Method Article

Skuteczny protokół oczyszczania do badania rozwoju nasion pomidora (Solanum lycopersicum L.)

DOI:

10.3791/64445

⸱

September 7th, 2022

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Protokół ten jest przydatny do oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju w celu obserwacji drobniejszej struktury embrionalnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomidor (Solanum lycopersicum L.) jest jedną z głównych upraw dochodowych na świecie. Nasiona pomidora są ważnym modelem do badania genetyki i biologii rozwoju podczas rozmnażania roślin. Wizualizacja drobniejszej struktury embrionalnej w nasionach pomidora jest często utrudniona przez śluz okrywy nasiennej, wielokomórkową powłokę warstwową i grubościenne bielmo, które należy rozwiązać przez pracochłonne osadzanie i sekcje. Prostszą alternatywą jest zastosowanie technik oczyszczania tkanek, które sprawiają, że nasiona stają się prawie przezroczyste za pomocą środków chemicznych. Chociaż konwencjonalne procedury oczyszczania pozwalają na głęboki wgląd w mniejsze nasiona z cieńszą okrywą nasienną, usuwanie nasion pomidorów nadal stanowi wyzwanie techniczne, zwłaszcza w późnych stadiach rozwojowych.

Prezentowany tutaj jest szybki i oszczędzający pracę protokół oczyszczania, który pozwala obserwować rozwój nasion pomidora od 3 do 23 dni po kwitnieniu, kiedy morfologia embrionalna jest prawie kompletna. Metoda ta łączy roztwór czyszczący na bazie wodzianu chloralu, szeroko stosowany u rzodkiewnika lekarskiego, z innymi modyfikacjami, w tym pominięciem utrwalania formaliny-acetoalkoholu (FAA), dodaniem podchlorynu sodu do nasion, usunięciem zmiękczonego śluzu okrywy nasiennej oraz myciem i obróbką próżniową. Metoda ta może być stosowana do skutecznego oczyszczania nasion pomidorów na różnych etapach rozwoju i jest przydatna w pełnym monitorowaniu procesu rozwojowego zmutowanych nasion z dobrą rozdzielczością przestrzenną. Ten protokół oczyszczania może być również stosowany do głębokiego obrazowania innych ważnych komercyjnie gatunków z rodziny Solanaceae.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomidor (S. lycopersicum L.) jest jedną z najważniejszych upraw warzyw na świecie, z produkcją 186,8 miliona ton mięsistych owoców z 5,1 miliona hektarów w 2020 roku1. Należy do dużej rodziny Solanaceae z około 2 716 gatunkami2, w tym wieloma ważnymi komercyjnie roślinami uprawnymi, takimi jak bakłażan, papryka, ziemniaki i tytoń. Uprawiany pomidor jest gatunkiem diploidalnym (2n = 2x = 24) o rozmiarze genomu około 900 Mb3. Przez długi czas włożono wiele wysiłku w udomowienie i hodowlę pomidorów poprzez selekcję pożądanych cech z dzikich Solanum spp. W Tomato Genetics Resource Center znajduje się ponad 5 000 akcesoriów do pomidorów, a ponad 80 000 plazm zarodkowych pomidorów jest przechowywanych na całym świecie4. Pomidor jest wieloletni w szklarni i rozmnaża się przez nasiona. Dojrzałe nasiona pomidora składają się z trzech głównych przedziałów: w pełni rozwiniętego zarodka, resztkowego bielma komórkowego i twardej okrywy nasiennej5,6 (Rysunek 1A). Po podwójnym zapłodnieniu rozwój bielma typu komórkowego poprzedza rozwój zygot. Po ~5-6 dniach od kwitnienia (DAF) po raz pierwszy obserwuje się dwukomórkowy prozarodek, gdy bielmo składa się z sześciu do ośmiu jąder7. U Solanum pimpinellifolium zarodek zbliża się do ostatecznego rozmiaru po 20 DAF, a nasiona są zdolne do kiełkowania po 32 DAF8. W miarę rozwoju zarodka bielmo jest stopniowo wchłaniane i w nasieniu pozostaje tylko niewielka ilość bielma. Bielmo resztkowe składa się z bielma mikropylarnego otaczającego wierzchołek korzenia i bielma bocznego w pozostałej części nasion9,10. Zewnętrzna okrywa nasienna rozwija się z pogrubionego i zdrewniałego zewnętrznego naskórka powłoki, a wraz z martwymi warstwami resztek powłoki tworzą twardą skorupę, aby chronić zarodek i bielmo5.