Artykuł metodologiczny

Elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64449

⸱

31 sierpnia 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University, State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Informujemy o zastosowaniu wysokiej jakości, elastycznej komory środowiskowej do obrazowania poklatkowego żywych komórek za pomocą pionowej, stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana z detekcją przesyłanego sygnału. Kropelki lipidów obrazowano w komórkach SKOV3 traktowanych kwasem oleinowym przez okres do 24 godzin w odstępie 3 minut.

Streszczenie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) to technologia obrazowania chemicznego bez znaczników. Obrazowanie żywych komórek za pomocą SRS zostało zademonstrowane w wielu zastosowaniach biologicznych i biomedycznych. Jednak długoterminowe poklatkowe obrazowanie SRS żywych komórek nie zostało powszechnie przyjęte. Mikroskopia SRS często wykorzystuje obiektyw zanurzeniowy w wodzie o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i kondensor zanurzeniowy w oleju o wysokiej wartości NA, aby uzyskać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku odstęp między obiektywem a kondensatorem wynosi tylko kilka milimetrów. W związku z tym większość komercyjnych komór środowiskowych typu stage top nie może być używana do obrazowania SRS ze względu na ich dużą grubość ze sztywną szklaną pokrywą. W artykule opisano projekt i wykonanie elastycznej komory, która może być używana do poklatkowego obrazowania żywych komórek z detekcją przesyłanego sygnału SRS na pionowej ramie mikroskopu. Elastyczność komory uzyskano dzięki zastosowaniu miękkiego materiału - cienkiej folii z kauczuku naturalnego. Nową konstrukcję obudowy i komory można łatwo dodać do istniejącej konfiguracji obrazowania SRS. Testy i wstępne wyniki pokazują, że elastyczny system komór umożliwia stabilne, długotrwałe, poklatkowe obrazowanie SRS żywych komórek, które w przyszłości może być wykorzystywane do różnych zastosowań bioobrazowania.

Wprowadzenie

Mikroskopia optyczna służy do obserwacji mikrostruktur próbek. Obrazowanie optyczne jest szybkie, mniej inwazyjne i mniej destrukcyjne niż inne technologie1. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii optycznej zostało opracowane w celu uchwycenia dynamiki hodowanych żywych komórek w długim okresie czasu2. Różne rodzaje kontrastów optycznych dostarczają wyraźnych informacji o próbkach biologicznych. Na przykład optyczna mikroskopia fazowa pokazuje subtelną różnicę we współczynnikach załamania światła w próbce3. Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do obrazowania określonych biomolekuł lub organelli komórkowych. Jednak szerokopasmowe widma wzbudzenia i emisji fluorescencji zwykle powodują nakładanie się widm, gdy wykonywane jest obrazowanie wielokolorowe4. Cząsteczki fluorescencyjne są wrażliwe na światło i mogą być wybielane po długotrwałej, okresowej ekspozycji na światło. Ponadto znakowanie fluorescencyjne może zmienić biodystrybucję cząsteczek w komórkach5. Mikroskopia SRS to bezznacznikowa technologia obrazowania chemicznego6. Kontrast SRS opiera się na przejściu wibracyjnym określonych wiązań chemicznych. Częstotliwość drgań wiązania chemicznego często wykazuje wąską szerokość pasma spektralnego, co umożliwia obrazowanie wielu pasm Ramana w tych samych próbkach7. Mikroskopia SRS to unikalne narzędzie do obrazowania żywych komórek, zapewniające wiele kontrastów chemicznych w sposób bezznacznikowy8.

