Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Powtarzalny model wpływu chrząstki w celu wygenerowania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów u królika

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64450

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Cell Biology and Physiology, Indiana University School of Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 4School of Mechanical Engineering, Purdue University, 5Large Animal Resource Center, Indiana University School of Medicine, 6Department of Mechanical and Energy Engineering, Indiana University-Purdue University Indianapolis

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Model otwartego wpływu kłykcia kości udowej przyśrodkowej u królików jest wiarygodny do badania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) i nowych strategii terapeutycznych mających na celu złagodzenie progresji PTOA. Protokół ten generuje izolowany ubytek chrząstki tylnego przyśrodkowego kłykcia kości udowej u królików za pomocą wieży zrzutowej opartej na wózku z głowicą impaktora.

Streszczenie

Pourazowa choroba zwyrodnieniowa stawów (PTOA) jest odpowiedzialna za 12% wszystkich przypadków choroby zwyrodnieniowej stawów w Stanach Zjednoczonych. PTOA może być zainicjowane przez pojedyncze zdarzenie urazowe, takie jak duże obciążenie udarowe działające na chrząstkę stawową, lub przez niestabilność stawu, jak ma to miejsce w przypadku zerwania więzadła krzyżowego przedniego. Obecnie nie ma skutecznych metod leczenia PTOA. Opracowanie wiarygodnego modelu zwierzęcego PTOA jest konieczne, aby lepiej zrozumieć mechanizmy zachodzące w procesie uszkodzenia chrząstki oraz zbadać nowe strategie leczenia w celu złagodzenia lub zapobieżenia postępowi PTOA. Protokół ten opisuje otwarty, oparty na wieży opadowej model uderzenia kłykcia kości udowej królika w celu wywołania uszkodzenia chrząstki. Model ten zapewniał obciążenia szczytowe 579,1 ± 71,1 N oraz naprężenia szczytowe 81,9 ± 10,1 MPa przy czasie do obciążenia szczytowego wynoszącym 2,4 ± 0,5 ms. Chrząstka stawowa z zaatakowanych przyśrodkowych kłykci kości udowej (MFC) miała wyższe wskaźniki komórek apoptotycznych (p = 0,0058) i miała wyższe wyniki Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową stawów (OARSI) wynoszące 3,38 ± 1,43 w porównaniu z niedotkniętymi przeciwległymi MFC (0,56 ± 0,42) i innymi powierzchniami chrząstki zatrzymanego kolana (p < 0,0001). Nie stwierdzono różnic w punktacji OARSI wśród powierzchni stawowych niedotkniętych chorobą (p > 0,05).

Wprowadzenie

Pourazowa choroba zwyrodnieniowa stawów (PTOA) jest główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie i odpowiada za 12%-16% objawowej choroby zwyrodnieniowej stawów (OA)1. Obecnie złotym standardem w leczeniu schyłkowej choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych i biodrowych jest całkowita endoprotezoplastyka stawu kolanowego i biodrowego2 lub artrodeza, jak w przypadku schyłkowego stadium zapalenia stawów piszczelowo-skokowych lub podskokowych. Chociaż w dużej mierze udana, endoprotezoplastyka może mieć kosztowne i chorobliwe powikłania3. Ponadto endoprotezoplastyka jest mniej pożądana u pacjentów poniżej 50 roku życia, biorąc pod uwagę niską przeżywalność implantu bez rewizji wynoszącą 77%-83%4,5. Obecnie nie ma zatwierdzonych przez FDA metod leczenia, które zapobiegałyby lub łagodziły postęp PTOA.

PTOA wpływa na cały staw, w tym na tkankę maziową, kość podchrzęstną i chrząstkę stawową. Charakteryzuje się zwyrodnieniem chrząstki stawowej, zapaleniem błony maziowej, przebudową kości podchrzęstnej i tworzeniem osteofitów6,7. Fenotyp PTOA rozwija się w wyniku złożonego procesu wzajemnego oddziaływania między chrząstką, błoną maziową i kością podchrzęstną. Obecnie wiadomo, że uszkodzenie chrząstki prowadzi do uwolnienia składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takich jak kolagen typu 2 (COL2) i aggrekan (ACAN). Te fragmenty składowe ECM są prozapalne i powodują zwiększoną produkcję IL-6, IL-1β i reaktywnych form tlenu. Mediatory te działają na chondrocyty, powodując regulację w górę metaloproteinaz macierzy (MMP), takich jak MMP-13, które degradują chrząstkę stawową, jednocześnie zmniejszając syntezę macierzy, co prowadzi do ogólnego środowiska katabolicznego dla chrząstki stawowej8. Ponadto istnieją dowody na zwiększoną apoptozę chondrocytów w pierwotnej chorobie zwyrodnieniowej stawów i PTOA9,10. Dysfunkcja mitochondriów występuje po suprafizjologicznym obciążeniu chrząstki11,12,13,14, co może prowadzić do zwiększonej apoptozy chondrocytów12,15. Zwiększona apoptoza chondrocytów wiąże się ze zwiększonym zubożeniem proteoglikanów i katabolizmem chrząstki i wykazano, że poprzedza zmiany w przebudowie chrząstki i kości podchrzęstnej16,17,18.