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie dojrzałego ziarna w Solanum lycopersicum i Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia podłużna dojrzałego ziarna pomidora. (B) Anatomia podłużna dojrzałego nasiona rzodkiewnika. Dojrzałe nasiona pomidora są około 70 razy większe niż nasiona Arabidopsis. Podziałka = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Produkcja wysokiej jakości nasion pomidorów zależy od koordynacji między zarodkiem, bielmem i składnikami nasion matki11. Analiza kluczowych genów i sieci w rozwoju nasion wymaga głębokiego i pełnego zapisu fenotypowego zmutowanych nasion. Konwencjonalne techniki zatapiania i sekcji, takie jak przekrój półcienki i przekrój parafinowy, są szeroko stosowane do nasion pomidorów w celu obserwacji lokalnych i drobniejszych struktur zarodka12,13,14,15. Jednak analiza rozwoju nasion z cienkich odcinków jest zwykle pracochłonna i brakuje rozdzielczości przestrzennej osi z. Dla porównania, oczyszczanie tkanek jest szybką i skuteczną metodą określania etapu rozwoju wad zarodka, które najprawdopodobniej wystąpią16. Metoda oczyszczania zmniejsza nieprzezroczystość tkanki wewnętrznej poprzez homogenizację współczynnika załamania światła za pomocą jednego lub więcej czynników biochemicznych16. Oczyszczanie całych tkanek umożliwia obserwację struktury tkanki roślinnej bez niszczenia jej integralności, a połączenie technologii oczyszczania i obrazowania trójwymiarowego stało się idealnym rozwiązaniem do uzyskania informacji na temat morfologii i stanu rozwojowego organu roślinnego17,18. Z biegiem lat techniki oczyszczania nasion były stosowane u różnych gatunków roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare i Beta vulgaris19,20,21,22,23. Wśród nich technologia czyszczenia zalążków z całym wierzchowcem okazała się skutecznym podejściem do badania rozwoju nasionArabidopsis, ze względu na swoje niewielkie rozmiary, 4-5 warstw komórki okrywy nasiennej i bielmo typu jądrowego24,25. Dzięki ciągłemu aktualizowaniu różnych mieszanin klarujących, takich jak pojawienie się roztworu Hoyera 26, wewnętrzne struktury zalążka jęczmienia zostały zobrazowane z wysokim stopniem klarowności, chociaż jego bielmo stanowi większość nasion. Embriogenezę buraka cukrowego można zaobserwować poprzez oczyszczanie połączone z obróbką próżniową i zmiękczanie kwasem solnym19. Niemniej jednak, w przeciwieństwie do gatunków wymienionych powyżej, nie zgłoszono obserwacji embriologicznych poprzez protokoły oczyszczania nasion pomidorów. Uniemożliwia to szczegółowe badania rozwoju embrionalnego i nasiennego pomidorów.

Wodzian chloralu jest powszechnie stosowany jako roztwór oczyszczający, który pozwala na wyświetlanie zanurzonych tkanek i komórek na różnych płaszczyznach optycznych i zasadniczo zachowuje komórki lub składniki tkanki27,28,29. Protokół oczyszczania oparty na wodzianach chloralu został z powodzeniem wykorzystany do całościowego oczyszczania nasion w celu obserwacji zarodka i bielma Arabidopsis21,28. Jednak to rozwiązanie czyszczące nie jest skuteczne w usuwaniu nasion pomidorów, które są bardziej nieprzepuszczalne niż nasiona Arabidopsis. Bariery fizyczne obejmują: (1) powłoka pomidora ma prawie 20 warstw komórek w odległości od 3 do 15 DAF30,31, (2) bielmo pomidora jest typu komórkowego, a nie nuklearnego32, oraz (3) nasiona pomidora są około 70 razy większe pod względem wielkości33,34 oraz (4) wytwarzają duże ilości śluzu okrywy nasiennej, który blokuje przenikanie odczynników oczyszczających i wpływa na wizualizację komórek zarodka.