Podczas gdy obrazowanie SRS niebarwionych komórek było używane w wielu badaniach, długoterminowe obrazowanie poklatkowe SRS żywych komórek nie zostało powszechnie przyjęte. Jednym z powodów jest to, że komercyjne komory otwarte nie mogą być bezpośrednio używane do obrazowania SRS ze względu na ich dużą grubość9,10,11,12. Te komory ze szklaną pokrywą są w większości przeznaczone do obrazowania w jasnym polu lub fluorescencji przy użyciu pojedynczego obiektywu o wysokiej wartości NA ze schematem wykrywania wstecznego. Jednak obrazowanie SRS preferuje transmisję detekcji przy użyciu zarówno obiektywu o wysokim NA, jak i kondensatora o wysokim NA, co pozostawia tylko bardzo krótki odstęp (zwykle kilka milimetrów) między obiektywem a kondensatorem. Aby przezwyciężyć ten problem, zaprojektowaliśmy elastyczną komorę z miękkiego materiału, aby umożliwić poklatkowe obrazowanie SRS żywych komórek przy użyciu pionowej ramy mikroskopu. W tej konstrukcji obiektyw zanurzający się w wodzie został zamknięty w miękkiej komorze i może swobodnie poruszać się w trzech wymiarach w celu ustawiania ostrości i obrazowania.

Optymalna temperatura do hodowli większości komórek ssaków wynosi 37 °C, podczas gdy temperatura w pomieszczeniu jest zawsze o 10° niższa. Temperatura wyższa lub niższa niż 37 °C ma dramatyczny wpływ na tempo wzrostu komórek13. Dlatego w systemie obrazowania żywych komórek wymagana jest kontrola temperatury środowiska hodowli komórkowej. Wiadomo, że niestabilność temperatury prowadzi do problemów z rozmyciem podczas długotrwałego obrazowania14. Aby osiągnąć stabilne środowisko o temperaturze 37 °C, zbudowaliśmy dużą komorę obudowy, która zakrywa całą ramę mikroskopu, w tym warstwę izolacji termicznej pod mikroskopem (Rysunek 1). W dużej komorze do kontroli temperatury, mała elastyczna komora pomaga dokładnie utrzymać fizjologiczną wilgotność i pH poprzez regulowany przepływ powietrza uzupełniony 5% CO2 (Rysunek 2). Temperatura i wilgotność komór zostały zmierzone w celu potwierdzenia, że konstrukcja dwukomorowa zapewnia optymalne warunki do hodowli komórek dla wzrostu komórek w długotrwałym, okresowym obrazowaniu SRS (Rysunek 3). Następnie zademonstrowaliśmy zastosowanie systemu do obrazowania poklatkowego i śledzenia kropelek lipidów (LD) w komórkach nowotworowych SKOV3 ( Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zbuduj obudowę środowiskową mikroskopu

UWAGA: Ta duża obudowa środowiskowa mikroskopu służy do kontrolowania temperatury korpusu mikroskopu i środowiska obrazowania, które ma być ustabilizowane na poziomie 37 °C (Rysunek 1A).