Podobnie jak w przypadku większości chorób ludzkich, potrzebne są wiarygodne i translacyjne modele PTOA, aby lepiej zrozumieć patofizjologię choroby i przetestować nowe metody leczenia. Duże zwierzęta, takie jak świnie i psy, były używane w modelach złamań śródstawowych i uderzeń PTOA17,19, ale są one kosztowne. Mniejsze modele zwierzęce, takie jak myszy, szczury i króliki, są tańsze i są wykorzystywane do badania PTOA generowanego przez destabilizację stawów, która zazwyczaj obejmuje chirurgiczne przecięcie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) i/lub przerwanie łąkotki przyśrodkowej20,21,22,23,24,25. Chociaż uraz stawu może prowadzić do różnych konsekwencji, w tym do uszkodzenia więzadeł26, mechaniczne przeciążenie chrząstki występuje w prawie wszystkich przypadkach.

Pojawiają się dowody na to, że patologia stojąca za rozwojem PTOA po niestabilności więzadeł (jak w przypadku przecięcia ACL) i ostrym uszkodzeniu chrzęstnym wynika z odrębnych mechanizmów27. Dlatego ważne jest opracowanie modeli bezpośredniego uszkodzenia chrząstki. Obecnie istnieje ograniczona liczba modeli uderzeniowych generujących uszkodzenia kostno-chrzęstne lub chrzęstne u szczurów i myszy28,29. Jednak chrząstka mysia nie nadaje się dobrze do generowania izolowanych ubytków chrzęstnych. Dzieje się tak, ponieważ mysia chrząstka stawowa ma tylko 3-5 warstw komórek grubości i brakuje zorganizowanych powierzchownych, promieniowych i przejściowych stref chrząstki, a także grubej zwapniałej warstwy chrząstki występującej u ludzi i większych zwierząt. Modele mysie wykazują również spontaniczne ustąpienie częściowych wad chrząstki30,31. Dlatego wybraliśmy królika do tego modelu uderzeniowego, ponieważ jego grubość i organizacja chrząstki są podobne do ludzkich i jest to najmniejszy model zwierzęcy, który pozwoli na zapewnienie spójnego uderzenia chrzęstnego, które skutkuje PTOA. Wcześniejsze otwarte modele chirurgiczne uderzenia kłykcia kości udowej u królika wykorzystywały wahadło32, ręczne sprężynowe urządzenie do zaklinania chrząstki33, oraz wieżę zrzutową, która umożliwiała tworzenie impaktora specyficznego dla królika34. Jednak w badaniach tych brakowało danych in vivo. Inni zgłosili dane in vivo z wahadłem35, pneumatic36 i spring-loaded37 impact devices10, a badania te wykazują wysoki wskaźnik zmienności naprężeń szczytowych i wskaźników obciążenia między metodami. Nadal jednak w tej dziedzinie brakuje spójnego podejścia do wiarygodnego modelowania ostrych urazów chrząstki in vivo.

Obecny protokół wykorzystuje system oparty na wieży opadającej, aby zapewnić stałe oddziaływanie na tylny kłykieć przyśrodkowy kolana królika. Dostęp tylny do kolana stosuje się w celu odsłonięcia tylnego przyśrodkowego kłykcia kości udowej. Szpilka Steinmana jest następnie umieszczana w poprzek kłykci kości udowej od przyśrodkowej do bocznej w linii z powierzchnią stawową i mocowana do platformy. Po zabezpieczeniu ładunek jest dostarczany do tylnego przyśrodkowego kłykcia kości udowej. Metoda ta pozwala na równomierne dostarczanie uszkodzeń chrząstki do powierzchni nośnej dystalnej kości udowej królika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższa procedura została przeprowadzona po uzyskaniu zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) przy Indiana University School of Medicine. Wszystkie operacje przeżyciowe przeprowadzono w warunkach sterylnych, zgodnie z wytycznymi NIH. Ryzyko bólu i infekcji ograniczono poprzez podawanie odpowiednich leków przeciwbólowych i antybiotyków w celu optymalizacji wyników. W obecnym badaniu wykorzystano dorosłe samce królików białych nowozelandzkich o masie 3,0-4,0 kg.

