Artykuł metodologiczny

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

DOI:

10.3791/64458

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering, University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences, University of Manchester

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie matryc ziarnistych do podparcia części podczas procesu biodruku zostało po raz pierwszy zgłoszone przez Bhattacharjee et al. w 2015 roku, a od tego czasu opracowano kilka podejść do przygotowania i wykorzystania podtrzymujących łóżek żelowych w biodruku 3D. W artykule opisano proces wytwarzania zawiesin mikrożelowych przy użyciu agarozy (znanych jako żele płynne), w którym tworzenie cząstek jest regulowane przez zastosowanie ścinania podczas żelowania. W wyniku takiego przetwarzania powstają starannie zdefiniowane mikrostruktury, a następnie właściwości materiału, które nadają mu wyraźne korzyści jako zatapianie nośników druku, zarówno pod względem chemicznym, jak i mechanicznym. Obejmują one zachowywanie się jak lepkosprężyste materiały podobne do ciał stałych przy zerowym ścinaniu, ograniczanie dyfuzji na duże odległości i demonstrowanie charakterystycznego zachowania systemów flokulowanych przy ścinaniu.

Jednak po usunięciu naprężeń ścinających, płynne żele mają zdolność do szybkiego odzyskiwania swoich elastycznych właściwości. Ten brak histerezy jest bezpośrednio związany ze zdefiniowanymi mikrostrukturami, o których wcześniej wspomniano; ze względu na przetwarzanie, reaktywne, nieżelowane łańcuchy polimerowe na granicy faz cząstek ułatwiają interakcje międzycząsteczkowe - podobne do efektu rzepu. To szybkie odzyskiwanie właściwości elastycznych umożliwia biodrukowanie części o wysokiej rozdzielczości z biomateriałów o niskiej lepkości, ponieważ szybkie odtworzenie łoża nośnego zatrzymuje biotusz na miejscu, zachowując jego kształt. Ponadto zaletą płynnych żeli agarozowych jest asymetryczne przemiany żelowania/topnienia (temperatura żelowania ~30 °C i temperatura topnienia ~90 °C). Ta histereza termiczna agarozy umożliwia drukowanie i hodowlę części biodrukowanej in situ bez topienia się płynu nośnego. Protokół ten pokazuje, jak wytwarzać płynne żele z agarozy i demonstruje ich zastosowanie do wspomagania produkcji szeregu złożonych części hydrożelowych w ramach produkcji addytywnej z warstwą zawieszoną (SLAM).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele są idealnymi materiałami do wykorzystania jako wsparcie dla wzrostu komórek1. W zależności od użytego materiału, żelują one za pomocą delikatnych mechanizmów, które nie zagrażają żywotności komórek2,3. Wysoka zawartość wody (zwykle >90%) oznacza, że składniki odżywcze i tlen mogą łatwo dyfundować do materiału, a produkty przemiany materii komórkowej dyfundują na zewnątrz4. W związku z tym wykazano, że żywotność komórek jest zachowana przez okresy przekraczające 1 rok5, a obecnie istnieją przykłady użycia hydrożeli do przechowywania lub "pauzy" komórek do przyszłego użytku terapeutycznego6. Są one szeroko stosowane w inżynierii tkankowej do produkcji struktur podobnych do tkanek, ale ich zastosowanie jest zwykle ograniczone przez trudności w kontrolowaniu zarówno struktury, jak i składu materiału. Historycznie rzecz biorąc, wytrzymałość hydrożelu jest stosunkowo niska (w stosunku do wielu tkanek twardych), ze względu na wysoką zawartość wody i małe objętości zajmowane przez matrycę polimerową tworzącą strukturę. Co więcej, wiele dróg żelowania (termiczna, jonotropowa, fibrylogeneza) oferuje dość powolną kinetykę, co oznacza, że ich właściwości mechaniczne mają tendencję do stabilnego rozwoju w czasie. Z wyjątkiem przenikających się sieci, niska sztywność mechaniczna i powolny czas utwardzania często powodują, że biotusze nie są w stanie swobodnie stać podczas osadzania, mają tendencję do "opadania" i utraty rozdzielczości podczas początkowego wytłaczania.