  1. Zaznacz położenie nóżek ramy mikroskopu SRS i stolika z napędem za pomocą markera na stole optycznym. Zamontuj dwie membrany tęczówki przed skanerem galwanometrycznym mikroskopu i dostosuj tak, aby pompa i wiązki laserowe Stokesa przechodziły przez środek przysłon irysowej.
  2. Zdejmij ramkę mikroskopu i stolik ze stołu optycznego.
  3. Połóż arkusz gumy silikonowej (rozmiar: 31 x 29 cali, grubość: 1/8 cala) na stole optycznym (Rysunek 1B).
  4. Przetnij gumę silikonową wzdłuż śladów za pomocą noża, usuń małe kawałki gumy i umieść kwadratowe arkusze ceramiczne MICA (rozmiar: 6 x 6 cali, grubość: 1/4 cala) w tych samych miejscach.
    UWAGA: Ceramika MICA jest materiałem łatwym w obróbce15. Jest twardy jak aluminium, ale jest doskonałym izolatorem termicznym. Arkusze ceramiczne MICA zostały użyte do zatrzymania przenoszenia ciepła z metalowej ramy mikroskopu i stolika do stołu optycznego ze stali nierdzewnej. W arkuszach MICA należy wywiercić kilka otworów przelotowych, aby umożliwić użycie 1/4-20 do montażu nóżek ramy i sceny.
  5. Przesuń ramę mikroskopu i stolik z powrotem na stół optyczny i ostrożnie wyrównaj nóżki na arkuszach ceramicznych MICA wzdłuż linii znaczników. Użyj 1/4-20, aby zamontować ramę i stolik na stole.
  6. Wyrównaj ścieżkę optyczną SRS. Wyreguluj mocowania lusterek Lustro 1 i Lustro 2 tak, aby wiązka lasera przechodziła przez środek dwóch wstępnie zamontowanych przysłon Iris (Rysunek 2).
    UWAGA: Szczegóły techniczne laboratoryjnego mikroskopu SRS używanego do obecnych prac nad obrazowaniem żywych komórek są opisane wcześniej16. Szerokość impulsu pompy i belek Stokesa wynosi ~3-4 ps z dyspersją pręta szklanego. Sterowanie systemem odbywa się za pomocą oprogramowania ScanImage17.
  7. Na tym fundamencie izolacji termicznej zmontuj obudowę środowiskową, aby pokryć całą ramę mikroskopu za pomocą pięciu kawałków dużych arkuszy poliwęglanu (rozmiar: 31 x 29 x 28 cali, grubość: 0,25 cala).
    UWAGA: Rozmiar obudowy jest określany na podstawie wymiarów ramy mikroskopu i stage. Przedni panel obudowy mikroskopu będzie musiał zostać tymczasowo usunięty, aby zainstalować elastyczną komorę i załadować miskę do hodowli komórkowych.
    1. Aby zmontować obudowę, należy wykonać proste prace obróbcze, w tym wycinanie, wiercenie i gwintowanie otworów na na każdej krawędzi arkuszy poliwęglanu. Wytnij dwa duże otwory o średnicy 2.6 cala po prawej i lewej stronie obudowy, aby dopasować odpowiednio rurkę dolotową i wylotową. Wytnij mały otwór o średnicy 5 mm na tylnym arkuszu, aby umożliwić wiązkom laserowym wejście do obudowy.
  8. Uszczelnij krawędzie i interfejsy pudełka za pomocą taśmy z folii aluminiowej.
  9. Podłącz elastyczny wąż kanałowy do otworów wlotowych i wylotowych skrzynki obudowy, aby umożliwić cyrkulacyjny przepływ ciepłego powietrza pompowany i kontrolowany przez moduł nagrzewnicy. Umieść czujnik termiczny modułu grzałki w elastycznej komorze, w której komórki są hodowane i obrazowane. Ustaw temperaturę docelową na 37 °C.
    UWAGA: Dyfuzor może być użyty w celu uzyskania bardziej równomiernego rozkładu przepływu powietrza w obudowie środowiskowej.

2. Zmontuj elastyczną komorę

  1. Zamontuj obrabiany maszynowo pusty cylindryczny element aluminiowy 1 (materiał: aluminium 6061) do końcówki obiektywu za pomocą trzech dociskowych (Rysunek 2).
  2. Zamontuj obrabiany maszynowo pusty cylindryczny aluminiowy element 2 do uchwytu próbki za pomocą czterech 1/4-20 (Rysunek 2).
    UWAGA: Uchwyt próbki musi być zmodyfikowany tak, aby zawierał naczynie do hodowli komórek ze szklanym dnem o średnicy 50 mm. Wywierć otwór przelotowy w środku uchwytu na próbki za pomocą otwornicy 1-7/8 cala. Pogłębić otwór za pomocą otwornicy 50 mm i zachować głębokość otworu przelotowego ~1 mm.
  3. Zamontuj uchwyt próbki z aluminiowym elementem 2 na zmotoryzowanym stage i zamontuj go za pomocą.
  4. Umieść tuleję z folii z kauczuku naturalnego (grubość: 0,01 cala; przyklejoną klejem cyjanoakrylowym) między dwoma obrabianymi elementami aluminiowymi i zamontuj ją za pomocą gumek na każdym końcu.
  5. Podłączyć sprężoną butlę CO2 do modułu mieszalnika gazów za pomocą odpowiednich przewodów i złączy. Ustaw ciśnienie wejściowe CO2 na 20-25 psi. Użyj wbudowanego czujnika CO2 i sterownika, aby upewnić się, że moduł mieszacza powietrza może regulować i mieszać 5% CO2 z przepływem powietrza. Użyj wbudowanych filtrów, aby oczyścić przepływ powietrza.
  6. Za pomocą odpowiednich wężyków i złączy skieruj zmieszane powietrze (z 5% CO2) do wstępnie wysterylizowanej butelki na wodę umieszczonej na płycie grzejnej, a następnie skieruj nawilżone powietrze do elastycznej komory. Ustaw płytę grzejną na 37 °C. Rozpal strumień powietrza w ciepłej wodzie, aby zwiększyć wilgotność przepływu powietrza.

