Artykuł metodologiczny

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

DOI:

10.3791/64428

⸱

16 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach ssaków i roślinach, metody znakowania zbliżeniowego (PL) z użyciem zmodyfikowanej peroksydazy askorbinianowej (APEX) lub ligazy biotyny Escherichia coli BirA (znanej jako BioID) okazały się skuteczne w identyfikacji interakcji białko-białko (PPI). APEX, BioID i TurboID, poprawiona wersja BioID, oprócz tego, że są cennymi technologiami, mają pewne ograniczenia. Niedawno opracowany AirID, nowatorska wersja BioID do identyfikacji zbliżeniowej w interakcjach białko-białko, przezwyciężyła te ograniczenia. Wcześniej AirID był stosowany w modelach zwierzęcych, podczas gdy obecne badanie pokazuje zastosowanie AirID w roślinach, a wyniki potwierdziły, że AirID działa lepiej w systemach roślinnych w porównaniu z innymi enzymami PL, takimi jak BioID i TurboID, do znakowania białek, które są proksymalne do białek docelowych. Oto protokół krok po kroku do identyfikacji partnerów interakcji białkowych przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2) jako modelu. Metody opisują budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, transformację biotyny, ekstrakcję białek i wzbogacanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa. Wyniki wskazują, że AirID jest nowym i idealnym enzymem do analizy IPP u roślin. Metoda może być stosowana do badania innych białek w roślinach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne białka komórkowe działają w ramach biologicznie regulowanego systemu, a interakcje białko-białko (PPI) są częścią tego systemu i podstawą wielu procesów komórkowych. Oprócz IPP, funkcja naturalnych białek jest promowana potranslacyjnie poprzez różne modyfikacje, takie jak tworzenie kompleksu, ubikwitynacja i fosforylacja. Dlatego badanie IPP jest istotne dla zrozumienia możliwej funkcji docelowych białek. IPP zostały przeprowadzone przy użyciu różnych technologii, takich jak analiza spektrometrii mas po immunoprecypitacji (analiza IP-MS)1, drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H)2, również tablice bezkomórkowe3. Metody te pozwoliły na zbadanie różnych istotnych ustaleń w dziedzinie badań. Metody te mają jednak pewne wady; na przykład Y2H jest czasochłonną i kosztowną strategią, która wymaga zbudowania biblioteki Y2H gatunków docelowych.

Dodatkowo, technika Y2H wykorzystuje drożdże, heterologiczny jednokomórkowy organizm eukariotyczny, który nie mógł dokładnie odzwierciedlić stanu komórkowego wyższych komórek eukariotycznych. IP-MS nie nadaje się do białek o wysokiej hydrofobowości i wykazuje niską skuteczność w wychwytywaniu słabych IPP. Różne niezbędne białka w roślinach, takie jak domena wiążąca nukleotydy i bogate w leucynę białka zawierające powtórzenia (NLR) oraz kinazy receptoropodobne (RLK), ulegają ekspresji na niskim poziomie i w większości przejściowo oddziałują z innymi białkami; Dlatego użycie tych metod jest niewystarczające do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji tych białek3.

Nowa technika zwana biotynylacją zbliżeniową (PB) pomaga badaczom identyfikować IPP. PB zależy od enzymów PL, które przyłączają się do białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI), a gdy białko partnerskie zbliża się do POI, PL przyłącza chemiczny znacznik biotyny do białka partnerskiego. Co więcej, oznakowane białko można zidentyfikować i szybko dowiedzieć się, które białko partnerskie przyłącza się do docelowego białka5. Poprzednie badania dowiodły, że BioID i TurboID są skutecznymi narzędziami do wykrywania IPP, zwłaszcza w roślinach, ale mają pewne ograniczenia4. BioID potrzebuje wysokiego poziomu biotyny do znakowania białek partnerskich, co zajmuje ponad 16 godzin. W porównaniu z BioID, TurboID jest bardziej korzystny, ponieważ znakuje białko w ciągu 10 minut i może znakować białko partnerskie w temperaturze pokojowej (RT). Jest również toksyczny dla komórek w pewnych warunkach i oznacza te białka, które nie wykazują interakcji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Aby przezwyciężyć te problemy, AirID, opracowany przez Kido et al., jest bardziej wydajny niż reszta enzymów znakujących, chociaż podobieństwo sekwencji wynosi 82% między BioID a AirID5. Aby sprawdzić skuteczność AirID, przeprowadziliśmy eksperyment z wykorzystaniem punktu POI ze znanymi powiązaniami. Eksperyment ten potwierdził, że AirID może bez wątpienia znakować powiązane białka w komórkach roślinnych. AirID jest cennym enzymem do analizy IPP in vitro i w komórkach. Powoduje mniejszą toksyczność i jest mniej błędny w procesach czasowych niż TurboID do oznaczania osób niebędących partnerami, co prowadzi do zabicia komórki. Pokazuje to, że AirID jest bardziej konkurencyjny niż inne enzymy znakujące biotynylację zbliżeniową. Jest dokładniejszy, ma większy potencjał w procesach czasochłonnych i jest mniej toksyczny in vitro i w żywych komórkach. Obecny protokół opisuje identyfikację oddziałujących białek APRR2 przy użyciu AirID jako enzymu PL; Ponadto metoda ta może być stosowana do innych białek w celu zbadania IPP u gatunków roślin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Cucumis sativus (ogórek) jest używany do analizy eksperymentalnej. Umieść nasiona w wodzie, inkubuj w temperaturze 50 °C przez 20 minut, a następnie umieść nasiona na bibule filtracyjnej na szalce Petriego na 12-16 godzin.
  2. Następnie przenieś nasiona do doniczek z ziemią (zakupionych komercyjnie) i hoduj w komorze klimatycznej o temperaturze 23 °C i 16 godzinach światła i 8 godzin ciemnego fotoperiodu.
  3. Utrzymuj rośliny w komorze klimatycznej przez 3-4 tygodnie, aż rośliny osiągną 3 lub 4 etapy liści, aby zapewnić skuteczną agroinfiltrację.

