Artykuł metodologiczny

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

DOI:

10.3791/64439

⸱

11 listopada 2022

 ,  , 
1Animal Sciences Research Center, University of Missouri, 2Universidad Nacional de Colombia, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wierność mejozy oocytów jest kluczowa dla generowania kompetentnych rozwojowo jaj euploidalnych. U ssaków oocyt ulega długotrwałemu zatrzymaniu w profazie I pierwszego podziału mejotycznego. Po okresie dojrzewania i wznowieniu mejozy błona jądrowa ulega demontażowi (rozpad otoczki jądrowej), a wrzeciono jest montowane głównie w centrum oocytu. Początkowe ustawienie wrzeciona centralnego jest niezbędne do ochrony przed nieprawidłowymi przyczepami kinetochorowo-mikrotubulowymi (MT) i aneuploidią. Centralnie umieszczone wrzeciono migruje w sposób wrażliwy na czas w kierunku kory mózgowej i jest to proces niezbędny do wytłoczenia maleńkiego ciała biegunowego. W komórkach mitotycznych pozycjonowanie wrzeciona opiera się na interakcji między astralnymi MT za pośrednictwem centrosomów a korą komórkową. Wręcz przeciwnie, oocyty myszy nie mają klasycznych centrosomów, a zamiast tego zawierają liczne acentriolarne centra organizacyjne MT (MTOC). Na etapie metafazy I oocyty myszy mają dwa różne zestawy MTOC: (1) MTOC, które są grupowane i sortowane w celu złożenia biegunów wrzeciona (polarne MTOC) oraz (2) metafazowe cytoplazmatyczne MTOC (mcMTOC), które pozostają w cytoplazmie i nie przyczyniają się bezpośrednio do tworzenia wrzeciona, ale odgrywają kluczową rolę w regulacji pozycjonowania wrzeciona i szybkiej migracji wrzeciona. W tym miejscu opisano metodę ablacji laserem wielofotonowym w celu selektywnego zubożenia endogennie znakowanych mcMTOC w oocytach pobranych od myszy reporterowych Cep192-eGfp. Metoda ta przyczynia się do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw pozycjonowania wrzeciona i migracji w oocytach ssaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Haploidalne gamety (plemniki i oocyty) są wytwarzane przez mejozę, która pociąga za sobą jedną rundę replikacji DNA, po której następują dwa kolejne podziały, które są niezbędne do zmniejszenia liczby chromosomów przed zapłodnieniem. U ssaków, we wczesnym okresie życia płodowego, oocyt ulega długotrwałemu zatrzymaniu (aż do dojrzewania) w stadium diplotenu profazy I pierwszego podziału mejotycznego, w stadium zwanym stadium pęcherzyka rozrodczego (GV). Po wznowieniu mejotycznym oocyt GV ulega rozpadowi otoczki jądrowej (NEBD), a wrzeciono jest montowane głównie w centrum oocytu1,2,3. Później, napędzany przez F-aktynę, wrzeciono migruje w odpowiednim czasie z centrum oocytu do kory mózgowej, aby zapewnić wysoce asymetryczny podział, w wyniku czego powstaje jajo z maleńkim ciałem polarnym (PB)4,5,6.