1. Budowa wieży zrzutowej

  1. Przygotuj rysunki CAD dla komponentów wieży spadkowej, platformy bazowej oraz mechanizmu zabezpieczającego pin Steinmana (Rysunki uzupełniające 1-14).
  2. Zakup dostępne komercyjnie komponenty (zob. Tabelę materiałów).
  3. Pozyskaj części maszynowe urządzenia lub przekaż rysunki CAD tokarzowi/ślusarzowi w celu wykonania.
    UWAGA: Do wykonania końcówki impaktora o średnicy 3 mm (Rysunek uzupełniający 1, część 20 oraz Rysunki uzupełniające 13, 14) wymagany jest wysokoprecyzyjny mechanik z możliwościami narzędziowymi. Powierzchnia uderzeniowa głowicy impaktora posiadała krzywizny odpowiednio 7,14 mm i 5,56 mm w płaszczyźnie strzałkowej i czołowej, aby dopasować się do krzywizny przyśrodkowego kłykcia królika35(Rysunki uzupełniające 13, 14).
  4. Zmontuj części w taki sposób, aby wieża spadkowa składała się z wózka poruszającego się na dwóch pionowych prętach za pomocą liniowych łożysk kulkowych o stałym ustawieniu, a platforma bazowa podtrzymywała królika i zabezpieczała pin Steinmana (Rysunek 1 oraz Rysunek 2).
    ​UWAGA: Belka poprzeczna wózka w tej konstrukcji posiada sztywność na zginanie równą sztywności poprzedniej wieży spadkowej38 z akceptowalnym poziomem wibracji.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Zważ królika i poddaj go znieczuleniu, stosując 2,5 mg/kg alfaxalonu i 0,15 mg/kg midazolamu domięśniowo (patrz Tabela materiałów). Po indukcji nanieś maść do oczu na oba oczy. Podtrzymuj znieczulenie, stosując ~2%-3% izofluranu. Podaj buprenorfinę SR (0,1 mg/kg) podskórnie w celu przeciwbólowego oraz okołoperacyjnie enrofloksacynę (10 mg/kg) podskórnie. Zamiast buprenorfiny można podać podskórnie NLPZ, takie jak karprofen (4 mg/kg), meloksykam (0,2–0,3 mg/kg) lub ketoprofen (3 mg/kg).
  2. Wygol tylną kończynę królika od kostki do zadka. Zaleca się zachowanie szczególnej ostrożności podczas usuwania sierści królika, aby zapobiec kontaminacji miejsca nacięcia. Ważne jest użycie zestawu dedykowanych, ostrych maszynek do strzyżenia królików.
  3. Umieść stalowy blok pod przednią kończynę (Rycina uzupełniająca 1, element nr 2 oraz Rycina uzupełniająca 4) pod końcem platformy uderzeniowej i przykryj platformę matą grzewczą. Połóż królika na brzuchu (pozycja pronowana) na macie grzewczej. Pod biodrem po stronie przeciwległej umieść wyściełaną podkładkę.
    1. Upewnij się, że kolano operowanej kończyny znajduje się w centrum i opiera się o blok polietylenowy (Rycina 2A1). Użyj jedwabnej taśmy, aby delikatnie odsunąć ogon ku górze i w stronę przeciwległą do operowanej kończyny.
  4. Przetrzyj pole operacyjne chloreksydyną i sterylną gazą nasączoną 70% alkoholem. Oczyść pole operacyjne, zaczynając od tylnej części kolana, wykonując koliste ruchy na zewnątrz. Powtórz czynność co najmniej 3 razy, używając świeżych gaz, kończąc 70% alkoholem.
  5. Nałóż sterylną rękawiczkę na stopę operowaną aż do kostki i owiń ją sterylnym bandażem spójnym.
  6. Sterylnie odizoluj pole operacyjne za pomocą trzech sterylnych pól: jednego bezpośrednio pod operowaną kończyną i dwóch pozostałych, aby przykryć resztę ciała. Przymocuj pola za pomocą klamer ręcznikowych.

3. Odsłonięcie chirurgiczne

UWAGA: Przed przeprowadzeniem operacji i uderzeniem należy empirycznie określić masę oraz wysokość upadku, które spowodują widoczne uszkodzenie chrząstki bez złamania kości podchrzstnej, dostosowując je do konkretnego szczepu, wieku i płci królika.

  1. Zbadaj palpacyjnie położenie rzepki od strony przedniej, aby określić pozycję stawu kolanowego, który znajduje się dystalnie w stosunku do rzepki. Za pomocą ostrza nr 15 wykonaj nacięcie o długości 3-4 cm wzdłuż tylnej powierzchni wyprostowanego kolana, od poziomu górnego bieguna rzepki w kierunku dystalnym.
  2. Przeprowadź rozwarstwienie tępe i ostre przez znajdującą się pod spodem powięź powierzchowną. Wypracuj przestrzeń między skórą przyśrodkowo a przyśrodkową częścią mięśnia brzuchatego łydki bocznie. W tej przestrzeni umieść samorozwierający się rozwieracz Weitlanera (patrz Tabela materiałów).
    1. Widoczna stanie się wtórna warstwa powięziowa, znajdująca się bezpośrednio nad tętnicą i żyłą saphunous. Wykonaj preparację bocznie od naczyń saphunous, odsuwając naczynia przyśrodkowo, a tylny kompleks mięśnia brzuchatego i płaszczkowatego bocznie.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie przeciąć tych naczyń. W przypadku uszkodzenia tętnicy należy zapewnić prawidłowe podwiązanie, ponieważ może dojść do pooperacyjnego wstrząsu krwotocznego.
  3. Wykonuj preparację dystalnie, aż zostanie zidentyfikowana mała, ruchoma kostka fabella nad tylną częścią kłykcia przyśrodkowego kości udowej. Wykonaj artrotomię, aby przesunąć fabellę górno-bocznie, odsłaniając leżący pod nią kłykcie przyśrodkowy kości udowej. Ostrożnie usuń tkanki miękkie poprzez rozwarstwienie tępe i ostre, aby odsłonić tylną powierzchnię kłykcia przyśrodkowego kości udowej. Użyj kleszczyka Freera i rozwieracza Cricket (patrz Tabela materiałów) do odsunięcia tkanek miękkich na tym poziomie.
  4. Utrzymując kłykcie odsłoniętym, wprowadź pin Steinmana o średnicy 0.062 inch (patrz Tabela materiałów) przez dystalną część kości udowej, zaczynając od górnej części kłykcia przyśrodkowego, centrując go w kierunku przednio-tylnym kłykcia przyśrodkowego, około 5 mm od tylnej powierzchni kłykcia.
    1. Wprowadź pin bocznie przez kość i skórę boczną, równolegle do powierzchni stawowej, używając akumulatorowego wkrętaka do pinów Steinmana. Palpacja nadkłykcia bocznego zapewni odpowiednią trajektorię pinu Steinmana.
  5. Usuń rozwieracze i zamknij skórę szwem Polysorb 3-0 (patrz Tabela materiałów) metodą szwu ciągłego. Przykryj nacięcie sterylną gazą.

