Method Article

Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)

DOI:

10.3791/64445

⸱

September 7th, 2022

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Protokół ten jest przydatny do oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju w celu obserwacji drobniejszej struktury embrionalnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomidor (Solanum lycopersicum L.) jest jedną z głównych upraw dochodowych na świecie. Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Wizualizacja drobniejszej struktury embrionalnej w nasionach pomidora jest często utrudniona przez śluz okrywy nasiennej, wielokomórkową powłokę warstwową i grubościenne bielmo, które należy rozwiązać przez pracochłonne osadzanie i sekcje. Prostszą alternatywą jest zastosowanie technik oczyszczania tkanek, które sprawiają, że nasiona stają się prawie przezroczyste za pomocą środków chemicznych. Chociaż konwencjonalne procedury oczyszczania pozwalają na głęboki wgląd w mniejsze nasiona z cieńszą okrywą nasienną, usuwanie nasion pomidorów nadal stanowi wyzwanie techniczne, zwłaszcza w późnych stadiach rozwojowych.

Prezentowany tutaj jest szybki i oszczędzający pracę protokół oczyszczania, który pozwala obserwować rozwój nasion pomidora od 3 do 23 dni po kwitnieniu, kiedy morfologia embrionalna jest prawie kompletna. Metoda ta łączy roztwór czyszczący na bazie wodzianu chloralu, szeroko stosowany u rzodkiewnika lekarskiego, z innymi modyfikacjami, w tym pominięciem utrwalania formaliny-acetoalkoholu (FAA), dodaniem podchlorynu sodu do nasion, usunięciem zmiękczonego śluzu okrywy nasiennej oraz myciem i obróbką próżniową. Metoda ta może być stosowana do skutecznego oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju i jest przydatna w pełnym monitorowaniu procesu rozwojowego zmutowanych nasion z dobrą rozdzielczością przestrzenną. Ten protokół oczyszczania może być również stosowany do głębokiego obrazowania innych ważnych komercyjnie gatunków z rodziny Solanaceae.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomidor (S. lycopersicum L.) jest jedną z najważniejszych upraw warzyw na świecie, z produkcją 186,8 miliona ton mięsistych owoców z 5,1 miliona hektarów w 2020 roku1. Należy do dużej rodziny Solanaceae z około 2 716 gatunkami2, w tym wieloma ważnymi komercyjnie roślinami uprawnymi, takimi jak bakłażan, papryka, ziemniaki i tytoń. Uprawiany pomidor jest gatunkiem diploidalnym (2n = 2x = 24) o rozmiarze genomu około 900 Mb3. Przez długi czas włożono wiele wysiłku w udomowienie i hodowlę pomidorów poprzez selekcję pożądanych cech z dzikich Solanum spp. W Tomato Genetics Resource Ce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj utrwalacz FAA, dodając 2,5 ml 37% formaldehydu, 2,5 ml lodowatego kwasu octowego i 45 ml 70% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Sproszkować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Świeżo przygotować utrwalacz FAA tuż przed użyciem.
    UWAGA: 37% formaldehyd jest i potencjalnie rakotwórczy w przypadku narażenia lub wdychania. Utrwalacz musi być wykonywany w dygestoriach przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej.
  2. Przygotuj roztwór klarujący, dodając 5 ml 100% glicerolu, 40 g hydratu chloralu i 10 ml wody destylowanej w szklanej butelce o pojemności 100 ml owiniętej f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy nasiona pomidorów zostały oczyszczone konwencjonalną metodą, jak u Arabidopsis, gęste komórki bielma blokowały wizualizację wczesnych zarodków pomidora przy 3 DAF i 6 DAF (Rysunek 3A,B). Wraz ze wzrostem całkowitej objętości zarodka, zarodek kulisty był ledwo rozpoznawalny przy 9 DAF (Ryc. 3C). Jednak wraz ze wzrostem wielkości nasion, ich przepuszczalność zmniejszyła się, co spowodowało rozmyty zarodek serca przy 12 DAF (Rysunek 3D.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z cięciem mechanicznym, technologia oczyszczania jest bardziej korzystna w przypadku obrazowania trójwymiarowego, ponieważ zachowuje integralność tkanek roślinnych lub organów16. Konwencjonalne protokoły oczyszczania są często ograniczone do małych próbek ze względu na łatwiejszą penetrację roztworów chemicznych. Nasiona pomidora są problematyczną próbką do oczyszczania tkanek, ponieważ są około 70 razy większe niż nasiona Arabidopsis i mają więcej barier przepuszczalności. O.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni dr Jie Le i dr Xiufen Song za ich pomocne sugestie dotyczące mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową i konwencjonalnej metody oczyszczania. Badania te zostały sfinansowane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31870299) oraz Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży Chińskiej Akademii Nauk. Rysunek 2 został utworzony za pomocą BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 000 i mikro; Pipeta LGILSONFA10006M
1 000 &mikro; L końcówki do pipetCorningT-1000-B
ml probówka wirówkowaAxygenMCT-200-C
37% formaldehydDAMAO685-2013
5 000 &mikro; L pipetaEppendorf3120000275
5 000 &mikro; L końcówki do pipetbiosharpBS-5000-TL
50 ml probówka wirówkowaCorning430829
Absolutny etanolBOYUAN678-2002
Szklanka do butelekFisherFB800-100
Hydrat chloraluMeryerM13315-100G
Szkiełko nakrywkoweMikroskop Leica384200
DICZeissAxio Imager A1Powiększenie 10x, 20x i 40x
Środek dezynfekującyQIKELONGAN17-9185
Igła preparcyjnaBioroyee17-9140
Glebaodżywcza do kwiatów Kleszcze FANGJIE
HAIOU4-94
Lodowaty kwas octowyBOYUAN676-2007
GlycerolSolarbioG8190
Mieszadło magnetyczneIKARET basic
Micro-TomTomato Genetics Resource CenterLA3911
Wytrząsarka orbitalnaQILINBEIERQB-206
Podłoże siewnePINDSTRUPLV713/018-LV252Przesiewanie: 0-10 mm
Pojedynczy wklęsły suwakHUABODEYI
SlajdLeica3800381
Mikroskop stereoskopowyLeicaS8 APOPowiększenie od 1x do 4x
Folia aluminiowaZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
Pompa próżniowaSHIDINGSHB-III
Miernik wirówSilogexMX-S
2 HBDY1895

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tomato Seed ClearingSeed DevelopmentTissue ClearingSodium Hypochlorite TreatmentSeed Coat MucilageEmbryo VisualizationDifferential Interference ContrastVacuum TreatmentEndosperm CellsSolanum Lycopersicum

Related Articles