Dlatego ten raport przedstawia zoptymalizowaną metodę oczyszczania nasion pomidora na bazie wodzianu chloralu na różnych etapach, która pozwala na głębokie obrazowanie procesu rozwoju zarodka (Rysunek 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj utrwalacz FAA, dodając 2,5 ml 37% formaldehydu, 2,5 ml lodowatego kwasu octowego i 45 ml 70% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Sproszkować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Świeżo przygotować utrwalacz FAA tuż przed użyciem.
    UWAGA: 37% formaldehyd jest i potencjalnie rakotwórczy w przypadku narażenia lub wdychania. Utrwalacz musi być wykonywany w dygestoriach przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej.
  2. Przygotuj roztwór klarujący, dodając 5 ml 100% glicerolu, 40 g hydratu chloralu i 10 ml wody destylowanej w szklanej butelce o pojemności 100 ml owiniętej folią aluminiową. Rozpuścić za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc w temperaturze pokojowej. Przygotowany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
    UWAGA: Hydrat chloralu jest rakotwórczy i ma ostry zapach. Eksperyment należy przeprowadzić w dygestorium i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Hydrat chloralu łatwo rozpływa się w powietrzu i nie powinien być przechowywany w dużych ilościach. Roztwór czyszczący może rozkładać się pod wpływem światła i należy go trzymać z dala od światła.
  3. Przygotuj roztwór dezynfekujący, dodając 10 ml 6% podchlorynu sodu, 40 ml wody destylowanej i 50 μl Tween-20 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wiruj i przechowuj w temperaturze pokojowej. Świeżo przygotuj roztwór dezynfekujący tuż przed użyciem.
    UWAGA: Efektywna zawartość chloru w podchlorynie sodu, który był umieszczony przez długi czas, może się zmniejszyć, a zawartość 6% podchlorynu sodu można zwiększyć w zależności od rzeczywistej sytuacji.

2. Zbiór nasion

  1. Wysiewać nasiona pomidora (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, patrz tabela materiałów) w kwadratowych miskach o wymiarach 8 cm × 8 cm × 8 cm wypełnionych mieszanką gleby i podłoża (v/v) w proporcji 1:1 (patrz tabela materiałów) i rosnąć w pomieszczeniu do wzrostu z okresami światła/ciemności 16/8 godzin w temperaturze 24 ± 2 °C (dzień) i 18 ± 2 °C (noc), 60%-70% wilgotności względnej i natężenie światła 4,000 luksów. Około 6 tygodni później rośliny weszły w fazę kwitnienia.
  2. Oznacz datę kwitnienia niezależnych kwiatów w miejscu kwitnienia (kąt rozwarcia płatków wynosi 90°) i zapisz dzień po kwitnieniu (DAF).
  3. Zbierz owoce z 3 do 23 sadzonek pomidora DAF i natychmiast połóż je na lodzie. Owoce (nasiona lub zarodki) należy podzielić od 3 do 23 DAF na wczesne (3-10 DAF), średnie (11-16 DAF) i późne (17-23 DAF) owoce (nasiona lub zarodki).
    UWAGA: Nie zbieraj zbyt wielu owoców na raz i upewnij się, że nasiona z każdego owocu zostaną usunięte w ciągu 1 godziny w celu dalszej obróbki.
  4. W przypadku wczesnych owoców należy rozbić owoc i położyć go na szkiełku, a następnie ostrożnie zebrać świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów) przy powiększeniu od 1x do 4x. W przypadku średnich i późnych owoców rozbij owoce i bezpośrednio zbierz świeże nasiona za pomocą precyzyjnych kleszczy.