3. Przygotowanie do eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym SRS na żywych komórkach

  1. Przetrzyj wszystkie części elastycznej komory 70% etanolem, w tym końcówkę, obiektyw do zanurzania w wodzie i uchwyt na próbkę.
  2. Odkazić cały system szafy sterowniczej za pomocą lampy UV umieszczonej w obudowie na 20 do 30 min.
    UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa nie należy przebywać w pomieszczeniu laboratoryjnym podczas procesu dezynfekcji UV.
  3. Hodowla komórek SKOV3 na 50-milimetrowej szalce Petriego ze szklanym dnem przez 12 godzin w normalnych warunkach fizjologicznych w zwykłym inkubatorze.
    UWAGA: Uruchom hodowlę komórkową SKOV3 18 w standardowej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Odłącz obrabiany aluminiowy element 2 od uchwytu próbki, odkręcając.
    UWAGA: Jest to sposób na otwarcie elastycznej komory w celu załadowania naczynia do hodowli komórkowych.
  5. Załaduj naczynie do hodowli komórkowych. Pamiętaj, aby dodać olejek immersyjny na wierzch kondensatora przed umieszczeniem naczynia do hodowli komórkowych. Zdejmij pokrywę naczynia i unieruchom naczynie za pomocą clamps.
    UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, wszystkie czynności należy wykonywać w rękawiczkach.
  6. Opuść obiektyw do pożywki do hodowli komórkowej, aby uzyskać zgrubne ogniskowanie. Opuść aluminiowy element 2, aby zamknąć elastyczną komorę i zamontuj ją do uchwytu próbki za pomocą.
    UWAGA: Podkładka z gumy silikonowej o grubości 2 mm jest przymocowana do dolnej części aluminiowego elementu 2, aby szczelnie uszczelnić szczelinę.
  7. Ustaw dopływ powietrza z 5% CO2 i 19% O2 dla normalnej hodowli komórkowej o natężeniu przepływu powietrza 200 cc/min.
    UWAGA: Można zastosować niższe natężenie przepływu powietrza. Zależy to od tego, jak dobrze uszczelniona jest elastyczna komora.