4. Wpływ kłykcia kości udowej

  1. Usuń chustę spod operowanej kończyny i przymocuj pinu Steinmana do platformy udarowej o regulowanej i dostosowywalnej wysokości. Najpierw umieść regulowaną w wysokości dolną część urządzenia mocującego pin Steinmana pod pinem (Rysunek 2A2). Upewnij się, że drut jest równoległy do podłoża tej platformy, regulując wysokość śrub w razie potrzeby.
    1. Po upewnieniu się, że pin Steinmana jest równoległy do podłoża, umieść górną część platformy stabilizującej opartą na śrubach (Rysunek 2A3) na dolną, śrubową część elementu z regulacją wysokości. Należy upewnić się, że pin Steinmana jest mocno zabezpieczony, przykręcając górny pręt do dolnej, regulowanej wysokościowo części platformy utrzymującej piny (Rysunek 2A2).
  2. Po przymocowaniu pinu Steinmana do platformy, usuń szew i ponownie otwórz nacięcie. Odsłoń przyśrodkowy kłyk kości udowej za pomocą samopodtrzymujących się rozieraczy Weitlanera i rozieraczy typu cricket. Może być potrzebny dodatkowy rozieracz Freera do odsunięcia tkanek miękkich z drogi wprowadzenia końcówki impaktora (Rycina 2B).
  3. Przetrzyj wieżę spadkową zatwierdzonym środkiem dezynfekcyjnym. Przymocuj sterylną głowicę uderzeniową o średnicy 3 mm (Rycina 2A4) do wózka wieży spadkowej. Przesuń wieżę spadkową nad operowaną kończynę i ustaw jej podstawę (Rysunek 2A6) pod platformą uderzeniową (Rysunek 3A).
  4. Ostrożnie opuść impaktor (Rycina uzupełniająca 2, część 20, oraz Rysunek uzupełniający 13) na środek tylnej części przyśrodkowego nadkłykcia kości udowej. Należy upewnić się, że na drodze wprowadzania implantera nie znajdują się żadne tkanki miękkie.
    1. Przesuń królika lub wieżę w razie potrzeby, aby upewnić się, że głowica impaktora znajduje się w osi przyśrodkowej kłykci tylnych kości udowej (Rysunek 3BZa każdym razem, gdy królik jest przemieszczany lub zmiana jego pozycji następuje, należy ocenić pole operacyjne pod kątem ewentualnych naruszeń sterylności i w razie potrzeby ponownie wysterylizować ten obszar. 
  5. Po upewnieniu się, że trajektoria jest właściwa, należy przymocować wieżę do platformy za pomocą zacisków szybkozamykających (Rycina 2A5, patrz Tabela materiałów).
  6. Podaj jedną dawkę alfaxalonu dożylnie (0,5–0,7 mg/kg) na 5–10 min przed uderzeniem, aby uzyskać głębszą anestezję bez zwiększania stężenia anestetyku wziewnego.
    UWAGA: Brak odruchu mrugania, odruchu wycofania kończyny oraz odruchu małżowinki usznej świadczy o głębszym znieczuleniu. Głębsza anesthesia pomaga zapobiec ewentualnym reakcjom kończyn podczas umieszczania w aparaturze oraz w momencie uderzenia.
    OSTROŻNIE: Podanie alfaxalonu zbyt szybko może spowodować przejściową bezdech i hipoksję u królików, dlatego należy go podawać powoli w ciągu 1–2 min. W przypadku wystąpienia hipoksji należy zapewnić odpowiednie dotlenienie i przywrócenie funkcji życiowych przed kontynuacją procedury.
  7. Ustaw impaktor na wieży zrzutowej na żądanej wysokości nad przyśrodkowym kłykciem kości udowej. Dla obecnego zespołu wózka, wliczając łożyska, o masie 1,41 kg, wysokość ta wynosi 7 cm.
    UWAGA: Wysokość wieży zrzutowej została określona na podstawie badań pilotażowych na tkankach od zwłok. Wysokość ta spowodowała widoczne uszkodzenie chrząstki, ale nie doprowadziła do złamania kości podchrzęstnej u królików biorących udział w niniejszym badaniu.
  8. Kliknij w Start przycisk w oprogramowaniu do akwizycji danych LabVIEW (Uzupełniający plik z kodem 1) tuż przed zwolnieniem blokady wrzeciona (Rycina uzupełniająca 2, przedmiot nr 14), aby zwolnić wózek i pozwolić mu opaść pod wpływem siły grawitacji.
    UWAGA: Oprogramowanie do akwizycji danych będzie zbierać dane z ogniwa obciążnika (Rycina 1, 6) umieszczony pomiędzy impaktorem a wózkiem oraz akcelerometr (Rycina 1, 7) podczas uderzenia przy częstotliwości 100 kHz przy użyciu laptopa podłączonego do modułu akwizycji danych.
  9. Umieść plik txt wygenerowany przez oprogramowanie do akwizycji danych w tym samym folderze co kod Matlab do analizy danych (Uzupełniający plik z kodem 2) i uruchom kod analizy danych, aby przefiltrować surowe dane i obliczyć parametry wpływu.
  10. Należy zidentyfikować maksymalne obciążenie. Powiązany z nim punkt czasowy uznaje się za moment maksymalnej deformacji i zerowej prędkości.
    UWAGA: Kod do analizy danych przeanalizuje wszystkie pliki txt w folderze i przedstawi wyniki dla każdego z nich. Kod wyznaczy początek i koniec uderzenia na podstawie zmian w danych obciążenia w czasie. Dane z akcelerometru zostaną zintegrowane numerycznie w celu obliczenia prędkości, a następnie zintegrowane ponownie w celu obliczenia przemieszczenia. Kod do analizy danych obliczy numerycznie impuls, pracę oraz energię kinetyczną na podstawie następujących wzorów:
    Równanie impulsu, \( I = \int_{t_0}^{t_f} F \, dt \), wzór na schemacie do nauki fizyki.
    Wzór na obliczanie pracy: \( W = \int_{x_0}^{x_f} F dx \). Schemat równania matematycznego.
    Wzór na energię kinetyczną KE=1/2mVt²; koncepcja fizyczna, mechanika, obliczanie energii.
    gdzie F czy siła mierzona przez czujnik obciążenia, Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.0 i t0 stanowią przemieszczenie i czas w momencie rozpoczęcia uderzenia, a Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.i tf Są to przemieszczenie i czas w momencie zakończenia uderzenia. Szybkość obciążania zostanie obliczona numerycznie jako średnia z dσ/dt w fazie obciążenia podczas uderzenia. Szczytowe naprężenie zostanie obliczone poprzez podzielenie maksymalnego obciążenia przez powierzchnię styku głowicy uderzeniowej.
  11. Przeprowadzić wizualizację powierzchni chrząstki, aby ocenić, czy doszło do odpowiedniego uszkodzenia chrząstki (Rysunek 4A).