W próbie przezwyciężenia tego kluczowego problemu, opracowano techniki drukowania wbudowanego, które zapewniają wsparcie podczas drukowania, podczas gdy właściwości mechaniczne konstrukcji są rozwijane7,8. Gdy mikrostruktura żelu w pełni się rozwinie, a właściwości mechaniczne osiągną optymalność, matryca podporowa może zostać usunięta, zwykle poprzez delikatne mycie lub stopienie fazy podporowej. Początkowe prace nad tym podejściem wykorzystywały lepką dyspersję pluroniczną, w której rozłożyła się faza drugorzędowa9. Niedawno Bhattacharjee i in. użyli żeli w postaci granulowanego karbopolu, aby zademonstrować, że macierze komórek mogą być zawieszone w podtrzymującym żelu10. Następnie Hinton i in. poinformowali o wytłaczaniu materiałów na bazie żelu zawierających komórki do podłoża nośnego, które składało się z zawiesiny mikrożelu utworzonej z granulowanej żelatyny11. Po wytłoczeniu hydrożelu zawierającego komórkę i jego późniejszym utwardzeniu, żelatyna została usunięta poprzez delikatne podgrzanie kąpieli podporowej, co umożliwiło stopienie żelatyny. Niestety, proces ten nadal wiąże się z kilkoma ograniczeniami. Na przykład struktura chemiczna żelatyny w porównaniu z kolagenem (w konsekwencji to, że jest to hydrolizowana forma kolagenu) jest taka, że wiele cząstek chemicznych w jej szkielecie może wchodzić w interakcje z jednostkami biologicznymi; W związku z tym resztkowa matryca nośna może zakłócać dalsze procesy biologiczne. Co więcej, produkty pochodzenia zwierzęcego mają ograniczone zastosowanie, jeśli chodzi o przekładalność technologii. Stwarza to wyzwania, jeśli wyprodukowana część jest przeznaczona do użytku klinicznego, a nawet jeśli ma być używana do odpowiedzi na podstawowe pytania biologiczne, gdzie to zanieczyszczenie powierzchni może powodować poważny problem.

Następnie stworzyliśmy wyrafinowany proces, który pozwala na zawieszenie produkcji hydrożeli w matrycy nośnej, która nie ma ładunku w warunkach fizjologicznych i jest utworzona z materiałów niezwierzęcych. Chociaż proces ten może być stosowany z wieloma nośnikami biopolimerowymi, agaroza zapewnia materiał, który jest obojętny na interakcje biologiczne, ponieważ jest oparty na cukrze i neutralnie naładowany przy fizjologicznym pH 12,13. Zamiast rozdrabniać już istniejący żel, materiał podporowy jest formowany przez zastosowanie ścinania podczas żelowania14,15,16. W ten sposób powstaje matryca cząstek, które wykazują na swojej powierzchni cechy podobne do dendronów i są rozproszone w wtórnej matrycy niezżelowanego polimeru17,18. Rezultatem jest materiał o interesujących właściwościach materiału19,20,21,22 który może rozrzedzać się jak ścinanie w podobny sposób jak wcześniej zgłaszane granulowane żele, ale ma tendencję do szybszego odzyskiwania lepkości po usunięciu ścinania23. Gdy materiał zawierający komórki wytłaczany do matrycy nośnej w pełni dojrzeje, matryca nośna może zostać usunięta przez delikatne mieszanie przed umieszczeniem w hodowli. Wykazano, że możliwe jest wykorzystanie tego procesu do wytwarzania materiałów o złożonej strukturze i rekapitulacji struktur biologicznych zarówno skóry, jak i obszaru kostno-chrzęstnego23,24,25. W tym artykule opisano szczegółowo, jak wytworzyć materiał nośny i zwrócono uwagę na odpowiednie biotusze stosowane w różnych złożonych strukturach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Przygotowanie łoża zawiesinowego z płynnego żelu

  1. Przygotuj 1,000 ml rozproszonej agarozy (0,5% w/v), dodając 5 g proszku agarozy do 1,000 ml ultraczystej wody (typ 1, >18 mΩ·cm-1) w szklanej butelce o pojemności 2,000 ml.
  2. Dodać mieszadło magnetyczne o średnicy 70 mm do mieszaniny wodnej i zabezpieczyć nakrętkę butelki, najpierw całkowicie dokrętając, a następnie odkręcając o ćwierć obrotu.
  3. Rozpuścić i wysterylizować mieszaninę, umieszczając szklaną butelkę w koszu autoklawu, zamykając pokrywę i uruchamiając cykl przez 15 minut w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 1 bar.
    UWAGA: Ten protokół jest zawsze używany do autoklawowania roztworów w dalszych krokach.
  4. Wyjąć butelkę z autoklawu, gdy autoklaw ostygnie do 80 °C i umieścić ją na mieszadle magnetycznym (nieogrzewanym), z mieszadłem ustawionym na 800 obr./min.
    UWAGA: Butelka i płyn pozostają gorące.
  5. Schłodzić zol w warunkach otoczenia, ciągle mieszając, aż temperatura będzie niższa niż jego Tżel (punkt żelowania), 32 °C.
  6. Wyjąć butelkę z mieszadła i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Płynny żel można przechowywać do czasu, gdy będzie potrzebny.

