Wścieklizna jest ostrym, postępującym, wirusowym zapaleniem mózgu. Czynnik etiologiczny w kształcie kuli należy do rodzaju Lyssavirus, z których co najmniej 17 powoduje wściekliznę na całym świecie (z wyjątkiem Antarktydy). Wirus wścieklizny jest najważniejszym członkiem tych różnorodnych wirusów RNA. Wszystkie ssaki są podatne, a nietoperze i mezomięsożercy są znaczącymi rezerwuarami. Do przeniesienia dochodzi przede wszystkim po ukąszeniu. Jako kwintesencja czynników neurotropowych, wiriony rozwijają się dośrodkowo po osadzaniu się przez aksony z obwodu do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w celu replikacji, a następnie do gruczołów ślinowych i są wydalane do śliny. Na całym świecie psy są odpowiedzialne za największą liczbę zgonów ludzi z powodu wścieklizny, powodując dziesiątki tysięcy zgonów rocznie. Biorąc pod uwagę wymiary odzwierzęce, metody laboratoryjne są niezbędne w badaniach stosowanych i powiadamianiu o chorobach, zapobieganiu i kontroli u ludzi, zwierząt domowych i dzikich zwierząt. Celem tego zbioru dziewięciu powiązanych ze sobą artykułów jest przedstawienie metod zapewniających introspekcję występowania, wykrywania, patobiologii, epidemiologii, leczenia i doskonalenia leków biologicznych.
Jak ocenia się wściekliznę? Wścieklizna powinna być chorobą podlegającą obowiązkowi zgłoszenia, przy odpowiednim gromadzeniu, analizie i epidemiologicznej interpretacji danych. Obecnie większość przypadków jest zgłaszana w wyniku pasywnego nadzoru, opartego na zwierzętach, które narażają ludzi. Chociaż może wydawać się dość proste, aby wyobrazić sobie bezpieczne schwytanie, unieruchomienie, uspokojenie i eutanazję podejrzanego klinicznie (tj. gryzącego psa w celu zdiagnozowania wścieklizny), nie jest to tak łatwe dla niektórych dzikich zwierząt. Na przykład Tajwan był obszarem uważanym za "wolny" od wścieklizny, co pierwotnie opierało się na szeroko zakrojonym nadzorze nad zwierzętami domowymi. Jednak uznając znaczenie innych rezerwuarów zwierzęcych, badacze na wyspie zwrócili uwagę na dziką przyrodę. Jak opisują Hsu i wsp., celowe zbieranie konających i martwych nietoperzy daje możliwość wykrycia unikalnych gatunków lyssawirusa na Tajwanie1. Wysiłki te poszerzyły zakres taksonomiczny tego rodzaju wirusa i zapewniły rozsądny schemat dla innych ocen w Azji.
Jakie tkanki są potrzebne do diagnozy lyssawirusa? Oprócz opracowania odpowiednich metod nadzoru i prawidłowej identyfikacji gatunków, bezpieczny i odpowiedni dobór tkanek ma zasadnicze znaczenie dla czułej i swoistej diagnozy wścieklizny. OdXIX wieku ośrodkowy układ nerwowy (OUN) był ceniony jako tkanka pierwotna. Zwierzęta poddano eutanazji, ich zwłoki wysłano do laboratorium, czaszki otworzono, usunięto mózgi, a części zbadano pod mikroskopem pod kątem inkluzji wirusowych. Jednak transport całych zwierząt nie jest praktyczny, szczególnie w przypadku ssaków o dużej budowie, takich jak zwierzęta gospodarskie. Co więcej, nie wszystkie obszary mózgu są jednakowo przydatne w diagnozie. Jarvis i wsp. opisują bezpieczne i praktyczne metody sekcji zwłok zarówno małych, jak i dużych ssaków, które minimalizują ryzyko narażenia i skracają czas przetwarzania2. Stosowanie takich zaleceń dotyczących bezpieczeństwa biologicznego oraz koncentracja na pniu mózgu i móżdżku poprawią praktyki nowoczesnego laboratoryjnego nadzoru nad wścieklizną zwierząt.
Jakie opcje są używane do wykrywania antygenu wirusowego? Do rutynowej diagnostyki lizsywirusa od połowyXX wieku stosuje się test na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do obserwacji wtrąceń wirusa w tkance OUN. Chociaż test DFA jest bardzo czuły i specyficzny, wymaga mikroskopu fluorescencyjnego i wykorzystuje aceton jako utrwalacz tkankowy. Patrick i wsp. donoszą o zastosowaniu bezpośredniego, szybkiego testu immunohistochemicznego (DRIT), który opiera się na pobraniu pnia mózgu, utrwaleniu formaliny w wyciskach tkankowych, zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych sprzężonych z biotyną oraz wykryciu inkluzji wirusa za pomocą mikroskopii świetlnej w czasie krótszym niż 1 godzina3. Drit ma podobną czułość i specyficzność jak test DFA i nadaje się do zdecentralizowanego, wzmocnionego nadzoru laboratoryjnego w warunkach polowych. W przypadku ustawień o ograniczonych zasobach liniowy test przepływu (LFA) jest kolejną metodą szybkiej diagnozy, która wymaga minimalnej wiedzy technicznej, jak donoszą Mauti i wsp. Pozytywne paski testowe z terenu można wysłać do centralnego laboratorium w celu potwierdzenia4.