3. Oczyszczanie nasion za pomocą hydratów chloralu

UWAGA: Konwencjonalne35 i zoptymalizowane protokoły zostały porównane w tym badaniu pod kątem ich skuteczności usuwania nasion.

  1. Rozliczenie przy użyciu konwencjonalnego protokołu
    1. Świeże nasiona (otrzymane w kroku 2.4) umieścić natychmiast w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml utrwalacza FAA i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (5 obr./min, patrz tabela materiałów) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Odwodnić te nasiona w serii etanolu 70%, 95% i 100% etanolu (v/v) przez 1 godzinę każde na wytrząsarce orbitalnej (5 obr./min).
    3. Umieść nasiona w 3-5 kroplach roztworu klarującego (~100 μL) na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Zastąp szkiełko pojedynczym wklęsłym szkiełkiem (patrz Tabela materiałów) dla środkowych i późnych nasion.
    4. Szkiełka te lub pojedyncze szkiełka wklęsłe należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut (3 DAF), 2 godziny (6 DAF), 1 dzień (9 DAF), 3 dni (12 DAF) lub 7 dni (14 do 22 DAF) w zależności od etapów rozwoju materiału siewnego (im młodsze materiały, tym większa prędkość oczyszczania).
    5. Obserwuj próbki za pomocą mikroskopu z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC) wyposażonego w kamerę cyfrową (patrz tabela materiałów) przy powiększeniu 10x, 20x i 40x. Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy.
  2. Rozliczanie przy użyciu zoptymalizowanego protokołu
    1. Umieść świeże nasiona (uzyskane w kroku 2.4) bezpośrednio w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml roztworu dezynfekującego (krok 1.3).
      UWAGA: Liczba nasion zebranych w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml różni się w zależności od etapu rozwoju nasion. Szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1.
    2. Próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej (30 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 3 do 50 minut, aż najbardziej wewnętrzny zarys okrywy nasiennej będzie wyraźnie widoczny. Wyrzuć roztwór dezynfekujący.
      UWAGA: Wymagany czas inkubacji zależy od etapu rozwoju nasion (im późniejsze nasiona, tym dłuższy będzie czas inkubacji). Szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1.
    3. W przypadku średnich i późnych nasion przenieś nasiona na szkiełko i usuń śluz z nasion za pomocą kleszczy i igły preparacyjnej pod mikroskopem stereoskopowym pod powiększeniem od 1x do 4x. Przenieś nasiona z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku wczesnych nasion.
    4. Umyj nasiona 5x w 1,5 ml wody dejonizowanej, za każdym razem 10 s. Wyrzuć wodę dejonizowaną.
    5. Dodać roztwór klarujący o stężeniu 2 × objętości nasion, a następnie poddać działaniu próżni przez 0 do 50 minut (tabela 1) za pomocą pompy próżniowej (patrz tabela materiałów). Przerywaną obróbkę próżniową przeprowadza się z każdym zabiegiem próżniowym przez 10 minut w odstępach 10 minut.
    6. Zastąp świeżym roztworem czyszczącym o stężeniu 2 × objętości nasion. Probówkę wirówkową o pojemności 2 ml zawierającą nasiona należy przechowywać w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem przez 30 minut do 7 dni, aby ułatwić ich oczyszczenie (Tabela 1). Podczas inkubacji, w przypadku późnych zarodków, należy codziennie zastępować roztwór klarujący świeżym roztworem i poddawać nasiona obróbce próżniowej przez 10 minut.
    7. Przygotuj oczyszczone nasiona na szkiełkach podstawowych lub jednowklęsłych szkiełkach i obserwuj za pomocą mikroskopu DIC wyposażonego w kamerę cyfrową przy powiększeniu 10x, 20x i 40x. Dostosuj i zoptymalizuj jasność światła przechodzącego, suwak DIC i aperturę kondensora w czasie rzeczywistym dla każdej próbki i rejestruj obrazy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy nasiona pomidorów zostały oczyszczone konwencjonalną metodą, jak u Arabidopsis, gęste komórki bielma blokowały wizualizację wczesnych zarodków pomidora przy 3 DAF i 6 DAF (Rysunek 3A,B). Wraz ze wzrostem całkowitej objętości zarodka, zarodek kulisty był ledwo rozpoznawalny przy 9 DAF (Ryc. 3C). Jednak wraz ze wzrostem wielkości nasion, ich przepuszczalność zmniejszyła się, co spowodowało rozmyty zarodek serca przy 12 DAF (Rysunek 3D...