2. Przygotowanie biotuszów

  1. Przygotuj biotusz na bazie gellanu, używając 1% (w/w) zolu gumy gellan o niskiej acylowości w wodzie ultraczystej (typ 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Odważyć 0,5 g proszku gellan do łódki wagowej.
    2. Dodaj 49,5 g ultraczystej wody do szklanej butelki o pojemności 100 ml wraz z mieszadłem magnetycznym.
    3. Złóż łódkę ważącą zawierającą gellan power na pół i powoli dodawaj proszek do wody, cały czas mieszając.
    4. Rozpuścić i wysterylizować zol w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia do 20 °C.
    5. Przechowywać biotusz w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Przygotuj biotusz z mieszanką pektyny i kolagenu w ultraczystej wodzie (typ 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Przygotować podstawowe 5% (w/v) roztwory pektyn o niskiej zawartości metoksy, ważąc 2,5 g proszku pektynowego do łodzi wagowej.
    2. Dodaj 50 ml ultraczystej wody do szklanej butelki o pojemności 100 ml wraz z mieszadłem magnetycznym.
    3. Złóż łódkę ważącą zawierającą moc pektyn na pół i powoli dodawaj proszek do wody, cały czas mieszając.
    4. Mieszaninę wodną należy sterylizować w autoklawie i schłodzić do temperatury 20 °C.
    5. Przygotuj mieszanki pektynowo-kolagenowe w proporcjach 1:1 i 2:1, dodając odpowiednio 3 ml roztworu pektyny do 3 ml roztworu kolagenu lub dodając 4 ml roztworu pektyny do 2 ml roztworu kolagenu. Delikatnie wymieszać mieszanki za pomocą pipety, wyjmując i dozując mieszaninę 10x.
      UWAGA: Tę procedurę najlepiej wykonywać przy użyciu zimnych materiałów na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu kolagenu. Wstępne chłodzenie pektyn i kolagenu można osiągnąć poprzez przechowywanie w temperaturze 4 °C przed zmieszaniem.
    6. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  3. Przygotuj biotusz z domieszką alginianu i kolagenu w ultraczystej wodzie (typ 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Odważyć 2 g proszku alginianowego do łódki wagowej.
    2. Dodaj 50 ml ultraczystej wody do szklanej butelki o pojemności 100 ml wraz z mieszadłem magnetycznym.
    3. Złóż łódkę ważącą zawierającą moc alginianu na pół i powoli dodawaj proszek do wody, cały czas mieszając.
    4. Podgrzać dyspersję do temperatury 60 °C, ciągle mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia alginianu (klarowna, lekko brązowa ciecz), a następnie schłodzić do temperatury 20 °C.
    5. Rozcieńczyć roztwór alginianu pożywką do hodowli komórkowych, taką jak zmodyfikowana pożywka orła (DMEM) firmy Dulbecco, dodając 25 ml roztworu alginianu do 25 ml DMEM.
    6. Przygotuj mieszanki alginianowo-kolagenowe (1:1), dodając 3 ml roztworu alginian/DMEM do 3 ml roztworu kolagenu. Delikatnie wymieszać mieszanki za pomocą pipety, pobierając i dozując mieszaninę 10x i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Tę procedurę najlepiej wykonywać przy użyciu zimnych materiałów na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu kolagenu. Wstępne chłodzenie pektyn i kolagenu można osiągnąć poprzez przechowywanie w temperaturze 4 °C przed zmieszaniem.

3. Charakterystyka reologiczna biotuszy

  1. Włącz reometr, włóż ząbkowaną geometrię 40 mm i odstaw na 30 minut.
  2. Wyzeruj wysokość szczeliny reometru za pomocą funkcji wysokości zerowej szczeliny.
  3. Dodaj ~ 2 ml próbki na dolną płytkę i opuść górną geometrię, aby uzyskać szczelinę o wysokości 1 mm.
  4. Przyciąć próbkę, usuwając nadmiar materiału wyrzuconego spomiędzy płytek. Aby to zrobić, użyj płaskiej, nieściernej krawędzi, aby odciągnąć nadmiar płynu od szczeliny i zanurzyć go w bibułce.
    UWAGA: Kroki 3.2-3.4 są powtarzane w celu zmiany próbki przed każdym z poniższych kroków.
  5. Wykonaj profile wiskozymetryczne, aby określić wstrzykiwalność biotuszu.
    1. Wybierz test wiskozymetryczny z opcji użytkownika.
    2. Wprowadź parametry testu rampy z kontrolowaną szybkością ścinania: od 0,1 do 500 s-1, z czasem narastania 1 min.
    3. Powtórzyć badanie z rampą wiskozymetryczną na nowych próbkach pod kontrolą naprężeń, stosując górne i dolne naprężenia określone na podstawie badania rampy z kontrolowaną szybkością ścinania w kroku 3.5.2.
  6. Wykonaj testy małych odkształceń, aby określić charakterystykę żelowania biotuszu.
    1. Wybierz testowanie oscylacyjne z opcji użytkownika.
    2. Wprowadź parametry do testu pojedynczej częstotliwości przy stałym obciążeniu: częstotliwość 1 Hz, odkształcenie 0,5% w ciągu 1 godziny, podczas gdy tusz żeluje.
  7. Wykonać pomiary amplitudy i częstotliwości in situ na próbkach żelowych.
    1. Wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika.
    2. Wybierz przemiatanie amplitudy i wprowadź parametry dla testu przemiatania amplitudy, który jest sterowany odkształceniem: od 0,01 do 500%, przy stałej częstotliwości 1 Hz.
    3. Załaduj nową próbkę i wybierz test oscylacyjny z opcji użytkownika. Następnie wybierz test częstotliwości i wprowadź parametry częstotliwości od 0,01 do 10 Hz oraz odkształcenie, które znajduje się w liniowym obszarze lepkosprężystym (LVR) widm określonych na podstawie danych amplitudy uzyskanych w kroku 3.7.2 (zwykle wartość między 50% a 80% LVR).