W komórkach mitotycznych centrosomy składają się z pary centrioli otoczonych przez okołocentryczne składniki materiału (PMC), takie jak perycentryna, γ-tubulina, Cep152 i Cep1927. Te centrosomy zawierające centriole przyczyniają się do wierności tworzenia wrzeciona dwubiegunowego8. Jednak centriole są tracone podczas wczesnej oogenezy u różnych gatunków, w tym gryzoni9. Dlatego oocyty myszy przyjmują niezależną od centrioli ścieżkę składania wrzeciona przy użyciu licznych centrów organizacyjnych mikrotubul acentriolarnych (MTOC) (MTOC)9,10. Po wznowieniu mejotycznym okołojądrowe MTOC przechodzą trzy odrębne etapy rekondensacji, rozciągania i fragmentacji na dużą liczbę mniejszych MTOCs11,12. Rozdrobnione MTOC są następnie grupowane i sortowane w celu zorganizowania dwubiegunowego wrzeciona10,13,14. Inna pula MTOC znajduje się w cytoplazmie podczas NEBD. Niektóre z tych cytoplazmatycznych MTOC migrują i tworzą bieguny wrzeciona (polarne MTOC, pMTOCs)10,11. Niedawno odkryto inny podzbiór cytoplazmatycznych MTOC, określany jako metafazowe cytoplazmatyczne MTOC (mcMTOC), które nie przyczyniają się do tworzenia biegunów wrzeciona, ale pozostają w cytoplazmie oocytów podczas metafazy I (Met I)15. Zubożenie mcMTOC przez wielofotonową ablację laserową lub nienormalne zwiększanie ich liczby przez hamowanie autofagii zaburza pozycjonowanie i migrację wrzeciona oraz zwiększa częstość występowania aneuploidii w oocytach metafazy II15.

Ciekawe, mcMTOCs różnią się od pMTOCs pod wieloma względami15. Na przykład, w przeciwieństwie do pMTOC, które pochodzą głównie z okołojądrowych MTOC, mcMTOC pochodzą z kory oocytów. Gdy wrzeciono nadal znajduje się w centrum oocytu, mcMTOC są zlokalizowane asymetrycznie przeciwnie do strony, na którą wrzeciono migruje w celu wytłaczania PB15. Astralne MT nie mogą dotrzeć do kory mózgowej w stosunkowo dużej komórce oocytu. W związku z tym te mcMTOC nukleują MT, aby zakotwiczyć wrzeciono (za pośrednictwem astralnych MTOC) do kory mózgowej. Odkrycia te sugerują model, w którym jądrowa siła MT mcMTOC przeciwdziała sile za pośrednictwem F-aktyny, która napędza migrację wrzeciona w kierunku kory mózgowej. Równowaga między tymi dwiema przeciwstawnymi siłami jest niezbędna do regulacji centralnego położenia wrzeciona i terminowej migracji wrzeciona15.

Do tej pory wszystkie badane białka PMC (perycentryna, g-tubulina, Cep192 i kinaza Aurora A) lokalizują się w obu pulach MTOC: mcMTOCs i pMTOCs15. W związku z tym nie ma chemicznego ani genetycznego podejścia do selektywnego zaburzania mcMTOC bez zakłócania pMTOC. Ograniczenia te można obejść, selektywnie celując w mcMTOC za pomocą ablacji laserowej. Wśród technologii laserowych opracowanych do mikroablacji, impulsowe wielofotonowe lasery femtosekundowe wykazują duży potencjał ze względu na ich precyzyjne oddziaływanie ograniczone do płaszczyzny ogniskowej, dużą głębokość penetracji światła bliskiej podczerwieni oraz zmniejszoną fototoksyczność i termiczne uszkodzenia komórki16,17,18. W pracy opisano selektywne podejście do ablacji mcMTOC w oocytach myszy przy użyciu lasera wielofotonowego sprzężonego z odwróconym mikroskopem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez University of Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). W niniejszym badaniu wykorzystano samice myszy reporterowych Cep192-eGFP w wieku 6-8 tygodni. Aby wygenerować myszy reporterowe Cep192-eGFP, wykorzystano naprawę ukierunkowaną na homologię za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zintegrowania genu reporterowego EGFP z genomem myszy CF-1. Reporter EGFP został połączony na C-końcu Cep192 (integralny składnik MTOC)15. Aby utrzymać kolonię myszy, wykorzystano homozygotyczne myszy reporterowe Cep192-eGfp. Wszystkie zwierzęta trzymano w klatkach (do czterech zwierząt na klatkę) w temperaturze 21 °C i wilgotności 55%, z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność i dostępem ad libitum do pożywienia i wody.