2. Konstruowanie AirID

  1. Użyj APRR2 jako białka docelowego i skonstruuj APRR2-AirID pod promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora (p35S: APRR2-AirID). Wprowadź go do wektora binarnego zgodnego z Gateway pEarleyGate1006 (dostarczonego przez dr Kathrin Schrick, Kansas State University) i zsyntetyzuj enzym PL bezpośrednio zgodnie z sekwencją podaną w pliku uzupełniającym 1.

3. Przygotowanie kompetentnych komórek

  1. Przygotowanie komórek kompetentnych DH5α
    1. Zaszczepić 2 ml LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl; pH = 7,0) komórkami E.Coli DH5α (bezpośrednio z zamrożonego wywaru bez rozmrażania) i rosnąć przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
    2. Świeżo zaszczepić 0,1%-0,5% inokulum z kultury O/N do 100 ml pożywki LB i hodować komórki, aż OD600 osiągnie wartość 0,4-0,6, a następnie inkubować kulturę w temperaturze 4 °C przez 30 min.
    3. Przenieść kulturę do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 2500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 10 ml 0,1 M lodowatego CaCl2 i umieścić na lodzie na 15 minut. Granulować komórki za pomocą wirowania 2500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Zawiesić komórki w 1 ml lodowatego 0,1 M CaCl2 + 20% glicerolu, podwielokrotność 100 μl do każdej probówki o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotowanie kompetentnych komórek GV3101
    1. Zaszczepić 2 ml LB (zawierającego 50 μg/ml gentamycyny i 25 μg/ml ryfampicyny) pojedynczą kolonią GV3101. Inkubować kulturę O/N w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.
    2. Zaszczepić 200 ml LB 1 ml nasyconej kultury na noc. Wstrząsnąć kulturą z prędkością 250 obr./min, inkubując ją w temperaturze 28 °C, aż OD600 będzie równa 0,5.
    3. Przenieść kulturę do czterech wstępnie schłodzonych, sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i umieścić na lodzie na 30 minut.
    4. Granulować komórki w temperaturze 2500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i umieścić granulki na lodzie.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml 0,1 M lodowatego roztworu CaCl2. Połącz komórki w jedną, wstępnie schłodzoną probówkę Oakridge o pojemności 50 ml.
    6. Osadzać komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml lodowatego roztworu CaCl2. Ustawić na lodzie na 30 minut.
    7. Osadzać komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml 0,1 M lodowatego roztworu CaCl2
      8. .
    8. Dozować komórki do podwielokrotności 50 μl we wstępnie schłodzonych sterylnych probówkach polipropylenowych. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C.