4. Projektowanie i drukowanie struktur 3D za pomocą biodrukarki 3D

  1. Uruchom oprogramowanie CAD, aby rozpocząć generowanie modelu CAD.
    1. Wybierz punkt menu Narzędzia | Materiały w oprogramowaniu CAD do definiowania parametrów druku dla wybranego biotuszu.
    2. Wprowadź parametry drukowania odpowiednie dla używanej drukarki; na przykład w przypadku 3D Discovery wprowadź szacowaną średnicę filamentu (~200-500 μm dla większości biotuszów) w zakładce grubości, aby określić grubość Z każdej warstwy.
      UWAGA: Rozwarstwienie końcowej konstrukcji wskazuje na potrzebę zwiększenia wartości grubości, podczas gdy utrata rozdzielczości podkreśla potrzebę zmniejszenia grubości.
    3. Zaprojektuj żądaną strukturę warstwa po warstwie, korzystając z zakładek Warstwy w oprogramowaniu. Grupuj warstwy za pomocą karty Grupuj i przypisz każdą warstwę do poziomu na płaszczyźnie Z za pomocą karty Poziom.
      1. Na przykład, aby wygenerować strukturę sieciową (przy użyciu biotuszu z domieszką alginianu i kolagenu przygotowanego w kroku 2.3), utwórz jedną warstwę z włóknami wzdłuż osi x i drugą warstwę z włóknami wzdłuż osi y. Przypisz oba do osobnego poziomu.
    4. Na karcie Grupuj określ wysokość budowy, wybierając liczbę powtarzających się jednostek w konstrukcji.
    5. Kliknij narzędzie Generuj, aby utworzyć kod G dla projektu i wyświetlić render 3D konstrukcji.
  2. Zamknij program BioCAD i uruchom oprogramowanie interfejsu człowiek-maszyna (HMI) 3D Discovery, aby rozpocząć proces drukowania.
    1. Zmontuj głowicę drukującą zgodnie z instrukcjami producenta. Zamontuj mikrozawór do głowicy drukującej i wkręć wybraną dyszę do wytłaczania.
    2. Kliknij funkcję Pomiar długości igły, aby skalibrować głowicę drukującą.
    3. Załaduj naczynie hodowlane (np. płytkę 6-dołkową) na platformę drukującą.
    4. Porcjuj biotusz do wkładu drukującego i wkręć w głowicę drukującą nad mikrozaworem.
    5. Podłącz zmontowaną głowicę drukującą do pneumatycznego systemu dociskowego i wybierz głowicę drukującą w interfejsie HMI, aby się załączyć.
    6. Kliknij przycisk Sprawdź ciśnienie, aby umożliwić dostrojenie ciśnienia wytłaczania.
    7. Po wybraniu odpowiedniego ciśnienia (~30-120 kPa w zależności od żądanej rozdzielczości) otwórz wygenerowany wcześniej G-code i kliknij Uruchom, aby rozpocząć proces drukowania.