5. Zamknięcie pola operacyjnego

  1. Usuń wieżę operacyjną znad operowanej kończyny. Odstaw wszystkie użyte narzędzia chirurgiczne i zmień rękawiczki na nowe, sterylne.
    UWAGA: Ze względu na to, że wieża zrzutowa nie jest sterylna, wszystkie narzędzia użyte do momentu uderzenia należy obecnie uznać za zanieczyszczone.
  2. Ponownie załóż sterylną draperię na kończynę dolną i przygotuj niewykorzystane sterylne samorozwieracze.
  3. Ponownie odsłoń kłykieć przyśrodkowy kości udowej i dokładnie wypłucz pole operacyjne 50–60 ml jałowej soli fizjologicznej.
  4. Zamknąć torebkę tylną szwem Polysorb 5-0, a następnie zamknąć skórę szwem Monosorb 4-0 (patrz Tabela materiałów).
  5. Wstrzyknąć 2 ml lidokainy/bupiwakainy w celu miejscowego znieczulenia wokół nacięcia w sposób śródskórny.
  6. Usuń pin Steinmana za pomocą zestawu wkrętarki elektrycznej (patrz Tabela materiałów) poprzez oscylację, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek miękkich.
  7. Zaopatrzyć ranę nieprzylegającym opatrunkiem, a następnie zabezpieczyć go taśmą klejącą. Wykonać zdjęcie rentgenowskie operowanej kończyny, aby upewnić się, że nie doszło do złamania i że piny zostały umieszczone prawidłowo (Rycina 4B).

6. Opieka pooperacyjna

  1. Umieścić królika z powrotem w klatce i monitorować go na ogrzewanych matach do czasu wybudzenia z anestezji (~25 min).
  2. Kontynuować uważną obserwację królików przez kilka dni po operacji, aby upewnić się, że goją się prawidłowo i odzyskują sprawność ruchową. W celu profilaktyki przeciwbakteryjnej podawać enrofloksacynę (10 mg/kg) przez 2 dni po zabiegu. Podawać buprenorfinę SR jako lek przeciwbólowy (0,1 mg/kg) podskórnie co 2-3 dni po operacji oraz w razie potrzeby. Zamiast buprenorfiny można podać NLPZ, takie jak karprofen (4 mg/kg podskórnie codziennie), meloksykam (0,2 – 0,3 mg/kg podskórnie codziennie do 3 dni) lub ketoprofen (3 mg/kg podskórnie codziennie), 3-5 dni po operacji oraz w razie potrzeby.
    UWAGA: Udało nam się zapobiec pooperacyjnemu rozszewowi rany spowodowanemu lizaniem lub gryzieniem przez królika poprzez założenie noworodkowych spodni dla ludzi na kończyny tylne39. Jeśli królik przegryzie spodnie, można założyć kołnierz elżbietański (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec gryzieniu miejsca ncięcia.