4. Agroinfiltracja

  1. Najpierw przenieś plazmid do agrobacterium
    1. Przenieść 2,5 μl plazmidu wytworzonego z etapu 2.1 do właściwych komórek szczepu agrobacterium tumefaciens GV3101 i inkubować na lodzie przez 30 minut.
    2. Przenieść probówkę zawierającą plazmid i właściwe komórki do ciekłego azotu na 3 minuty.
    3. Szok termiczny w temperaturze 37 °C przez 5 minut w inkubatorze, a następnie umieścić probówkę na lodzie na 2 minuty.
    4. Dodać 1 000 μl pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl; pH = 7,0) do agrobacterium i inkubować w temperaturze 30 °C i 118 obr./min przez 1 godzinę.
    5. Wirować przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    6. Wyrzucić górne 800 μl roztworu i wymieszać pozostały roztwór. Następnie ułóż go na LB (jak wspomniano w kroku 4.1.4 dodanym z agarem i 50 μg/ml kanamycyny dla plazmidu i 50 μg/ml gentamycyny i 25 μg/ml ryfampicyny dla komórek kompetentnych GV3010). Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godz.
      UWAGA: Lepiej jest wybrać kilka rodzin i przeprowadzić PCR, aby potwierdzić interesujący nas gen7.
  2. Zebrać kilka kolonii bakteryjnych z płytek i umieścić je w pożywce LB wraz z odpowiednimi antybiotykami (patrz krok 4.1.6). Inkubować w temperaturze 30 °C i 218 obr./min przez 36-48 godzin.
  3. Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki do OD600 = 1,0 w buforze agroinfiltracji (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringonu).
  4. Naciekać inokulum (wygenerowane z kroku 4.3) w (abaksyjnym) naskórku za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej.
    UWAGA: Lepiej jest naciekać cały liść i zdecydować się na replikację. W przypadku 4-5 roślin użyj jednego konstruktu. Na każdy liść wystarczy 1,5 ml zawieszonych agrobakterii.
  5. Rośliny należy utrzymywać przez 36 godzin w komorze klimatycznej przy 16-godzinnym świetle (około 75 μmol·m-2·s-1) i 8-godzinnym ciemnym fotoperiodze w temperaturze 23 °C.
  6. Po 36 godzinach infiltracji konstruktu, naciekać 1 ml 5 μM Biotyny (w 10 mM roztworze MgCl2) do już przefiltrowanych liści konstruktu.
  7. Utrzymuj traktowane rośliny przez dodatkowe 4-12 godzin przed zbraniem tkanki liściowej.
    UWAGA: Zgodnie z poprzednim badaniem, białko docelowe osiąga szczyt po 36 godzinach, więc wybierz 36 hpi biotyna infiltracje4,6. Czas inkubacji biotyny zależy od badania docelowego, ale zgodnie z obecnym eksperymentem 8-godzinny okres inkubacji jest bardziej odpowiedni do znakowania białek.

5. Pobieranie próbek

UWAGA: Wszystkie materiały do pobierania próbek powinny być sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną, a wszystkie kroki protokołu powinny być wykonywane w środowisku wolnym od zanieczyszczeń.

  1. Odetnij przesączone liście i szybko przenieś je do ciekłego azotu, aby uniknąć degradacji białka.
  2. Wykonaj wstępne wykrywanie białka za pomocą analiz immunoblotów6; jest to wysoce zalecane przed koimmunoprecypitacją (Co-IP).

6. Całkowita ekstrakcja białka z liści

  1. Zmiel liście za pomocą tłuczka i moździerza, szybko dodaj 2 ml 1x PBS-BSA PH 7,4 i powoli zmielić.
  2. Weź stożkową probówkę o pojemności 15 ml, umieść filtr materiału do szybkiej filtracji na górze stożkowej probówki, przenieś mieszaninę próbek do probówki przez filtr materiału do szybkiej filtracji i trzymaj ją na lodzie.
  3. Przenieś próbki do probówki o pojemności 2 ml i dodaj 1% koktajl inhibitorów białka.
  4. Wymieszać zawartość, obracając 7-8 razy w górę i w dół, a następnie odwirować przy 1.000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść górny rozpuszczalnik próbek do nowych probówek o pojemności 2 ml, dodać 10% β-D-maltozydu (β-D.M) i umieścić na lodzie na 5 minut. Wirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

7. Wyrównaj kolumnę odsalającą

  1. Odwirować kolumnę przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zaznacz jedną stronę kolumny i upewnij się, że oznaczona strona jest skierowana na zewnątrz podczas wszystkich procesów wirowania.
  2. Zdjąć górną i dolną pokrywę kolumny i odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Wylać płynny roztwór z probówki zbiorczej kolumny i dodać 5 ml 1x buforu PBS do przemycia.
  4. Odwirować kolumnę o stężeniu 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Powtórz kroki 7.3 i 7.4 co najmniej pięć razy.

8. Mycie koralików magnetycznych

  1. Weź probówkę o pojemności 1,5 ml i dodaj 50 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1.
  2. Dodaj 1 ml 1x PBS-BSA do mycia, dokładnie wymieszaj i umieść na stojaku magnetycznym na 3 minuty. Wyrzuć supernatant.
  3. Powtórz krok 8.2 co najmniej trzy razy.
  4. Po każdym myciu umieść rurkę na stojaku magnetycznym, aby zaadsorbować kulki w kierunku jednej strony tuby, aby usunąć bufor myjący.

