Method Article

Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

DOI:

10.3791/64454

⸱

October 10th, 2022

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano prostą i skalowalną metodę oceny funkcjonalnego znaczenia wariantów missense w Ube3a, genie, którego utrata i zysk funkcji są związane zarówno z zespołem Angelmana, jak i zaburzeniem ze spektrum autyzmu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwiększone wykorzystanie sekwencjonowania w medycynie zidentyfikowało miliony wariantów kodujących w ludzkim genomie. Wiele z tych wariantów występuje w genach związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi, ale znaczenie funkcjonalne zdecydowanej większości wariantów pozostaje nieznane. Niniejszy protokół opisuje badanie wariantów Ube3a, genu kodującego ligazę ubikwityny E3 związaną zarówno z autyzmem, jak i zespołem Angelmana. Duplikacja lub potrojenie genu Ube3a jest silnie związane z autyzmem, podczas gdy jego delecja powoduje zespół Angelmana. W związku z tym zrozumienie walencji zmian w aktywności białka UBE3A jest ważne dla wyników klinicznych. W tym miejscu opisano szybką, opartą na komórkach metodę, która łączy warianty Ube3a z reporterem ścieżki Wnt. Ten prosty test jest skalowalny i może być wykorzystany do określenia wartościowości i wielkości zmian aktywności w dowolnym wariancie Ube3a. Co więcej, łatwość tej metody pozwala na generowanie wielu informacji o strukturze i funkcji, które można wykorzystać do uzyskania głębokiego wglądu w mechanizmy enzymatyczne UBE3A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie osiągnięcia technologiczne sprawiły, że sekwencjonowanie egzomu i genomów stało się rutyną w warunkach klinicznych1,2. Doprowadziło to do odkrycia dużej liczby wariantów genetycznych, w tym milionów wariantów missense, które zazwyczaj zmieniają jeden aminokwas w białku. Zrozumienie funkcjonalnego znaczenia tych wariantów pozostaje wyzwaniem, a tylko niewielka część (~2%) znanych wariantów missense ma kliniczną interpretację1,3.

Doskonałym przykładem tego problemu jest Ube3a, gen kodujący ligazę ubikwityny E3, która kieruje się do degradacji białek substratowych4. Ube3a znajduje się w chromosomie 15q11-13 i ulega ekspresji wyłącznie z allelu odziedziczonego po matce5,6,7. Obserwacje z zakresu genetyki chorób silnie sugerują, że niewystarczająca lub nadmierna aktywność enzymu UBE3A powoduje wyraźne zaburzenia neurorozwojowe. Delecja matczynego chromosomu 15q11-13 powoduje zespół Angelmana (AS)8, zaburzenie charakteryzujące się ciężką niepełnosprawnością intelektualną, upośledzeniem motorycznym, drgawkami, radosnym zachowaniem z częstym uśmiechaniem się i dysmorficznymi rysami twarzy8,9,10. Natomiast duplikacja lub potrojenie chromosomu matki 15q11-13 powoduje zespół Dup15q, niejednorodny stan uznawany za jedną z najbardziej rozpowszechnionych syndromicznych form autyzmu11,12,13. Ponadto w Ube3a zidentyfikowano setki wariantów missense, z których większość jest uważana za warianty o niepewnym znaczeniu (VUS), ponieważ ich znaczenie funkcjonalne i kliniczne jest nieznane. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowaniem metod, które mogą empirycznie ocenić warianty Ube3a w celu ustalenia, czy przyczyniają się one do choroby neurorozwojowej.

Enzym UBE3A należy do rodziny domen HECT (homologicznych do E6-AP C-endus) ligaz ubikwityny E3, z których wszystkie posiadają tytułową domenę HECT, która zawiera biochemiczną maszynerię niezbędną do przyjęcia aktywowanej ubikwityny z enzymów E2 i przeniesienia jej do białek substratowych14. Historycznie rzecz biorąc, charakterystyka enzymów E3 opierała się na odtworzonych systemach in vitro, które wymagają zestawu oczyszczonych białek4,15,16. Takie metody są powolne i pracochłonne oraz nie nadają się do oceny aktywności dużej liczby wariantów. W poprzednich pracach zidentyfikowano, że UBE3A aktywuje szlak Wnt w HEK293T komórkach poprzez modulację funkcji proteasomu w celu spowolnienia degradacji β-kateniny17. Ten wgląd pozwala na wykorzystanie reporterów szlaku Wnt jako wydajnej i szybkiej metody identyfikacji wariantów zarówno straty, jak i wzmocnienia funkcji Ube3a18. Poniższy protokół szczegółowo opisuje metodę generowania wariantów Ube3a, a także reporter oparty na lucyferazie do oceny zmian w aktywności wariantów Ube3a.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie mutagenezy w celu wygenerowania wariantów Ube3a