1. Kolekcja oocytów myszy

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną (Chatot, Ziomek i Bavister, CZB19, patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
    UWAGA: Pożywka CZB może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc (patrz plik uzupełniający 1 dla składu nośnika).
  2. Uzupełnij pożywkę CZB glutaminą (1 mM) i milrinonem (2,5 mM) (CZB + M) (patrz Tabela Materiałów) i umieść w inkubatorze.
    UWAGA: Milrinon jest inhibitorem fosfodiesterazy, który utrzymuje oocyty zatrzymane w profazie I i zapobiega wznowieniu mejozy20.
  3. Przygotować pożywkę zbiorczą (minimalna pożywka niezbędna bez wodorowęglanów, MEM) zawierającą 3 mg/ml poliwinylopirolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (plik uzupełniający 1) i milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, patrz tabela materiałów).
  4. Przygotować naczynia do pobierania i hodowli, przygotować cztery mikrokrople (100 μl) pożywki zbiorczej (MEM/PVP + M) i dwie mikrokrople (100 μl) pożywki hodowlanej (CZB + M) na szalkach Petriego o średnicy 60 mm i 35 mm i przykryć je olejem mineralnym (patrz Tabela Materiałów). Przechowywać naczynie zbiorcze na podgrzewaczu do szkiełek i umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Wstrzyknąć dootrzewnowo 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG, patrz tabela materiałów) dojrzałym płciowo (6-8 tygodniowym) samicom myszy reporterowych Cep192-eGFP 44-48 godzin przed pobraniem oocytów.
  6. Złóż myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy, zidentyfikuj i usuń jajniki21 i przenieś je do szkła zegarkowego zawierającego wstępnie podgrzaną pożywkę (MEM/PVP + M) w temperaturze 37 °C.
  7. Napraw jajnik, dotykając strzykawki o pojemności 1 ml do dna szkiełka zegarka i nakłuwając ją kilka razy (~ 40 razy na jajnik) za pomocą igieł do szycia połączonych ze sobą, aby uwolnić oocyty do pożywki.
  8. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś całe podłoże zawierające kompleksy wzgórko-oocyty (COC) z kroku 1.7 na pustą plastikową szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
  9. Pod mikroskopem stereoskopowym zbierz COC za pomocą szklanej pipety Pasteura i przenieś je do naczynia zbiorczego zawierającego MEM/PVP + M.
  10. Za pomocą wąskiej szklanej pipety Pasteura (o średnicy około 100 μm) należy mechanicznie usunąć oocyty poprzez delikatne, powtarzalne pipetowanie, a następnie przenieść i umyć je w czterech mikrokroplach (100 μL) MEM/PVP + M (naczynie zbiorcze) przed ich przeniesieniem do naczynia hodowlanego CZB + M.
  11. Inkubować obnażone oocyty przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w powietrzu.

2. Mikroiniekcja komórek jajowych

  1. Umieść kroplę 250 μl MEM/PVP + M w plastikowej pokrywce na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i zalej ją olejem mineralnym.
    UWAGA: Pokrywka szalki Petriego ma dolną krawędź, która zapewnia więcej miejsca na regulację mikromanipulatora.
  2. Włączyć system mikroiniekcji (patrz Tabela Materiałów).
  3. Umieścić naczynie do mikroiniekcji na etapie podgrzewania (37 °C) mikroskopu.
  4. Obciążyć igłę iniekcyjną 0,5 μl cRNA mCh-Cep192za pomocą końcówek pipet z mikroładowarką (patrz Tabela materiałów) i przymocować igłę do mikromanipulatora.
  5. Przenieść ogołocone oocyty (krok 1.11) do mikrokropli o objętości 250 μl (krok 2.1).
  6. Pod soczewką obiektywu 20x lub 40x dostosuj pozycję i ostrość igieł do wstrzykiwania i trzymania zgodnie z pozycją oocytu (Rysunek 1).
  7. Ustaw jednostkę mikroiniekcji i ustaw ciśnienie wtrysku (pi), ciśnienie kompensacyjne (pc) i czas wtrysku (ti), aby móc wstrzyknąć 5-10 pl cRNA mCh-Cep192 (aby egzogennie znakować MTOC).
  8. Ostrożnie wstrzyknij oocyty, nie dotykając jądra.
  9. Po wstrzyknięciu wszystkich oocytów umyj je trzema mikrokroplami CZB + M, przenieś do naczynia hodowlanego (CZB + M) i inkubuj przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję mCh-Cep192.