9. Wzbogacanie białek biotynylowanych

  1. Dodać 2 ml próbek do kolumny i odwirować przy 1 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Dodaj 1 ml odsolonego ekstraktu białkowego do 50 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1, aby je zrównoważyć.
  3. Umieść probówkę na rotatorze z normalną prędkością, aby roztwór dokładnie się wymieszał i inkubował w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.
  4. Umieść koraliki na stojaku magnetycznym na 3 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zbiorą się po jednej stronie probówki, aby delikatnie usunąć supernatant.
  5. Dodać 1 ml buforu do przemywania I (2% SDS w wodzie), obracać w temperaturze RT przez 2 minuty na rotatorze i powtórzyć krok 9.4.
  6. Umieścić probówkę na rotatorze w temperaturze pokojowej na 2 minuty po dodaniu 1 ml buforu do przemywania II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v] i 1% Triton X-100). Powtórz krok 9.4.
  7. Dodać 1 ml buforu do przemywania III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v], 1% NP40 [v/v]) i obracać za pomocą wytrząsarki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz krok 9.4.
  8. Aby usunąć detergent, dodaj 1,7 ml 50 ml Tris-HCl (pH = 7,5) i powtórz krok 9.4. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  9. Przemyć kulki sześć razy przez 2 minuty każdy w 1 ml 50 mM buforu wodorowęglanu amonu w temperaturze pokojowej i powtórzyć krok 9.4.
  10. Dodać 50 μl ekstraktu białkowego zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12% (m/v) sacharozy (Suc), 2% (w/v) laurylosiarczanu litu i 1,5% (w/v) ditiotreitolu do kulek, szok termiczny w inkubatorze w temperaturze 100 °C przez 5 minut i postępować zgodnie z krokiem 9.4. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do analizy LC-MS/MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Według poprzednich badań, gen ogórka APRR2 jest genem kandydującym, który kontroluje kolor białych, niedojrzałych owoców8. W tym przypadku opracowano protokół wykorzystujący AirID jako enzym znakujący zbliżeniowo, aby znaleźć oddziałujące białko partnerskie APRR2 w ogórku. Konstrukt przeniesiono na liście ogórka, a po 36 godzinach od infiltracji przeniesiono biotynę. Po 48 godzinach pobrano próbki do analizy western blot w celu potwierdzenia udanej transformacji. Białka zostały w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym eksperymencie AirID został wykorzystany do znakowania zbliżeniowego, które Kido i in. opracowali za pomocą algorytmu rekonstrukcji enzymów przodków przy użyciu dużego zestawu danych genomu i pięciu konwencjonalnych enzymów BirA5. Losowe mutacje były wykorzystywane w tradycyjnej ewolucyjnej inżynierii białkowej w celu zwiększenia aktywności 9,10, ponieważ losowe mutacje nie mogą powodować dynamicznych zmian sekwencji. W porównaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 32000197 dla X.H.), Specjalny Grant Finansowy od Chińskiej Fundacji Nauk Podoktorskich (Grant nr 2019T120467 dla X.H.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetosyringonePekin solaribo nauka i technologia Co.LtdS1519
Acryl/Bis 30% roztwórSangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
Agarozatsingke (Szanghaj) Co.LtdTSJ001
Wodorowęglan amonuSangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd
BiotynaBBI nauki przyrodnicze G908BA0012
CaCl2BBI nauki przyrodniczeE209BA0008
Kompetentne komórki GV3101Wykonane w obecnym eksperymencie
Kolumna odsalającaThermo scientificWC321753
Kwas dezoksycholowySangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd
DH5&alfa; kompetentne komórkiWykonane w obecnym eksperymencieE.coli DH5α
β-D-maltozydBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Szanghaj) Co.LtdE104BA0029
GlycineSangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd161BA0031
HEPESBeijing solaribo science and technology Co.LtdH8090
LiClSangon Biotech (Szanghaj) Co.LtdH209BA0003
MESBeijing solaribo nauka i technologia Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Niemcy3429963Filtr do szybkiej filtracji
MgCl2Beijing solaribo science and technology Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH324BA0003
NP40Sangon Biotech (Szanghaj) Co.LtdN8030
Koktajl inhibitorów białkaBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD
SDSBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Szanghaj) Co.LtdS9430
Koraliki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną-C1Wzbogacanie biotechnologii7E511E1Koraliki magnetyczne
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Szanghaj) Co.LtdGB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Szanghaj) Co.LtdF828BA0020
TryptoneThermo scientificLP0042
G313BA0018G818BA0029 5820172

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226(2015).
  2. Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).
  3. Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).
  4. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).
  5. Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983(2020).
  6. Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).
  7. Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
  8. Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
  9. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  10. Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).
  11. Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  12. Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
  13. Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blokowanie s siedztwa AirIDznakowanie bia ek ro linnychwzbogacanie bia ek biotynylowanychmagnetyczne kulki z streptawidyntechnika agroinfiltracjianaliza Western blotanaliza LC MS MSoczyszczanie powinowactwaekstrakcja bia ek z og rka

Powiązane artykuły