  1. Sklonuj wszystkie warianty Ube3a do plazmidu pCIG2 (Figura 1A), wektora bicystronicznego, który zawiera promotor β aktyny kurczaka i wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) dla wyrażenia EGFP19. Pełnowymiarowe konstrukcje Ube3a zawierają N-końcową sekwencję znacznika Myc i są klonowane do pCIG2 przy użyciu 5' miejsca SacI i 3' XmaI. Ponadto do subklonowania fragmentów wykorzystuje się również naturalnie występujące miejsca EcoRI, EcoRV i PstI w sekwencji kodującej Ube3a.
    UWAGA: Zanonimizowane warianty Ube3a można uzyskać w literaturze oraz w publicznie dostępnych repozytoriach, takich jak baza danych ClinVar1. Dodatkowe niezgłoszone warianty można uzyskać poprzez osobistą komunikację z ośrodkami medycznymi.
  2. Użyj dostosowanej dwuetapowej metody mutagenezy megaprimerów20, aby wprowadzić mutacje do ramki odczytu Ube3a. W pierwszym kroku zaprojektuj mutagenny oligonukleotyd, który zawiera pożądaną mutację (przykładem pokazanym w tym protokole jest wygenerowanie wariantu UBE3A Q588E) otoczonego przez co najmniej 30 par zasad (bp) o homologii 5′ i 3′ do mutacji (Rysunek 1B i Tabela 1).
  3. Użyj mutagennego oligonukleotydu wraz z komplementarnym oligonukleotydem do pierwszej rundy PCR, aby wygenerować megaprimer o masie 200-400 pz zawierający mutację (Rysunek 1C; Tabela 2 i Tabela 3). Wykorzystać całe 50 μl objętości reakcji PCR do elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu 1% żelu, a następnie oczyszczenia żelem (tabela materiałów). Eluować produkt PCR w 30 μl dejonizowanegoH2O(diH2O) do użycia w drugiej rundzie PCR etap poniżej.
  4. Skonfiguruj drugą rundę PCR zgodnie z opisem ( Rysunek 1C; Tabela 2 i Tabela 3). Ten krok wygeneruje większe fragmenty DNA (zwykle o długości ~1-1,5 kb) zawierające mutację i końcowe miejsca restrykcyjne odpowiednie do podklonowania (Rysunek 1C).
  5. Po zakończeniu reakcji PCR należy oczyścić otrzymany produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (tabela materiałów). Eluować w 30 μl i trawić cały oczyszczony produkt i konstrukt pCIG2 Ube3a WT z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (przykład pokazuje trawienie za pomocą EcoRI i XmaI).
  6. Po 2 godzinach trawienia w temperaturze 37 °C rozpuścić produkty trawienia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (1% żelu) i oczyścić odpowiednie produkty żelem. Ustaw ligacje zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów), przekształć produkty ligacji w szczep bakteryjny DH10B (Tabela materiałów), a następnie płytkę z wyborem ampicyliny (100 μg/ml).
  7. Następnego dnia wybierz od dwóch do czterech kolonii, aby zaszczepić 3 ml kultur zawierających bulion Luria (LB) i 100 μg/ml ampicyliny. Pozostawić kultury do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze orbitalnym z wytrząsaniem (225 obr./min).
  8. Następnego dnia użyj 1-1,5 ml kultury bakteryjnej do miniprzygotowania plazmidowego DNA (tabela materiałów). Zachowaj pozostałą kulturę, umieszczając ją w temperaturze 4 °C. Przesiej minipreparowane plazmidy za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu oligonukleotydu, który wiąże ~ 200 pz od pożądanej mutacji.
  9. Użyć kultur bakteryjnych zapisanych w temperaturze 4 °C do ponownego zaszczepienia 50 ml kultur w celu przygotowania odpowiedniego plazmidu (tabela materiałów). W pełni zsekwencjonuj sekwencję kodującą Ube3a, aby potwierdzić poprawną sekwencję DNA.
  10. Utwórz zapasy robocze plazmidów wariantu Ube3a, a także reportera aktywowanego β-kateniną (BAR)21, lucyferazy TK-Renilla, martwego ligazy Ube3a (mutacja UBE3A C820A) i pustego wektora pCIG2 o stężeniu 100 ng / μL przy użyciu sterylnego H2O dla kolejnych etapów transfekcji.