5. Przygotowanie analogów skóry

  1. Hodowla ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) i komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) w DMEM uzupełnionych płodową surowicą bydlęcą (FBS) (10%), buforem HEPES (2,5%) i penicyliną/streptomycyną (1%) w kolbach T75 aż do osiągnięcia 90% zbieżności. Hodowla ludzkich keratynocytów naskórka (HEK) w pożywkach wzrostowych keratynocytów (KGM) aż do osiągnięcia 70%-80% konfluencji. Podczas hodowli wszystkie komórki należy przechowywać w inkubatorze w warunkach 37 °C, 5% CO2 i 95% powietrza.
  2. W celu przygotowania HDF i ADSC do biotuszów skórnych i tłuszczowych, należy przemyć komórki, delikatnie pipetując 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kolb, przechylić kolbę, aby zawirować PBS nad komórkami i aspirować, uważając, aby nie naruszyć przyłączonych komórek.
    1. Aby podnieść komórki, należy odpipetować 3 ml enzymu dysocjacji komórek 1x do kolby, aby przykryć komórki i umieścić kolbę w inkubatorze na 3 minuty, mocno stukając kolbą o dłoń w celu usunięcia komórek. Zneutralizować działanie enzymu za pomocą 6 ml kompletnego DMEM.
      UWAGA: Inkubować przez kolejne 2 minuty, jeśli komórki pozostają przyczepione po stuknięciu.
    2. W celu przygotowania biotuszów skórnych i tłuszczowych należy pipetować zawiesiny komórek do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml i pobrać 10 μl z każdej z nich do zliczania komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować pozostałe zawiesiny komórkowe o masie 300 × g przez 5 minut w celu osadzenia komórek.
    3. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, dodać odpowiedni roztwór polimeru (przygotowany w kroku 2.2) i wymieszać, delikatnie stymulując, pipetując do następujących gęstości:
      1. W przypadku warstwy tłuszczowej pipeta 5 × 105 ADSC mL-1 na 1:1 kolagen do mieszanki pektyn.
      2. W przypadku warstwy brodawkowatej pipetę 3 × 106 HDF mL-1 na mieszankę kolagenu i pektyn w proporcji 2:1.
      3. W przypadku warstwy siateczkowatej pipetą 1,5 × 106 HDF mL-1 na mieszankę kolagenu do pektyn w proporcji 2:1.
  3. Aby wydrukować, załaduj każdy biotusz do osobnego wkładu i wydrukuj konstrukt w płynnym żelu podtrzymującym na szklanej szalce Petriego zgodnie z instrukcjami w sekcji 4.
    1. Po zakończeniu drukowania wstrzyknąć 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2O wokół konstruktu i 3 ml pożywki adipogennej (kompletny DMEM uzupełniony 500 μM izobutylometyloksyny [IBMX], 50 μM indometacyny i 1 μM deksametazonu) do płynnego żelu za pomocą strzykawki i igły. Umieść na noc w inkubatorze.
    2. Następnego dnia usuń konstrukt z kąpieli podporowej za pomocą szpatułki, delikatnie umyj w PBS i hoduj przez 14 dni w pożywce adipogennej na płytce 6-dołkowej.
    3. Po 14 dniach usuń wystarczającą ilość pożywki, aby utworzyć granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni konstruktu i umieść 2 × 106 keratynocytów na wierzchu konstruktu, aby utworzyć warstwę naskórka.
    4. Hodowla przez 1 tydzień przed analizą.

6. Przygotowanie modelu tętnicy szyjnej

  1. Załaduj roztwór biotuszu z gumy gellan (przygotowany w kroku 2.1) do wkładu do drukarki.
  2. Wydrukować model tętnicy szyjnej na szalce Petriego zawierającej materiał nośny z płynnego żelu zgodnie z instrukcjami drukowania w sekcji 4.
  3. Po zakończeniu drukowania wstrzyknij 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2O wokół konstrukcji za pomocą strzykawki i igły.
  4. Po upływie minimum 3 godzin należy wyjąć konstrukt z kąpieli podporowej za pomocą szpatułki i delikatnie umyć w PBS.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alginian i biotusz kolagenowy typu I
Zaobserwowano, że rozdzielczość wydruku (zapisana w funkcji średnicy filamentu) jest bezpośrednio dostrajana poprzez zmiany ciśnienia wytłaczania (Rysunek 1A-C). Ciśnienie wytłaczania i rozdzielczość druku były bezpośrednio związane z najmniejszymi średnicami filamentu generowanymi podczas drukowania przy ciśnieniu wytłaczania 30 kPa. Co ciekawe, przy ciśnieniu wytłaczania wynoszącym 30 kPa można było wygenerować filamenty, które pasowały do wewnętrznej średnicy dyszy do wytłaczania (średnia średnica filamentu: 323 μm ± 50 μm; średnica dyszy: 300 μm), co sugeruje, że można osiągnąć "maksymalną rozdzielczość". Co więcej, parametry drukowania dla tej rozdzielczości mogą być z powodzeniem zastosowane do generowania rurki naczyniowej alginian/kolagen, która może być ekstrahowana i perfuzjonowana (Rysunek 1D).

figure-results-1
Rysunek 1: Generowanie wydruków w wysokiej rozdzielczości za pomocą SLAM. Dostosowanie rozdzielczości druku sieci alginian/kolagen w funkcji średnicy filamentu poprzez ekstruzję przy (A) 30 kPa, (B) 60 kPa i (C) 120 kPa. (D) Wytwarzanie cewy naczyniowej alginian/kolagen. Podziałka = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Skrót: SLAM = produkcja addytywna z warstwą zawieszoną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analogi skóry
SLAM wykorzystano również do stworzenia struktury przypominającej skórę (ryc. 2A) przy użyciu biotuszu utworzonego z mieszanki kolagenu I i pektyny. Aby uzyskać gradient właściwości mechanicznych podobnych do tych, które występują w skórze, zastosowano różne proporcje pektyny i kolagenu w warstwach skórnej (5% w/w pektyny zmieszanej w stosunku 2:1 z zapasem kolagenu 5 mg∙mL−1) i podskórnej (5% w/w pektyny zmieszanej w stosunku 1:1 z zapasem kolagenu 5 mg∙mL−1). Uzyskana w ten sposób struktura (Rysunek 2Bi-Bii) była dobrze zintegrowana po zanurzeniu w DMEM, bez oznak rozwarstwienia. Co ważne, po okresie 14 dni hodowli stwierdzono wysoki poziom żywotności komórek w całej strukturze (Rysunek 2Biii). Co ciekawe, w okresie kultury materiały usztywniły się24, co wskazuje na przemodelowanie materiału.