4. Przeprowadzanie eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym SRS na żywych komórkach

  1. Dostosuj długość fali lasera do 805 nm, aby celować w przesunięcie Ramana o 2854 cm-1, które przypisuje się wibracjom wiązań chemicznychCH2. Użyj niskiej mocy lasera, aby zmniejszyć fotouszkodzenia komórek. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj średniej mocy ~15 mW lasera pompującego i ~7,5 mW lasera Stokesa (ustalonego na 1,045 nm) do długoterminowego obrazowania żywych komórek.
    UWAGA: Wyższa moc lasera zapewni lepszą jakość obrazowania SRS. Jednak zbyt duża moc lasera wywoła fotouszkodzenie żywych komórek. Istnieje kompromis między jakością obrazu a fotouszkodzeniami.
  2. Dostosuj i ustaw ostrość obiektywu, aby uzyskać dobre obrazowanie SRS komórek za pomocą przycisku FOCUS na panelu GŁÓWNE STEROWANIE oprogramowania. Aby wykonać szybkie ustawianie ostrości, ustaw numer piksela na 512 × 512 pikseli z czasem skupienia piksela 4,8 μs na panelu KONFIGURACJA.
  3. Ustaw zakres wejściowy wzmacniacza lock-in (zwykle 5 mV) tak, aby był dwukrotnie większy od maksymalnego napięcia sygnału. Ustaw filtr dolnoprzepustowy tak, aby był taki sam jak czas przebywania pikseli (4,8 μs).
    UWAGA: Różne systemy SRS zbudowane w laboratorium mogą używać różnych ustawień akwizycji danych.
  4. Po uzyskaniu dobrej ostrości ustaw rozdzielczość obrazowania na 2 048 × 2 048 pikseli dla pola widzenia 175 μm2 w celu uzyskania obrazów wysokiej jakości. Sprawdź funkcję SAVE na panelu GŁÓWNE STEROWANIE i sprawdź kanał SRS na panelu KANAŁY. Ustaw czas interwału między dwiema klatkami na 180 s (3 min) na kanale MAIN CONTROLS. Ustaw numer akwizycji na 480 dla obrazowania poklatkowego przez 24 godziny
    UWAGA: W zależności od celu eksperymentów można zastosować niższą rozdzielczość obrazowania.
  5. Rozpocznij automatyczną akwizycję obrazowania za pomocą funkcji LOOP na panelu GŁÓWNE STEROWANIE.
    UWAGA: Sprawdź, czy w pierwszej godzinie obrazowania występuje dryft ogniskowej spowodowany niestabilnością temperatury. Obrazowanie w pierwszej godzinie może nie być stabilne. Sprawdzaj ostrość co 2-3 godziny podczas sesji obrazowania poklatkowego.
  6. Przetwarzaj zebrane obrazy za pomocą klasy ImageJ19. Do kwantyfikacji LD należy zastosować następujące dwie metody: (i) stosunek LD do powierzchni ciała komórki oraz (ii) średnią intensywność SRS całkowitej liczby LD. Zmierz obszar ciała komórki, progując i zerując piksele niekomórkowe na obrazach SRS na 2,854 cm-1. Zmierz obszar i intensywność LD, progując i zerując piksele inne niż LD na obrazach SRS.
    UWAGA: Więcej szczegółów na temat przetwarzania obrazu SRS zostało zgłoszonych wcześniej16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyprodukowaliśmy i zmontowaliśmy system elastycznych komór do obrazowania poklatkowego SRS (Rysunek 1 i Rysunek 2), a następnie oceniliśmy wydajność systemu. Temperatura wewnątrz obudowy środowiskowej mikroskopu osiągnęła oczekiwane 37 °C w ciągu 1 godziny, co nie wpłynęło znacząco na temperaturę w pomieszczeniu (Rysunek 3A). Temperatura w elastycznej komorze osiągnęła 37 °C w ciągu 1,5 godziny i była stabilnie utrzymywana na poziomie 37 °C przez co najmniej 24 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroskopia poklatkowa SRS na żywych komórkach jest alternatywną techniką obrazowania do śledzenia cząsteczek w sposób bezznacznikowy. W porównaniu do znakowania fluorescencyjnego, obrazowanie SRS jest wolne od fotowybielania, co umożliwia długoterminowe monitorowanie cząsteczek. Jednak do tej pory system obrazowania żywych komórek w pionowej mikroskopii SRS nie jest dostępny na rynku. W ramach tej pracy opracowano system obrazowania żywych komórek ze stabilną, izolowaną termicznie obudową mikroskopu i elastyczną wewnętr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcemy podziękować Starszemu Zespołowi Projektowemu 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza i James Walsh) na Uniwersytecie Binghamton za zaprojektowanie, wykonanie i przetestowanie obudowy mikroskopu. Dziękujemy Scottowi Hancockowi, Oldze Petrovej i Fabioli Moreno Olivas z Uniwersytetu Binghamton za pomocne dyskusje. Badania te były wspierane przez National Institutes of Health w ramach nagrody numer R15GM140444.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laboratoryjny mikroskop SRShttps://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz wzmacniacz blokującyZurich InstrumentsHF2LI
Przysłona irysowaThorlabs IncSM1D12
Kinematyczne mocowanie lustraThorlabs IncKM100
Ramka mikroskopuNikon IncFN-1
Zmotoryzowany stolik mikroskopowyPrior ScientificZ-Deck
Kondensator olejowy (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Nikon IncMBL71405