2. Przygotowanie i transfekcja ludzkich embrionalnych komórek nerki 293T (HEK293T)

  1. Wykonaj testy na HEK293T komórkach wyhodowanych w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, wstępnie uzupełnionej glutaminą, 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykiem przeciwgrzybiczym, jak opisano wcześniej17. Hodować komórki w sterylnym, wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego, najpierw umieść zawieszone HEK293T komórki na 96-dołkowych płytkach płaskodennych poddanych działaniu kultur tkankowych o gęstości 2,2 × 104 komórek na basenik w 100 μl pożywki hodowlanej i pozwól im rosnąć przez noc.
  3. Drugiego dnia należy przetransfekować komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą plazmidów reporterowych lucyferazy świetlików i Renilla (Tabela 4) oraz plazmidów Ube3a w trzech egzemplarzach. Przeprowadzić transfekcję w 10 μl całkowitej objętości na studzienkę, stosując plazmidy w stosunku 10:1:8 (odpowiednio 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla i 40 ng plazmidu Ube3a na studzienkę), jak opisano wcześniej18, i 0,4 μl odczynnika do transfekcji (Tabela 4).
    UWAGA: W każdym eksperymencie pusty wektor (tylko GFP) i plazmid kodujący martwy w ligazie Ube3a są również transfekowane, aby służyły jako kontrole negatywne.
  4. W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (Tabela 4) należy utworzyć mieszankę wzorcową do transfekcji dla każdego wariantu (Tabela 4) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut. Po inkubacji delikatnie wymieszać mieszaninę transfekcji, stukając w probówkę, a następnie dodać 10 μl mieszaniny transfekcyjnej bezpośrednio do istniejących pożywek wzrostowych w studzienkach.
  5. Następnie należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze i pozwolić plazmidom na ekspresję przez 48 godzin. Wymiana pożywki wzrostowej nie jest konieczna.
  6. Monitorować wydajność transfekcji za pomocą fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. HEK293T komórki są skutecznie transfekowane tą metodą, a >80% komórek powinno wykazywać ekspresję GFP po 48 godzinach.

3. Pomiar aktywności lucyferazy

UWAGA: Aktywność lucyferazy jest oceniana za pomocą komercyjnie dostępnego systemu, który testuje zarówno lucyferazy Firefly, jak i Renilla (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta.