figure-results-2
Rysunek 2: Wytwarzanie struktury przypominającej skórę. (A) Schemat pokazujący, w jaki sposób proces SLAM został wykorzystany do wytworzenia warstwowej struktury osadzonej w ludzkich fibroblastach skóry. Złoże podwieszane zostało tutaj wykonane z cząstek utworzonych z agarozy, podczas gdy warstwy podskórne i skórne zostały utworzone z różnych proporcji pektyny i kolagenu I. (B) Struktura warstwowa miała reprezentować trójwarstwową strukturę skóry (i). Przy powodzeniu w replikacji tej struktury (ii) we wszystkich próbkach odnotowano wysoki poziom żywotności komórek, co wykazano za pomocą barwienia kalceiną-AM (iii). Podziałka = 5 mm (Bii). Skrót: SLAM = produkcja addytywna z warstwą zawieszoną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tętnica szyjna
Aby przesunąć granice metody, wyprodukowano wybór bardziej złożonych odbitek. W jednym z takich przykładów rozwidlona tętnica szyjna została wydrukowana przy użyciu 1% biotuszu gellan (Rysunek 3A), który następnie usieciowano przez wytłaczanie 200 mM CaCl2 w płynnym złożu żelowym (Rysunek 3B) i po prostu podniesiony z podpory po żelowaniu ( Rysunek 3C). Pomimo tego, że prekursorskie rozwiązania drukarskie wykazywały niską lepkość, łoże nośne z powodzeniem umożliwiło produkcję złożonej geometrii. Tętnica zachowała swoją strukturę podczas osadzania, sieciowania i ekstrakcji (Rysunek 3), bez konieczności modyfikowania kodów drukarskich w celu włączenia dodatkowego rusztowania.

figure-results-3
Rysunek 3: Proces wytwarzania tętnicy szyjnej gellan za pomocą SLAM. (A) Wytłaczanie gellanu w łożu płynu żelowego podczas drukowania, (B) ukończony wydruk tętnicy szyjnej w płynnym żelu podczas sieciowania, oraz (C) końcowy model tętnicy szyjnej po pobraniu z płynnego nośnika żelowego. Podziałka = 10 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozważenie doboru materiałów użytych do wykonania łóżka nośnego
Na etapie projektowania wymagano różnych cech łóżka nośnego. Cechy te obejmowały: i) utrzymanie wystarczającej struktury do zawieszenia wytłaczanego materiału; ii) zdolność rozrzedzania przy ścinaniu, aby umożliwić głowicy drukującej swobodne poruszanie się po materiale nośnym; iii) szybka restrukturyzacja (właściwości samoregenerujące), tworząca podparcie wokół osadzonego biotuszu; iv) stabilny termicznie zarówno w temperaturze pokojowej, jak i w temperaturach fizjologicznych; v) neutralny (tj. nienaładowany) materiał, który jest stosunkowo bioobojętny, w zakresie pH i elektrolitów (formy i stężenia jonów), zapobiegając interakcjom z komórkami i naładowanymi biotuszami; vi) nietoksyczny; oraz vii) najlepiej ze źródła innego niż zwierzęce.

Chociaż istnieje wiele materiałów biopolimerowych, które zachowują kilka z tych nieodłącznych cech, ze zdolnością do wykonywania zawieszonej produkcji addytywnej 3D bez spełniania wszystkich tych cech 11,26,27, intencją było wyprodukowanie łoża nośnego, które przezwyciężyłoby pewne praktyczne problemy związane z innymi materiałami nośnymi. Ze względu na właściwości chemiczne agarozy, a w szczególności w postaci płynnego żelu w postaci cząstek stałych, można uzyskać wszystkie te cechy. Umożliwiło to stworzenie łoża nośnego, które można było stosować w szerokiej gamie biotuszy 23,24,25,28. Rzeczywiście, bioobojętny charakter materiału zapewnił potencjał do utrzymania wydrukowanej struktury in situ przez cały okres hodowli, co pozwoliło na wystarczający okres pełnego rozwoju wielu różnych biotuszów, bez zmian w biologii. Co więcej, rozrzedzający się charakter cząstek stałych pozwolił na łatwe usunięcie z końcowego wydrukowanego konstruktu, podczas gdy nietoksyczne, niezwierzęce pochodzenie daje potencjał do szybkiego przeniesienia do kliniki, pokonując bariery związane z wymogami etycznymi i regulacyjnymi.