Obiektyw zanurzeniowy w wodzie (CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
Materiały i części do obudowy mikroskopu (31'' x 29'' x 28'' dł. x szer. x wys.)
Moduł grzewczy AirthermWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
Sterownik nagrzewnicy Airtherm, CO2 i monitor wilgotnościWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
Moduł mieszacza Air/CO2World Precision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
Elastyczny wąż kanałowy (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)McMaster-Carr56675K71
Wysokotemperaturowa ceramika szklano-mikowa, łatwa w obróbce (6'' x 6'', grubość 1/4'')McMaster-Carr8489K62
Arkusze poliwęglanu (grubość 0.25'')McMaster-Carr8574K286
Arkusze gumy silikonowej (36'' x 36'', grubość 1/8'')McMaster-Carr5827T43
Materiały i części do elastycznej komory
płyty grzejnejMcMaster-Carr31745K11
Filtr liniowy o wysokiej czystości, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
Otwornica (średnica cięcia 1-7/8 cal)McMaster-Carr4066A34
Otwornica (średnica cięcia 50 mm)McMaster-Carr4556A19
Rurka z gumy silikonowej wysokotemperaturowej, miękka, 2 mm ID, 5 mm ODMcMaster-Carr5054K313
Filtr liniowy (1/4 NPT, 40 mikronów)McMaster-Carr98385K843
Uniwersalna rura okrągła 6061 aluminiowa (grubość ścianki 1/8'', 4' ' OD)McMaster-Carr9056K42
Multipurpose 6061 Aluminiowa rura okrągła (grubość ścianki 3/4 '', 3-3/4 '' OD)McMaster-Carr9056K47
Uniwersalna kierownica aluminiowa 6061 (12'' x 12'', grubość 1/4'')McMaster-Carr8975K142
Uniwersalna kierownica aluminiowa 6061 (8'' x 8'', grubość 3/8'' ')Końcówka obiektywu McMaster-Carr9246K21
(pojedyncza)Nikon IncFN-MN-H
Uchwyt na próbkę (zmodyfikowany)Prior ScientificHZ202
Ultracienka folia z kauczuku naturalnego (grubość 0,01 '')McMaster-Carr8611K13
Szklany słoik zamykany próżniowoMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLABMathWorks
ImageJ (Fidżi)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCOprogramowanie do obrazowania
SRSMateriały do obrazowania żywych komórek
Pokrywowe sterylne naczynia hodowlane ze szklanym dnem (Dia.x H, 50 x 7 mm)Mikroskopia elektronowa (EMS)70674-02
Pożywka do hodowli komórkowychDMEM ThermoFisher Scientific11965092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor barwnik fluorescencyjny DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
Kwas oleinowyMilliporeSigma364525
Linia komórkowa SKOV3ATCCHTB-77
Moduł mieszacza

Bibliografia

  1. Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
  2. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  3. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  4. Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  5. lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).
  6. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870(2015).
  7. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  8. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  9. Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
  10. Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).
  11. Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
  12. Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
  13. Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
  14. Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
  15. Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
  16. Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
  17. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
  18. Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416(2021).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  20. Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
  21. Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  22. Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
  23. Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
  24. Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).
  25. Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
  26. Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).
  27. Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
  28. Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
  29. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  30. Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
  31. Cole, R. Live-cell imaging: the cell's perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
  32. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
  33. Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
  34. Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
  35. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia SRSobrazowanie time lapsekomora rodowiskowawysoka apertura numerycznaobrazowanie kropel lipidowychdwufotonowa fluorescencjahodowla kom rkowa

Powiązane artykuły