3. Dojrzewanie oocytów

  1. Przygotować pożywkę dojrzewającą, dodając glutaminę (1 mM) do pożywki CZB wstępnie zrównoważonej w inkubatorze z 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 godziny.
  2. Przygotować dwie mikrokrople (100 μl) pożywki do dojrzewania na szalce Petriego o średnicy 35 mm i zalać je olejem mineralnym (naczynie do dojrzewania).
  3. Przemyj oocyty zatrzymane w profazie I co najmniej trzy razy w 100 μl mikrokropli CZB wolnych od milrynonu, aby całkowicie usunąć milrinon i umożliwić wznowienie mejozy.
  4. Przenieść oocyty do naczynia do dojrzewania i inkubować je przez 5 godzin (etap prometafazy I) w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 37 °C.

4. Przygotowanie oocytów do ablacji i obrazowania

  1. Przenieść oocyty prometafazy I (etap 3.4) do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem zawierającego 100 μl pożywki dojrzewającej (etap 3.1) pokrytej olejem mineralnym.

5. Przygotowanie mikroskopu do ablacji

  1. Co najmniej 30 minut przed ablacją włączyć regulator temperatury inkubatora stage (patrz tabela materiałów) i ustawić go na 37 °C.
  2. Włącz regulator CO2 i ustaw go na 5% CO2 .
  3. Wybierz apochromatyczny obiektyw immersyjny z 40-krotnym powiększeniem w olejku i nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego.
  4. Zamontuj naczynie hodowlane ze szklanym dnem z oocytami na inkubatorze typu stage top i przykryj inkubator pokrywką gazową.
  5. W oprogramowaniu do akwizycji obrazów (patrz tabela materiałów) wybierz opcję umożliwiającą zapisanie wielu pozycji etapu (np. "Zdefiniuj, zaznacz i znajdź eksperyment"). Korzystając z oświetlenia jasnego pola światła przechodzącego, wyśrodkuj się na poszczególnych oocytach i zapisz ich pozycje.
  6. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu wybierz tryb skanowania XYZ, ustaw format obrazu na 256 x 256 pikseli, ustaw współczynnik powiększenia na 2.5x - 3.0x i wybierz częstotliwość skanowania 600 Hz. Odpowiada to czasowi przebywania piksela wynoszącemu około 1,6 μs.
  7. Ustaw linię lasera wzbudzającego o długości fali 488 nm na około 10% mocy lasera (co odpowiada 4,0 μW na poziomie próbki) (patrz tabela materiałów) i użyj pasma widmowego 500-550 nm do obserwacji sygnału GFP z MTOC. Do jednoczesnej obserwacji fluorescencji z mCherry oznaczonego Cep192 należy ustawić linię lasera wzbudzającego o długości fali 585 nm na około 8% mocy lasera (co odpowiada 10,7 μW na poziomie próbki) i użyć innego detektora ustawionego na szerokość pasma spektralnego 595-645 nm.
    UWAGA: Pomocne jest użycie detektora światła przechodzącego (TLD) mikroskopu konfokalnego do jednoczesnego wykrywania granic oocytów.
  8. Korzystając z trybu skanowania na żywo i ręcznego sterowania napędem z, przebadaj oocyt pod kątem MTOC.
  9. Po wykryciu mcMTOC narysuj wokół niego kwadratowy obszar zainteresowania (ROI).