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z cięciem mechanicznym, technologia oczyszczania jest bardziej korzystna w przypadku obrazowania trójwymiarowego, ponieważ zachowuje integralność tkanek roślinnych lub organów16. Konwencjonalne protokoły oczyszczania są często ograniczone do małych próbek ze względu na łatwiejszą penetrację roztworów chemicznych. Nasiona pomidora są problematyczną próbką do oczyszczania tkanek, ponieważ są około 70 razy większe niż nasiona Arabidopsis i mają więcej barier przepuszczalności. O...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni dr Jie Le i dr Xiufen Song za ich pomocne sugestie dotyczące mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową i konwencjonalnej metody oczyszczania. Badania te zostały sfinansowane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31870299) oraz Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży Chińskiej Akademii Nauk. Rysunek 2 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 000 i mikro; Pipeta LGILSONFA10006M
1 000 &mikro; L końcówki do pipetCorningT-1000-B
ml probówka wirówkowaAxygenMCT-200-C
37% formaldehydDAMAO685-2013
5 000 &mikro; L pipetaEppendorf3120000275
5 000 &mikro; L końcówki do pipetbiosharpBS-5000-TL
50 ml probówka wirówkowaCorning430829
Absolutny etanolBOYUAN678-2002
Szklanka do butelekFisherFB800-100
Hydrat chloraluMeryerM13315-100G
Szkiełko nakrywkoweMikroskop Leica384200
DICZeissAxio Imager A1Powiększenie 10x, 20x i 40x
Środek dezynfekującyQIKELONGAN17-9185
Igła preparcyjnaBioroyee17-9140
Glebaodżywcza do kwiatów Kleszcze FANGJIE
HAIOU4-94
Lodowaty kwas octowyBOYUAN676-2007
GlycerolSolarbioG8190
Mieszadło magnetyczneIKARET basic
Micro-TomTomato Genetics Resource CenterLA3911
Wytrząsarka orbitalnaQILINBEIERQB-206
Podłoże siewnePINDSTRUPLV713/018-LV252Przesiewanie: 0-10 mm
Pojedynczy wklęsły suwakHUABODEYI
SlajdLeica3800381
Mikroskop stereoskopowyLeicaS8 APOPowiększenie od 1x do 4x
Folia aluminiowaZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
Pompa próżniowaSHIDINGSHB-III
Miernik wirówSilogexMX-S
2 HBDY1895

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
  4. Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
  5. Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
  6. Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101(2022).
  7. Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
  8. Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49(2009).
  9. Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
  10. Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233(2014).
  11. Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
  12. Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
  13. Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
  14. Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
  15. Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
  16. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  17. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  18. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
  19. Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71(2019).
  20. Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
  21. Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148(2013).
  22. Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67(2017).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441(2018).
  24. Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382(2015).
  25. Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
  26. Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
  27. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
  28. Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
  29. Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
  30. Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
  31. de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
  32. Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
  33. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347(2009).
  34. Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3(2011).
  35. Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
  36. Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
  37. Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
  38. Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
  39. Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
  40. Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
  41. Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tomato Seed ClearingSeed DevelopmentTissue ClearingSodium Hypochlorite TreatmentSeed Coat MucilageEmbryo VisualizationDifferential Interference ContrastVacuum TreatmentEndosperm CellsSolanum Lycopersicum

Related Articles