7. Ocena histologiczna

  1. W 16. tygodniu po urazie pobrać kolana od uśpionych królików, utrwalić je w 10% neutralnym buforowanym formalinie przez 48 h, a następnie poddać zatopieniu w parafinie i pociąć na plastry o grubości 5 µm.
  2. Po deparafinizacji i rehydratacji zabarwić przekroje metodą safraniny O i fast green zgodnie ze standardowymi protokołami40,41.
  3. Wykonać na przekrojach test końcowego znakowania nukleotydów metodą TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), wykorzystując zestaw TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection zgodnie z instrukcją producenta, z przeciwbarwieniem hematoksyliną42 (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powodzenie tej procedury monitorowano bezpośrednio po uderzeniu poprzez wizualną ocenę wyrostka stawowego dokonaną przez chirurga (Rycina 4A) oraz za pomocą radiografii, aby upewnić się, że nie doszło do złamania (Rycina 4B). Istnieje ryzyko niepowodzenia uderzenia, co może prowadzić do śródoperacyjnego złamania wyrostka stawowego. Było to zazwyczaj spowodowane nieprawidłowym umieszczeniem gwoździa Steinmana (Rycina 5). W tym modelu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten zabieg chirurgiczny ma na celu wygenerowanie konsekwentnego uszkodzenia chrząstki na powierzchni nośnej przyśrodkowego kłykcia kości udowej królika w modelu PTOA. Zaletą tego zabiegu jest to, że dostęp tylny do kolana pozwala na bezpośrednią wizualizację całego tylnego przyśrodkowego kłykcia kości udowej i może być wykonany w około 37 minut (tab. 2). Należy również zauważyć, że jest to otwarty model urazu i może prowadzić do ostrych zmian zapalnych wykraczających poza samo uderzenie z powodu potencja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Roman Natoli wygłasza wykłady dla AO Trauma North America, jest redaktorem działu Current Osteoporosis Reports i otrzymał tantiemy za podręczniki od Morgana i Claypoola. Todd McKinley otrzymuje tantiemy od Innomed. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez DoD Peer Reviewed Medical Research Program - Investigator-Initiated Research Award W81XWH-20-1-0304 od U.S. ARMY MEDICAL RESEARCH ACQUISITION ACTIVITY, przez NIH NIAMS R01AR076477 oraz przez Comprehensive Musculoskeletal T32 Training Program od NIH (AR065971) oraz przez NIH NIAMS Grant R01 AR069657. Autorzy chcieliby podziękować Kevinowi Carrowi za udostępnienie swojej wiedzy w zakresie obróbki skrawaniem i produkcji w tym projekcie, a także Drew Brownowi i Indiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Core za pomoc w histologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Śruba z płaskimMcMaster-Carr92210A194Śruba z sześciokątnym ze stali nierdzewnej, ostrza skalpela 8-32, 1/2"
#15McKesson1029066Skalpel McKesson nr 15 ze stali nierdzewnej / tworzywa sztucznego Klasyczny uchwyt Sterylny jednorazowy
pręt gwintowany 1/2"-20McMaster-Carr99065A120pręt gwintowany 1/2"-20
strzykawka10 mlMcKesson1031801Do nawadniania; Strzykawka ogólnego przeznaczenia McKesson 10 ml Blister Pack Luer Lock Tip Bez bezpieczeństwa
Strzykawka 3 mlMcKesson1031804Do wstrzykiwań lidokainy/bupiwakainy; Strzykawka ogólnego przeznaczenia McKesson 3 ml blister z końcówką Luer Lock bez zabezpieczenia.
3-0 polysorbEthiconJ332H3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 koła, 26 mm, stożkowy
4-0 monosorbEthiconZ397H4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 koła, 19mm, krawędź tnąca
5-0 polysorbMed Vet InternationalNC9335902Med Vet International 5-0 ETIKOMETR POWLEKANY VICRYL C-3
AkcelerometrKistler8743A5Akcelerometr
Adson-Browns KleszczeNarzędzia precyzyjne World500177Kleszcze Adson-Brown, 12 cm, proste, szczęki TC, 7 x 7 zębów
AlfaxaloneJurox49480-002-01Alfaxan Multidose firmy Jurox : 10 mg/ml
BuprenorphinePar Pharmaceuticals42023-0179-05Buprenorfina HCL do wstrzykiwań: 0,3 mg/ml
Butorfanol Zoetis54771-2033Winian butorfanolu  10 mg / ml firmy Zoetis
Chlorheksydyna do szorowania rąkBD371073BD E-Z Scrub 107 Chirurgiczna szczotka/gąbka do szorowania, 4% CHG, czerwona
tuleja zaciskowaSTRYKER14023Stryker 4100-62 drut Tuleja zaciskowa 0,28-0,71'
' Rękojeść wkrętarki akumulatorowejSTRYKEROR-S4300Stryker 4300 CD3 Sterownik bezprzewodowy 3 rękojeść
Zwijacze do krykietaNovosurgicalG3510 212x Heiss (Holzheimer) Retraktor krzyżowy
Nożyczki dyssektoroweJorvet labsJ0662Aesculap AG, Metzenbaum, Nożyczki, Proste 5 3/4 i Prime;
Obroża elżbietańskaElizaSoft62054ElizaSoft Elżbietańska obroża regeneracyjna
EnrofloksacynaNiestandardowe lekiEnrofloksacyna zmieszana z maścią do oczu Custom Meds
Pivetal 46066-753-55Pivetal Articifical Tears - ostatnio wycofany
Kołnierz wałumontowany na twarzy McMaster-Carr5631T11Kołnierz wału montowany na twarzy
Fast greenMillipore SigmaF7258Fast green
FreerJorvet labsJ0226QFreer winda
Śruba z walcowym -1McMaster-Carr91251A197Śruba z walcowym ze stali stopowej oksydowanej na czarno, 8-32, śruba z 3/4"
-2McMaster-Carr92196A194Śruba z gniazdowym ze stali nierdzewnej, 8-32, śruba z 1/2"
-3McMaster-Carr92196A146Śruba z gniazdowym ze stali nierdzewnej, 8-32, śruba z 1/2"
-4McMaster-Carr92196A151Śruba z gniazdowym ze stali nierdzewnej, 6-32, 3/4"
Roztwór hematoksyliny, Gill nr 1Millipore SigmaGHS132-1LRoztwór hematoksynyliny, skrzela nr 1
Nakrętka sześciokątnaMcMaster-Carr91841A007Nakrętka sześciokątna ze stali nierdzewnej, 6-32
Docisk dociskowyMcMaster-Carr5126A71Docisk dociskowy
Urządzenie udaroweniedotyczy nie dotyczywykonane na zamówienie
Platforma udarowan/an/awykonane na zamówienie
K-wiresJorvet LabsJ0250AJorVet Śródszpikowe szpilki Steinmana, trokar-trokar 1/16" x 7"
Lab ViewNational Instrumentsn/an/d
Ogniwo obciążnikoweKistler9712B5000Ogniwo obciążnikowe
MATLABThe MathWorks Inc.niedotyczy
MikroskopLeicaDMi-8Mikroskop Leica DMi8 z oprogramowaniem LAS-X
MidazolamAlmaject72611-749-10Wtrysk chlorowodorku midazolamu: 5 mg / ml przez Almaject
ograniczniki głębokości frezarkiMcMaster-Carr2949A71Ograniczniki głębokości frezarki zaciskowej
Mobilne ramię CPhilips718095BV  Pulsera, Mobilne ramię C
Łożysko kulkowe linioweMcMaster-Carr9338T7Łożysko kulkowe liniowe
A2Z ScilabA2ZTCIN39TC Webster Uchwyt igły Szczęki gładkie 5",
Premium PentobarbitalVortech0298-9373-68Pentobarbital 390 mg/ml firmy Vortech
Safranin OMillipore SigmaHT90432Safranin O
Mały akumulatorSTRYKERNS0140366212 Mały akumulator - 9,6 V
Pręt stalowy, 2'McMaster-Carr89535K25Pręt stalowy, 2'
Sterylna sól fizjologicznaICU Medical6139-22Butelki z roztworem AquaLite, 250 ml
Ładowarka Stryker 6110-120 System 6STRYKEROR-S6110-120
Rękawice chirurgiczneRękawica chirurgiczna McKesson 1044729 McKesson Perry Rozmiar 6.5 Sterylna para lateksu o przedłużonej długości mankietu Gładka brązowa Nie zatwierdzona przez chemię
Fartuch chirurgicznyMcKesson1104452Niewzmocniony fartuch chirurgiczny z ręcznikiem McKesson Duże niebieskie sterylne
jednorazowe nożyczki do szwówNożyczki Jorvet LabsJ0910SASuper Cut, Mayo, proste, 5 1/2 i prime;
Zestaw do barwienia TUNELABP BioscienceA049TUNEL Zestaw do wykrywania apoptozy chromogennej
Zwijacze WeitlanerNarzędzia do nauki17012-112x Retraktory Weitlaner-Locktite
Rękawice chirurgiczne AAMI Level 3 precyzyjnej