6. Ablacja mcMTOC

  1. Ustaw laser femtosekundowy na długość fali 740 nm.
    UWAGA: Długość fali lasera można zmieniać w zależności od mikroskopu i warunków lasera.
  2. Użyj modulatora elektrooptycznego mikroskopu wielofotonowego (patrz tabela materiałów), aby ustawić moc lasera na 70%-80%, co odpowiada mocy 60-70 mW na płaszczyźnie próbki.
    UWAGA: Jeśli laser jest wyposażony w kompensator impulsów femtosekundowych, użyj go do skorygowania dyspersji opóźnienia grupy (GDD). Korekcja GDD zmniejsza ilość mocy lasera wymaganej do skutecznej ablacji mcMTOC i minimalizuje fotouszkodzenia oocytu. Sterowanie GDD jest zwykle zintegrowane z oprogramowaniem do akwizycji obrazu w komercyjnych mikroskopach wielofotonowych.
  3. Użyj tego samego formatu obrazu, współczynnika powiększenia i częstotliwości skanowania, co w kroku 5.6. Ustaw parametry uśredniania linii i ramek na 1.
  4. Kliknij przycisk Skanuj w oprogramowaniu, aby wykonać ablację mcMTOC poprzez przeprowadzenie pojedynczego skanu laserowego wybranego ROI.
  5. Użyj ustawień kanału z kroku 5.7, aby przejrzeć wyniki ablacji, porównując obrazy struktur znakowanych GFP wykonane przed i po ekspozycji laserem wielofotonowym. Jeśli ablacja się powiedzie, intensywność fluorescencji GFP w docelowym mcMTOC spada do poziomów obserwowanych w tle.
  6. Jeśli pozostaną jakieś fragmenty struktury znakowanej GFP, powtórz krok 6.4 jeden lub więcej razy, skupiając się na różnych płaszczyznach z mcMTOC.
  7. Użyj ustawień kanału z kroku 5.7, aby zweryfikować skuteczność ablacji przez całkowitą utratę sygnałów mCherry związanych z mcMTOC (mCh-Cep192).
  8. Powtarzaj kroki od 5.8 do 6.7, aż wszystkie MTOC oocytu (w różnych płaszczyznach ogniskowych) zostaną usunięte.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się mikroiniekcję mCh-Cep192 jako strategię potwierdzania wyczerpania mcMTOC po ekspozycji na laser wielofotonowy i wykluczania możliwości, że utrata fluorescencji GFP jest spowodowana fotowybielaniem GFP. Jednak mikroiniekcja tej sondy jest opcjonalna i nie jest wymagana do procedury ablacji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielofotonowa ablacja laserowa stanowi skuteczną metodę selektywnej ablacji struktur wewnątrzkomórkowych. W obecnym badaniu wykorzystano wielofotonową ablację laserową w celu selektywnego zubożenia mcMTOC w oocytach myszy. Ablacja laserowa skutecznie zubożyła mcMTOC, o czym świadczy zmniejszenie endogennej fluorescencji GFP w docelowych mcMTOC do poziomu porównywalnego z tłem. Egzogenny mCh-Cep192 w docelowych mcMTOC został również zniesiony po ablacji laserowej. Ablacja laserowa mcMTOC powinna być wykonywana w różnych płaszczyznach ogniskowych w oocycie (gdzie znajdują się mcMTOC, Rysunek 2), aby upewnić się, że wszystkie mcMTOC w oocycie są zubożone (Figura 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Mikroiniekcja oocytów. Mikroiniekcja mysiego oocytu zatrzymanego w profazie I z cRNA mCh-Cep192. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wyczerpanie mcMTOCs w oocytach myszy. Reprezentatywne obrazy pojedynczych płaszczyzn ogniskowych. Białe kwadraty wskazują mcMTOC przed i po wielofotonowej ablacji laserowej. Podziałka skali: 40 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyczerpanie mcMTOC w różnych płaszczyznach ogniskowych w oocycie myszy. Reprezentatywne maksymalne obrazy projekcyjne oocytu myszy poddanego ablacji mcMTOC. Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kompozycje Chatot, Ziomek i Bavister (CZB) oraz minimalny niezbędny nośnik bez wodorowęglanów (MEM/PVP). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieją różne metody zakłócania struktur związanych z cytoszkieletem w komórkach 22,23,24,25. Jednak znalezienie skutecznych technik selektywnego zaburzania docelowej struktury bez uszczerbku dla żywotności komórek jest wyzwaniem. Przedstawiona tutaj metoda ablacji laserem wielofotonowym jest skuteczną strategią indukowania selektywnych zaburzeń mechanicznych mcMTOC w oocycie bez zmiany żywotności oocytu.