Czy oprócz wykrywania antygenu inne metody są odpowiednie do diagnozowania lyssawirusa? Testy DFA, drit i LFA są przydatne do wykrywania antygenów wirusowych w pośmiertnych tkankach OUN. Jednak tkanki mózgowe mogą ulegać rozkładowi. Co więcej, w podejrzanych przypadkach u ludzi, testy antemortemowe są bardziej pożądane i mogą obejmować alternatywne próbki kliniczne, takie jak płyn mózgowo-rdzeniowy. W związku z tym testy molekularne są bardzo przydatne do wykrywania niewielkich ilości wirusowych kwasów nukleinowych. Marston i wsp. oraz Wang i wsp. opisują odpowiednio technikę reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym i zagnieżdżoną, która jest szybka, czuła i specyficzna 5,6. Tak staranna dbałość o szczegóły w celu zminimalizowania zanieczyszczenia próbki i właściwy projekt startera umożliwiają pierwotną diagnozę w całym spektrum rozbieżnych lyssawirusów.
Czy po zdiagnozowaniu konwencjonalna mikroskopia jest wystarczająca do uzyskania nowoczesnych informacji na temat patobiologii wirusa lyssa? Stosowanie samych dwuwymiarowych metod mikroskopowych może skutkować brakiem krytycznych elementów in vivo w kontekście i złożoności. Jednak przy użyciu obiektywów o dużej odległości swobodnej pracy, tkanki zakażone wirusem można obrazować za pomocą konwencjonalnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej w wysokich rozdzielczościach, zgodnie z opisem Zaecka i wsp., aby zobrazować rozmieszczenie patogenów i lepiej docenić drobne szczegóły patogenezy wirusa, rozprzestrzeniania się, tropizmu i neuroinwazji7.
Czy istnieją alternatywy dla pomiaru siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie? Obecne metody pomiaru siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie wymagają dużej liczby gryzoni laboratoryjnych. Jednak koszty, przedziały ufności i kwestie związane z dobrostanem wymagają alternatywy. Glikoproteina wirusa wścieklizny wywołuje przeciwciała neutralizujące wirusa po szczepieniu. Jak poinformowali Jallet i Tordo, test ELISA in vitro może być stosowany zamiast testów ELISA na zwierzętach w celu zmierzenia względnej zawartości szczepionek przeciwko wirusowi wścieklizny, przy użyciu wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych8.
Czy można wnioskować o doustnym spożyciu szczepionki przez dzikie zwierzęta za pomocą biomarkerów? Oprócz szczepień pozajelitowych ludzi i zwierząt domowych, doustne szczepienia dzikich mezomięsożerców funkcjonują od lat siedemdziesiątych XX wieku. Oprócz pomiaru immunogenności szczepionki lub wynikającej z niej skuteczności w populacjach lisów, szopów, itp. poprzez wykrywanie przypadków, biomarkery mogą być wykorzystywane do wnioskowania o kontakcie i konsumpcji przynęt zawierających szczepionkę. Historycznie rzecz biorąc, wykrywanie wbudowanej tetracykliny w przynętach odbywało się w kościach lub zębach zwierząt. Alternatywą dla pobierania takich twardych tkanek jest pomiar serologiczny innego biomarkera, takiego jak kwas jofenoksynowy. Berentsen i in. donoszą o analizach takich pochodnych w surowicy mangust, ważnym naturalnym rezerwuarze w Azji, który został wprowadzony do regionu Karaibów9. Po spożyciu przynęty zawierającej ten biomarker przez mangusty żyjące w niewoli, wyekstrahowali kwasy jofenoksynowe do acetonitrylu i przeanalizowali surowice zwierzęce za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Odpowiednie oznakowanie wykryto przez kilka tygodni po spożyciu przynęty, a takie pochodne mogą być odpowiednie do oceny terenowej przyjmowania przynęt zawierających szczepionkę u zwierząt żyjących na wolności.
Częściowo ze względu na trwającą pandemię COVID-19 przewiduje się ulepszone metody wirusologiczne w zakresie wzmocnionego nadzoru nad wirusem lyssa, odkrywania patogenów, diagnozy potwierdzającej i charakterystyki wariantów. Czytanie o różnych technikach w recenzowanej literaturze jest zazwyczaj pierwszym krokiem dla zainteresowanej osoby. Jednak bezpośrednia obserwacja sekwencji kroków i wysłuchanie kontekstu od doświadczonego operatora usuwa niuanse i błędną interpretację. Obecne i przyszłe protokoły laboratoryjne i terenowe związane z wścieklizną, zgodnie z zaleceniami OIE i WHO, mogą skorzystać z dodatkowych zbiorów metod wizualnych, aby pomóc nowym badaczom, zwłaszcza w krajach rozwijających się.