  1. Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z transfekowanych komórek HEK293T, a następnie przemyć komórki zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Odessać PBS i poddać lizie komórki, dodając 25 μl niedenaturującego buforu do lizy i inkubować przez 15 minut, delikatnie kołysząc na lodzie.
  2. Następnie dodać 20 μl powstałego lizatu (nie jest konieczne wirowanie) do nowej 96-dołkowej płytki testowej zawierającej 100 μl odczynnika substratowego lucyferazy świetlika. Delikatnie wymieszaj płytkę, stukając.
  3. Załaduj płytkę do czytnika płytek i zmierz luminescencję za pomocą górnego detektora o wysokości odczytu 1 mm i czasie integracji 1 s.
    UWAGA: Wzmocnienie detektora może wymagać regulacji w zależności od siły sygnału.
  4. Natychmiast po odczytaniu luminescencji lucyferazy świetlika dodaj 100 μl substratu lucyferazy Renilla do studzienek. Ten krok jednocześnie wygasza aktywność lucyferazy świetlika, jednocześnie oceniając aktywność lucyferazy Renilla. Wymieszać próbki przez delikatne poruszenie płytki i ponownie zmierzyć luminescencję, aby ocenić aktywność lucyferazy Renilla.
    UWAGA: Podczas gdy inne płytki mogą być używane do tego testu, użycie płytek z czarnymi ramkami i białymi dołkami zapewni najbardziej czułe wyniki, ponieważ wzmacnia to sygnał lucyferazy przy jednoczesnej minimalizacji szumów.
  5. Określ ilościowo odpowiedzi reportera jako stosunek lucyferazy świetlika do lucyferazy Renilla (świetlik/Renilla) i uśrednij wartości potrójnych pomiarów. Następnie znormalizuj wartość Firefly/Renilla dla każdego wariantu w stosunku do wartości dla komórek eksprymujących Ube3a typu dzikiego (WT), aby porównać względną aktywność białek wariantowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakrojone na szeroką skalę funkcjonalne badanie wariantów błędnego sensu Ube3a identyfikuje szeroki krajobraz mutacji powodujących utratę i zysk funkcji
Wcześniejsze prace z mutantami UBE3a sugerowały, że odpowiedź Wnt może służyć jako reporter aktywności komórkowego białka UBE3A. Obserwacje te zostały rozszerzone i przeprowadzono dodatkowe eksperymenty walidacyjne w celu zbadania, czy test BAR jest odpowiedni do raportowania zakresu aktywności UBE3A w komórce. Po pierwsze, HEK293T ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zapewnia wydajną i skalowalną metodę oceny aktywności enzymatycznej wariantów Ube3a. Istnieje kilka szczegółów technicznych, które wymagają starannego rozważenia podczas korzystania z tego testu. Jedną z kwestii jest wybór plazmidów reporterowych Wnt stosowanych w tym teście. Opisany tutaj protokół wykorzystuje w szczególności reporter aktywowany β-kateniną (BAR)21, reporter, który zawiera konkatener elementów odpowiedzi 12 czynników limfocytów T (TCF) oddzielonych ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Fundacji Simons Bridge to Independence (SFARI Award #387972; J.J.Y.), nagrodę NARSAD Young Investigator Award przyznawaną przez Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), stypendium badawcze Fundacji Alfreda P. Sloana (J.J.Y.) oraz granty badawcze przyznawane przez Fundację Zespołu Angelmana (J.J.Y.), Whitehall Foundation (J.J.Y.) i NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowaGibco25300-054
1 Kb Drabinka DNALambda BiotechM108-S
100 bp Drabinka DNALambda BiotechM107
10x Bufor do ligazy DNA T4 z 10 mM ATPNew England BioLabsB0202A
5x Phusion HF Bufor reakcyjnyNew England BioLabsB0518S
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyCorning30004CI
Czarno-biały Isoplate-96 ramka Biała płytka studzienkowaPerkinElmer6005030
Carbenicillin Sól disodowaMidwest ScientificKCC46000-5
Komora do liczenia komórek hrabiny  SzkiełkaInvitrogen by Thermo Fisher ScientificC10283
Hrabina II Automatyczny licznik komórek technologieMaszyna do liczenia komórek
Niestandardowe oligonukleotydy DNAZintegrowane technologie DNA (IDT)
Deoxynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworówNew England BioLabsN0447S
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianGibco10569044Podłoże podstawowe wspomagające wzrost linii komórkowej
HEK293T DPBS (1x)Gibco14190-136
System testowy reporterowy z podwójną lucyferazyPromegaE1910
EcoRI-HF New England BioLabsR3101SEnzym restrykcyjny
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznieGibco16140071Płodowa surowica bydlęca
Fisherbrand Naczynia do hodowli tkankowych poddanych obróbce powierzchniowejFisherbrandFB012924
FuGENE 6 Odczynnik do transfekcjiPromegaE2691
Barwnik ładujący żel Fioletowy (6x)New England BioLabsKomórki HEK293T B7024A
ATCCCRL-3216
Wysoka wydajność ig 10B Chemicznie kompetentne komórkiNienaruszona genomika1011-12E. coli Komórki DH10B
HiSpeed Plasmid Midi KitQiagen12643Midi prep
pCIG2 plazmid
pGL3 BAR plazmid
Phusion HF DNA PolimerazaNew England BioLabsM0530LPolimeraza DNA
ProFlex 3 x 32-dołkowy system PCRStosowane biosystemy przez technologieTermocykler
pTK Plazmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106Mini prep
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu (250)Qiagen28706Oczyszczanie żelu
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR (250)Qiagen28106Oczyszczanie PCR
rCutSmart BufferNew England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156SEnzym restrykcyjny
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek  Czytnik płytek uruchamia oprogramowanie Gen5 v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x roztwór, elektroforezaFisher ScientificBP13324
Tissue Culture Plate 96 dołków, płaskie dnoFisherbrandFB012931
UltraPure Ethidium Bromek SolutionInvitrogen firmy Thermo Fisher Scientific
Enzym restrykcyjnyXmaINew England BioLabsR0180S
życiowe życia Renilla15585011

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30(2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ube3a VariantsFunctional AssessmentUbiquitin LigaseAngelman SyndromeAutism SpectrumCell Based AssayHEK293T CellsLuciferase ReporterBAR AssayMutational Analysis

Related Articles