Ablacja laserowa jest szeroko stosowana w celu zrozumienia mechanizmów molekularnych kontrolujących segregację chromosomów podczas mitozy i mejozy 22,23,26,27. Ze względu na stosunkowo duży rozmiar (>80 mm średnicy) oocytów ssaków w porównaniu z komórkami somatycznymi28, ablacja ich struktur wewnątrzkomórkowych stanowi wyzwanie. Co więcej, średnia objętość mcMTOC w oocytach metafazy I wynosi ~20 μm15, co stanowi dodatkowe wyzwanie. Aby przezwyciężyć te wyzwania, należy zastosować skuteczną metodę, która zapewnia głębszą penetrację tkanek. Główną zaletą stosowania lasera wielofotonowego do ablacji jest jego zdolność do głębszego wnikania w komórkę przy jednoczesnej minimalizacji efektów niepożądanych29.

Aby zweryfikować skuteczność i efektywność metody ablacji laserowej w celu zubożenia docelowej struktury, zaleca się użycie białka znakowanego fluorescencyjnie w celu identyfikacji docelowej struktury w czasie (przed i po ablacji)23. Ważne jest, aby zauważyć, że ablacja laserowa zubaża cały mcMTOC jako strukturę i chociaż mniejsze mcMTOC wymagają tylko jednej ekspozycji laserowej do wyczerpania, większe mcMTOC mogą wymagać więcej niż jednej ekspozycji laserowej w różnych płaszczyznach ogniskowych. Zaleca się również utrwalenie i immunoznakowanie podzbioru oocytów kontrolnych i oocytów poddanych ablacji mcMTOC za pomocą markera MTOC (takiego jak γ-tubulina, perycentryna lub Cep192) w celu dalszego potwierdzenia skuteczności ablacji mcMTOC. W oocytach kontrolnych obszary cytoplazmy przylegające do mcMTOC, ale nie pokrywające się z nimi, zostaną wystawione na działanie lasera.

Eksperyment ten wymaga kilku ablacji mcMTOC podczas poruszania się między różnymi płaszczyznami ogniskowymi w oocytach. Dlatego zdecydowanie zaleca się kilkukrotne przećwiczenie tej techniki przed wykonaniem eksperymentu, aby zminimalizować czas eksperymentu, zwiększając w ten sposób żywotność oocytów. Ponadto ważne jest, aby użyć minimalnej mocy lasera, która jest wystarczająca do wyczerpania mcMTOC bez wpływu na żywotność oocytów.