Bibliografia

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of posttraumatic osteoarthritis. Journal of Athletic Training. 52 (6), 491-496 (2017).
  2. Pasquale, M. K., et al. Healthcare Utilization and costs of knee or hip replacements versus pain-relief injections. American Health Drug Benefits. 8 (7), 384-394 (2015).
  3. Yao, J. J., et al. Direct Inpatient medical costs of operative treatment of periprosthetic hip and knee infections are twofold higher than those of aseptic revisions. Journal of Bone and Joint Surgery America. 103 (4), 312-318 (2021).
  4. Anatone, A. J., et al. Decreased implant survival is associated with younger patients undergoing total knee arthroplasty. HSS Journal. 18 (2), 290-296 (2022).
  5. Stone, B., Nugent, M., Young, S. W., Frampton, C., Hooper, G. J. The lifetime risk of revision following total knee arthroplasty : a New Zealand Joint Registry study. The Bone and Joint Journal. 104-B (2), 235-241 (2022).
  6. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044(2017).
  7. Robinson, W. H., et al. Low-grade inflammation as a key mediator of the pathogenesis of osteoarthritis. Nature Review Rheumatology. 12 (10), 580-592 (2016).
  8. Perez-Garcia, S., et al. Profile of matrix-remodeling proteinases in osteoarthritis: impact of fibronectin. Cells. 9 (1), 40(2019).
  9. Hashimoto, S., Ochs, R. L., Komiya, S., Lotz, M. Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritis. Arthritis Rheumatology. 41 (9), 1632-1638 (1998).
  10. Natoli, R. M., Athanasiou, K. A. Traumatic loading of articular cartilage: Mechanical and biological responses and post-injury treatment. Biorheology. 46 (6), 451-485 (2009).
  11. Coleman, M. C., Brouillette, M. J., Andresen, N. S., Oberley-Deegan, R. E., Martin, J. M. Differential effects of superoxide dismutase mimetics after mechanical overload of articular cartilage. Antioxidants (Basel). 6 (4), 98(2017).
  12. Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
  13. Wolff, K. J., et al. Mechanical stress and ATP synthesis are coupled by mitochondrial oxidants in articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 191-196 (2013).
  14. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
  15. Coleman, M. C., Ramakrishnan, P. S., Brouillette, M. J., Martin, J. A. Injurious loading of articular cartilage compromises chondrocyte respiratory function. Arthritis Rheumatology. 68 (3), 662-671 (2016).
  16. Bobinac, D., Spanjol, J., Zoricic, S., Maric, I. Changes in articular cartilage and subchondral bone histomorphometry in osteoarthritic knee joints in humans. Bone. 32 (3), 284-290 (2003).
  17. Coleman, M. C., et al. Targeting mitochondrial responses to intra-articular fracture to prevent posttraumatic osteoarthritis. Science Translational Medicine. 10 (427), eaan5372(2018).
  18. Heraud, F., Heraud, A., Harmand, M. F. Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Annals of Rheumatological Diseases. 59 (12), 959-965 (2000).
  19. Narez, G. E., Fischenich, K. M., Donahue, T. L. H. Experimental animal models of post-traumatic osteoarthritis of the knee. Orthopedic Reviews (Pavia). 12 (2), 8448(2020).
  20. Fischenich, K. M., et al. Chronic changes in the articular cartilage and meniscus following traumatic impact to the lapine knee. Journal of Biomechanics. 48 (2), 246-253 (2015).
  21. Isaac, D. I., Meyer, E. G., Kopke, K. S., Haut, R. C. Chronic changes in the rabbit tibial plateau following blunt trauma to the tibiofemoral joint. Journal of Biomechanics. 43 (9), 1682-1688 (2010).
  22. Wei, F., et al. Post-traumatic osteoarthritis in rabbits following traumatic injury and surgical reconstruction of the knee. Annals of Biomedical Engineering. 50 (2), 169-182 (2022).
  23. Terracciano, R., et al. Quantitative high-resolution 7T MRI to assess longitudinal changes in articular cartilage after anterior cruciate ligament injury in a rabbit model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (2), 100259(2022).
  24. Huang, K., Cai, H. L., Zhang, P. L., Wu, L. D. Comparison between two rabbit models of posttraumatic osteoarthritis: A longitudinal tear in the medial meniscus and anterior cruciate ligament transection. Journal of Orthopaedic Research. 38 (12), 2721-2730 (2020).
  25. Sun, Z. B., Peng, H. Experimental Study on the prevention of posttraumatic osteoarthritis in the rabbit knee using a hinged external fixator in combination with exercises. Journal of Investigative Surgery. 32 (6), 552-559 (2019).
  26. Gardner, M. J., et al. The incidence of soft tissue injury in operative tibial plateau fractures: a magnetic resonance imaging analysis of 103 patients. Journal of Orthopedic Trauma. 19 (2), 79-84 (2005).
