 Menadione Sigma M5625 Ogólny Wielokanałowa pipeta i końcówki Ogólny , , ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026(2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28(2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3(2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287(2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352(2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780(2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194(2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460(2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12(2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012(2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743(2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159(2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127(2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60(2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29(2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020(2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biofilmy Candidahamowanie przez przeciwcia atest XTTtworzenie biofilmurodki przeciwgrzybiczekontrole surowiczep ytka mikrotitracyjnadojrzewanie biofilmukandydaci na szczepionki

Powiązane artykuły