Rozważania przy doborze materiałów do produkcji biotuszów
W biodruku z wytłaczaniem bezpośrednim biotusze są osadzane na stole do druku 2D. Korzystne jest, aby roztwory monomerów biotuszu miały właściwości rozrzedzające przy ścinaniu; Jednak, aby wytworzyć konstrukcje o wysokiej wierności i fizjologicznie istotnych wymiarach, muszą one mieć niską tiksotropię i powrócić do wystarczająco wysokiej lepkości, aby po osadzeniu tworzyły stałe włókna 29,30,31. Przy zwiększonej lepkości ciśnienie wymagane do wytłaczania jest znacznie wyższe, co często negatywnie wpływa na żywotność zamkniętego ogniwa31,32. Bioprinting zawiesinowy usuwa to ograniczenie, ponieważ wytłaczany materiał jest podtrzymywany przez kąpiel zawiesinową podczas sieciowania. To osiągnięcie znacznie zwiększa zakres preparatów biotuszów, które można stosować. Na przykład, ostatnie prace wykazały zastosowanie roztworów kolagenu o niskim stężeniu drukowanych w bardzo złożonych geometriach analogicznych do wewnętrznej struktury serca 33,34,35. W zastosowaniach wymienionych w tej metodzie, druk wbudowany pozwolił na wybór farb biomateriałowych tak, aby jak najlepiej odwzorowywały środowisko fizjologiczne, do którego były przeznaczone, a nie ze względu na ich zdolność do drukowania.

Ograniczenia w wielkości konstrukcji
W literaturze dotyczącej biofabrykacji wykazano, że różne rodzaje biodrukarek, napędzane alternatywnymi technologiami głowic drukujących, mogą być włączane do wbudowanych technik produkcyjnych. Nie inaczej jest w przypadku zademonstrowanej tutaj technologii, której przykładami są pneumatyczna biodrukarka oparta na mikrowytłaczaniu (INKREDIBLE), jak zademonstrowali Senior i wsp., oraz biodrukarki oparte na wytłaczaniu z kontrolowanymi mikrozaworami (3D Discovery)23. Chociaż sprawia to, że technologia jest dostępna dla wielu użytkowników, którzy mogą już posiadać biodrukarkę, ograniczenia dotyczące osiągalnego rozmiaru konstrukcji są ostatecznie zależne od specyfikacji danej biodrukarki. Początkowo głównym ograniczeniem w generowaniu dużych struktur jest rozmiar stołu drukującego, granice trajektorii X, Y i Z, a także rozmiar naczynia, w którym znajduje się płynny żel nośny.

Ograniczenia w rozdzielczości
Podczas wytwarzania skomplikowanych struktur o rozmiarach mikrometrów, uzyskana rozdzielczość jest w dużym stopniu zależna od precyzji drukarki (kontrola nad rozmiarem kroku, stopniem wytłaczania), wewnętrznej średnicy dyszy drukującej i szeregu regulowanych parametrów oprogramowania, w tym prędkości drukowania, ciśnienia drukowania i prędkości przepływu36. Ponadto kontrola nad wielkością kropli wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla ułatwienia generowania struktur o wysokiej rozdzielczości, przy czym najlepsze wyniki zaobserwowano w drukarkach ekstruzyjnych z kontrolowanym mikrozaworem. Ostatecznie, gdy wszystkie parametry są zoptymalizowane, można osiągnąć rozdzielczość druku odpowiadającą lub nawet mniejszą niż wewnętrzna średnica dysz wytłaczających, z osadzonym filamentem rzęduskali mikrometrycznej 37. Jest to jednak uzależnione od optymalizacji wszystkich wspomnianych wcześniej parametrów druku, a rozdzielczość może być znacznie ograniczona przez mechanizm drukowania i precyzję. Na przykład wytłaczanie pneumatyczne nie wydaje się pozwalać na uzyskanie takiej samej rozdzielczości drukowania, jak wytłaczanie za pomocą kontrolowanego mikrozaworu. W związku z tym osiągnięcie maksymalnej rozdzielczości drukowania wiąże się z potencjalnymi kosztami, ponieważ takie systemy wiążą się ze znacznie zwiększonymi kosztami dla użytkownika.