  27. Dilley, J. E. B. M. A., Roman, N., McKinley, T. O., Sankar, U. Post-traumatic osteoarthritis: A review of pathogenic mechanisms and novel targets for mitigation. Bone Reports. 18, 101658(2023).
  28. Seol, D., et al. Effects of knockout of the receptor for advanced glycation end-products on bone mineral density and synovitis in mice with intra-articular fractures. Journal of Orthopedic Research. 36 (9), 2439-2449 (2018).
  29. Furman, B. D., et al. Joint degeneration following closed intraarticular fracture in the mouse knee: a model of posttraumatic arthritis. Journal of Orthopedic Research. 25 (5), 578-592 (2007).
  30. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 Suppl 3, S17-S23 (2010).
  31. McCoy, A. M. Animal models of osteoarthritis: comparisons and key considerations. Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).
  32. Fening, S. D., Jones, M. H., Moutzouros, V., Downs, B., Miniaci, A. Method for Delivering a controlled impact to articular cartilage in the rabbit knee. Cartilage. 1 (3), 211-216 (2010).
  33. Leucht, F., et al. Development of a new biomechanically defined single impact rabbit cartilage trauma model for in vivo-studies. Journal of Investigative Surgery. 25 (4), 235-241 (2012).
  34. Vrahas, M. S., Smith, G. A., Rosler, D. M., Baratta, R. V. Method to impact in vivo rabbit femoral cartilage with blows of quantifiable stress. Journal of Orthopedic Research. 15 (2), 314-317 (1997).
  35. Borrelli, J. Jr, Burns, M. E., Ricci, W. M., Silva, M. J. A method for delivering variable impact stresses to the articular cartilage of rabbit knees. Journal of Orthopedic Trauma. 16 (3), 182-188 (2002).
  36. Milentijevic, D., Rubel, I. F., Liew, A. S., Helfet, D. L., Torzilli, P. A. An in vivo rabbit model for cartilage trauma: a preliminary study of the influence of impact stress magnitude on chondrocyte death and matrix damage. Journal of Orthopedic Trauma. 19 (7), 466-473 (2005).
  37. Alexander, P. G., et al. An In vivo lapine model for impact-induced injury and osteoarthritic degeneration of articular cartilage. Cartilage. 3 (4), 323-333 (2012).
  38. Bonitsky, C. M., et al. Genipin crosslinking decreases the mechanical wear and biochemical degradation of impacted cartilage in vitro. Journal of Orthopedic Research. 35 (3), 558-565 (2017).
  39. Bartley, K. A., Johnson, C. H. Human Infant pants for postoperative protection during social housing of new zealand white rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 58 (4), 510-516 (2019).
  40. Lillie, R. D., Fullmer, H. M. Histopathologic technic and practical histochemistry. , 4th edn, Blakiston Division, McGraw-Hill. (1976).
  41. Armed Forces Institute of Pathology: Laboratory Methods in Histotechnology. Washington DC: American Registry of Pathology. Prophet, E., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , (1992).
  42. Dilley, J. E., et al. CAMKK2 is upregulated in primary human osteoarthritis and its inhibition protects against chondrocyte apoptosis. Osteoarthritis and Cartilage. 31 (7), 908-918 (2023).
  43. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  44. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  45. Borrelli, J., Zaegel, M. A., Martinez, M. D., Silva, M. J. Diminished cartilage creep properties and increased trabecular bone density following a single, sub-fracture impact of the rabbit femoral condyle. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1307-1314 (2010).
  46. Borrelli, J., Silva, M. J., Zaegel, M. A., Franz, C., Sandell, L. J. Single high-energy impact load causes posttraumatic OA in young rabbits via a decrease in cellular metabolism. Journal of Orthopedic Research. 27 (3), 347-352 (2009).
  47. Borrelli, J. Jr, Zhu, Y., Burns, M., Sandell, L., Silva, M. J. Cartilage tolerates single impact loads of as much as half the joint fracture threshold. Clinical Orthopedics and Related Research. 426, 266-273 (2004).
  48. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 activity is involved in the acute injury response of chondrocytes to ex vivo injurious mechanical overload. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6521(2023).
  49. Mevel, E., et al. Systemic inhibition or global deletion of CaMKK2 protects against post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (1), 124-136 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kr liczy model choroby zwyrodnieniowej staw wuszkodzenie chrz stki stawowejuderzenie w k ykie ko ci udowejtechnika wie y zrzutowejapoptoza chondrocyt wocena wed ug skali OARSImodel urazu stawuprotok chirurgii zwierz t laboratoryjnych
Powtarzalny model wpływu chrząstki w celu wygenerowania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów u królika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.