Ta technika ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, wielofotonowe mikroskopy konfokalne są stosunkowo droższe niż zwykłe mikroskopy konfokalne. Po drugie, zakłócenie wszystkich mcMTOC w różnych płaszczyznach ogniskowych jest bardziej czasochłonne niż perturbacje chemiczne lub genetyczne. Po trzecie, protokół ten wymaga umiejętności technicznych, aby usunąć wszystkie mcMTOC w jak najkrótszym czasie. Jednak po opanowaniu, zastosowanie lasera wielofotonowego stanowi doskonałą strategię zaburzania kilku struktur wewnątrzkomórkowych w oocytach myszy, w tym mcMTOC, przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów molekularnych regulujących pozycjonowanie wrzeciona i jego terminową migrację w oocytach ssaków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Balboula za ich cenną pomoc i dyskusje. Autorzy dziękują Melinie Schuh za uprzejme udostępnienie konstrukcji mCherry-Cep192. Badanie to było wspierane przez R35GM142537 (NIGMS, NIH) do AZB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-calowy cienkościenny przyrząd GL 1.0 OD/.75 IDWorld TW100F-4Igły iniekcyjne 
Szkło borokrzemianowe Marka rybacka Kat# 13-678-20D
Kapilary ze szkła borokrzemianowego Światowy instrument precyzyjny Cat# TW100-6Igły do trzymania 
Albumina surowicy bydlęcej MilliporeSigma Kat# A4503
Inkubator klatkowy do mikroskopu Leica DMI6000 BLife Imaging Services GmbH
Dwuwodny chlrody wapnioweMilliporeSigma Kontroler Cat# C7902
CO2 Pecon# 0506.000
CO2 Pokrywa HPPecon# 0506.020
DL-Kwas mlekowy MilliporeSigma Kot# L7900
DMi8Leica Nie dotyczyMikroskop 
EDTAMilliporeSigma Kat# E5134
Femtojet 4iEppendorf Nie dotyczyMikrowtryskiwacz 
Mikroładowarka FemtotipsFisher scientific 
Gentamycyna MilliporeSigma Kot# G1272
Gentamycyna MilliporeSigma Kat# 1272
Naczynie ze szklanym dnem Mat Tek CorporationCat# P35G-1.0-20-C 
Hepes MilliporeSigma Kat# H3784
Hepes Sól sodowaMilliporeSigmaCat # H3784
Hera Cell vios 160iThermo Nie dotyczyinkubatora CO2 
Spektralny mikorskop konfokalny do skanowania laserowego Leica TCP SP8 z odwróconym stojakiem DMI6000 BLeica Microsystems, IncN/A 
L-glutamina MilliporeSigmaCat#G8540
Siarczan magnezu dwuwodnyMilliporeSigma Cat# M7774
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire laser femtosekundowySpectra-PhysicsN/A
mCH-Cep192 cRNAN/A
Medium Essential Medium Eagle - MEMMilliporeSigmaCat #M0258
MilrinoneMilliporeSigmaCat# M4659
Olej mineralnyMilliporeSigmaCat# M5310
Minimalna niezbędna pożywka (MEM)MilliporeSigma Cat# M0268 - Mysz 1L
: Cep192-eGFP reporter CF-1N/A
szalka Petriego (100 mm)Fisherbrand Cat# FB0875712
szalka Petriego (35 mm)Corning Kat# 430165
szalka Petriego (60 mm)Sokół Kot# 351007
Czerwień fenolowa MilliporeSigma Kot# P5530
PoliwinylopirolidonMiliporeSigmaCat# P2307
Poliwinylopirolidon (PVP)MiliporeSigma Kat# P2307
Chlorek potasu MilliporeSigma Kat# P5405
Fosforan potasu jednozasadowy MilliporeSigma Kot# P5655
Klacz w ciąży i ostra; s gonadotropina w surowicy Lee BioSolutionsKot# 493-10-10 
Kwas pirogronowy MilliporeSigma Kat# P4562
Kwas pirogronowy MilliporeSigma Kat# P4562
Igły do szycia D.M.CN/AN° 5 * 16 igieł 
Wodorowęglan sodu MilliporeSigma Kat# S5761
Chlorek sodu MilliporeSigma Cat# S5886
Wkład grzewczy PPecon# 0426.300
Sterezoom S9iLeica Nie dotyczymikroskopu stereoskopowego 
Strzykawka 1 mlBD firma Kot# 309597
Tauryna MilliporeSigma Cat# T0625
Regulator temperatury Tempcontrol 37-2 digitalPecon# 0503.000
Regulator temperatury Cube do inkubatora klatkowegoLife Imaging Services GmbH
E5242956003

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
  2. Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  4. Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
  5. Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
  6. Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
  7. Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
  8. Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
  9. Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
  10. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  11. Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217(2015).
  12. Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
  13. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  14. Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
  15. Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
  16. Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
  17. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
  18. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  19. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104(2021).
  22. Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
  23. Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  24. Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
  25. Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
  26. Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
  27. Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
  28. Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ablacja wielofotonowacytoplazmatyczne MTOCpozycjonowanie wrzecionamejoza oocytumigracja wrzecionaekstruzja cia a polarnegoacentriolowe MTOCablacja ywych kom rekmyszy Cep192 eGfp

Powiązane artykuły