Perspektywy na przyszłość i potencjał
W chwili obecnej istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem zawieszonych procesów produkcyjnych, aby umożliwić produkcję złożonych miękkich struktur zawierających osadzone ogniwa, a w nadchodzących latach niewątpliwie nastąpi znaczny postęp. Zapewniony jest ciągły postęp w poprawie rozdzielczości druku, chociaż dopiero się okaże, jak bardzo będzie to konieczne, biorąc pod uwagę, że większość systemów biologicznych jest w stanie przeorganizować się na poziomie molekularnym. Podczas gdy zainteresowanie mediów skupia się na wykorzystaniu tkanek drukowanych w 3D do bezpośredniego zastępowania tkanek ludzkich po urazie lub chorobie, wszelkie solidne procedury medyczne możliwe dzięki tym procesom są odległe o kilka lat 38,39. Bardziej prawdopodobne jest, że wpływ tych złożonych systemów hodowlanych będzie dotyczył badań przesiewowych leków, a nawet będzie wykorzystywany jako narzędzia, aby lepiej zrozumieć procesy biologiczne38. W szczególności wiele może przynieść tu biologia rozwojowa, w której precyzyjna kontrola nad specjalnym osadzaniem się cząsteczek pozwoli naukowcom zbadać rolę układów wieloczynnikowych w procesach rozwoju tkanek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować EPSRC (EP/L016346/1), MRC oraz Doctoral Training Alliance Biosciences for Health za finansowanie i wsparcie tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3D Discovery BioprinterRegenHUBIOFACTORYBiodrukarka do wytłaczania mikrozaworów
Agaroza Merck9012-36-6Materiał używany do tworzenia płynnych żelowych wanien podtrzymujących 
Autoklaw stołowyPrestige MedicalB8L75814Classic
Brilliant Blue GMerck6104-58-1Barwnik stosowany do barwienia struktur 
Chlorek wapnia dwuwodnyMerck 10035-04-8Służy do siatkowania struktur drukowanych 
DeksametazonMerck D4902-25MGStosowany w podłożach adipogennych
DMEMMerckD6429Pożywka do hodowli komórkowych
Duran  butelka Szklana butelkaMerckZ305219
Podstawowy system obrazowania EVOS XL EVOS&handel;AMEX1000Mikroskop jasnego pola z kontrastem
fazowym FBSFisher Scientific10500-064Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Guma gellanowaSkładniki specjalne5060341112638Guma o niskiej zawartości acylo-gellanu używana do produkcji biotuszu do modelu tętnicy kokardydowej
Bufor HEPESMerckH9897-10PAKBufor do pożywek do hodowli komórkowych
IndometacynaMerckI7378Stosowany w podłożach adipogennych
Izobutylometyloksantyna (IBMX)MerckI7018-100MGStosowany w podłożach adipogennych
Pożywka wzrostowa keratynocytówLonza00192060Stosowana jako pożywka do hodowli keratynocytów
Pektyna o niskiej zawartości metoksyCP KelcoLM-5CSPektyna stosowana do wytwarzania mieszanek pektynowo-kolagenowych
Penicylina-streptomycynaMerckP4333-100MLSłuży do hamowania rozwoju bakterii
PureCol EZ Roztwór żelowyMerck5074Roztwór kolagenu stosowany do wytwarzania mieszanek alginian/kolagen
Alginian soduMerck9005-38-3Proszek alginianowy używany do produkcji mieszanek alginian/kolagen 
TrypLE select Fisher Scientific 12563011enzym dysocjacji komórek
T75 KolbyStarLabCC7682-4175Używany do hodowli komórek
 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).
  2. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  5. Iordachescu, A., et al. An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network. Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156(2018).
  6. Zhang, C., et al. Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330(2018).
  7. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  8. Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. Granular hydrogels for 3D bioprinting applications. View. 1 (3), 20200060(2020).
  9. Lieben, L. The future of 3D printing of human tissues is taking shape. Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191(2016).
  10. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655(2015).
  11. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).
  12. Zarrintaj, P., et al. Agarose-based biomaterials for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).
  13. te Nijenhuis, K. Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , Springer. Berlin. 194-202 (1997).
  14. Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. A molecular model for the formation and properties of fluid gels. International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).
  15. Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach. Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).
  16. Cooke, M. E., et al. Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications. Advanced Materials. 30 (14), 1705013(2018).
  17. Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel. Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622(2021).
  18. Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. Stabilisation of foams by agar gel particles. Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).
  19. Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure. Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).
  20. Garrec, D. A., Norton, I. T. Understanding fluid gel formation and properties. Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).
  21. Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology. Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).
  22. Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions. Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).
  23. Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM). Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845(2019).
  24. Moakes, R. J. A., et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioengineering. 5 (4), 046103(2021).
  25. Moxon, S. R., et al. Suspended manufacture of biological structures. Advanced Materials. 29 (13), 1605594(2017).
  26. Noor, N., et al. 3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344(2019).
  27. Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  28. Moxon, S. R., et al. Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation. Materials Science and Engineering: C. 104, 109904(2019).
  29. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).
  31. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  32. Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability. MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).
  33. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomedical Materials. 10 (3), 034002(2015).
  34. Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths. Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).
  35. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  36. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264(2017).
  37. Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. 3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).
  38. Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).
  39. Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. 3D bioprinting and the future of surgery. Frontiers in Surgery. 7, 609836(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D BioprintingMicrogel SuspensionsSuspended BioprintingRheological TestingViscometry ProfilesOscillatory TestingBioink InjectabilitySupport Bath Removal

Powiązane artykuły