Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja Lumikanu z błony owodniowej i określenie jej temperatury przechowywania

DOI:

10.3791/64460

⸱

14 października 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Oftalmologia Fundacion Conde de Valenciana IAP, 2Biochemistry Department, Medicine Faculty, Universidad Nacional Autónoma de Mexico

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje ekstrakcję lumikanu z błony owodniowej (AM) i warunki ich przechowywania jako ekstraktu AM (AME) w temperaturze -20 °C, 4 °C i temperaturze pokojowej (RT) przez 6, 12, 20 i 32 dni w celu ilościowego określenia jego białek i stężenia lumikanu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lumican to mały, bogaty w leucynę proteoglikan w ludzkiej błonie owodniowej (AM), który wspomaga nabłonek rogówki i organizację włókien kolagenowych, utrzymując przezroczystość rogówki. W niniejszej pracy zaproponowano metodę ekstrakcji białka z AM w celu otrzymania lumikanu. Dodatkowo ocenia się stabilność lumikanu w ekstrakcie AM (AME) przechowywanym w różnych temperaturach i okresach czasu. 100 mg AM rozmrożono i mechanicznie zdeepitelializowano. Pozbawioną nabłonka AM zamrożono i rozdrobniono do uzyskania drobnego proszku, który rozpuszczono w 2,5 ml buforu soli fizjologicznej z inhibitorami proteazy i odwirowano w celu ekstrakcji białka. Supernatant pobrano i przechowywano w temperaturze -20 °C, 4 °C i temperaturze pokojowej (RT) przez 6, 12, 20 i 32 dni. Następnie lumikan oznaczono ilościowo w każdym AME. Technika ta umożliwia dostępny i możliwy do nabycia protokół ekstrakcji lumikanu z AM. Na stężenie lumikanu miał wpływ czas przechowywania i warunki temperaturowe. Produkt leczniczy Lumican w AME przechowywany przez 12 dni w temperaturze -20 °C i 4 °C był znacznie wyższy niż w przypadku innych lekarzy oświatomierzy. Ta ekstrakcja lumikanu może być przydatna do opracowywania metod leczenia i rozwiązań farmaceutycznych. Potrzebne są dalsze badania w celu określenia zastosowań AME lumican w procesie reepitelializacji i gojenia się ran.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z najczęściej stosowanych metod leczenia schorzeń rogówki jest przeszczep błony owodniowej; jednak w ostatnich latach pojawiły się nowe propozycje wykorzystania różnych składników tkanki owodniowej jako alternatywnych i uzupełniających metod leczenia. Do najczęściej badanych składników AM należą te uzyskane z ekstraktu AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM zawiera wiele rozpuszczalnych czynników, takich jak białka antyangiogenne, interleukiny (IL), tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP), białka przeciwzapalne, w których pośredniczy TSG-6, które hamują zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilów, czynniki wzrostu: naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu (TGF) (alfa i beta), czynnik wzrostu keratynocytów (KGF), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) i lumikan, który utrzymuje przezroczystość rogówki poprzez regulację fibrylogenezy kolagenu1,2,3,4,5,6,7,8,9.

Lumican to mały proteoglikan bogaty w leucynę (SLRP), jeden z głównych zewnątrzkomórkowych składników kolagenazy śródmiąższowej w macierzy zrębu rogówki, odpowiedzialny za organizację włókien kolagenowych i utrzymanie przezroczystości rogówki4,10,11. Proteoglikany to cząsteczki w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które są głównymi cząsteczkami w przeprowadzaniu sygnalizacji komórkowej i utrzymywaniu homeostazy wewnątrzkomórkowej12. Doniesiono, że białka ECM napędzają komórkowe procesy proliferacji, różnicowania i migracji podczas gojenia się ran11.

Dowody wskazują na możliwy udział lumikanu w procesie reepitelializacji rogówki. Saika i wsp. w badaniu wykazali, że po uszkodzeniu rogówki lumican można wykryć w keratocytach rogówki między pierwszymi 8 godzinami a do 3 dni po urazie. Prezentując najwyższe stężenie lumikanu w drugim i trzecim dniu, ten proteoglikan jest następnie niewykrywalny w siódmym dniu13. Dane te sugerują udział lumikanu w aktywacji procesu reepitelializacji rogówki. Z drugiej strony, w innym badaniu stwierdzono, że brak lumikanu opóźnia reepitelializację; Co ciekawe, dodanie Lumican może przyspieszyć proces reepitelializacji4,11,13. Podobnie, niedawne badanie wykazało, że lumican może modulować funkcje zapalne fibroblastów rąbka rogówki14, co sugeruje rolę lumikanu jako modulatora odpowiedzi zapalnej, przeciwzwłóknieniowej i reepitelializującej. Podobnie, lumican może modulować odpowiedź rogówki poprzez interakcję z cząsteczkami sygnałowymi, takimi jak Fas-FasL. Również brak lumikanu w nokautującym modelu myszy Lum-/- wykazał, że brak sygnalizacji lumikanu uniemożliwia odpowiednią naprawę rogówki15.

Przede wszystkim ta metoda ma na celu zademonstrowanie wykonalnego i przystępnego sposobu ekstrakcji lumikanu. Dzięki tej korzystnej metodzie ekstrakcji lumikanu możliwe jest uzyskanie podobnych stężeń białek, co skraca czas przetwarzania i czyni go wygodniejszym dla badaczy w porównaniu z poprzednimi badaniami16. Co więcej, ten lumican AME może być stosowany jako adiuwant w procesach naprawy rogówki i ponownego nabłonkowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (Projekt nr. CEI-2020/06/04). AM został uzyskany z banku owodniowego Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (od zdeidentyfikowanych ludzi), który jest przygotowany zgodnie z opisem Chávez-García et al.17.

1. Przygotowanie ekstraktu z błony owodniowej

  1. Zaopatrz się w 100 mg AM z banku owodni.
    UWAGA: Zgodnie z poprzednim raportem, 50 mg AM wydziela łącznie 10 ng/ml lumican14. Aby uzyskać wyższe stężenie lumikanu, należy użyć 100 mg AM, co odpowiada całkowitej powierzchni 32cm2.
  2. Jeśli AM jest zamrożony, rozmrozić go w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Poniższe procedury należy wykonać pod okapem z przepływem laminarnym klasy II B.
  3. Umyj AM na szalce Petriego z 10 ml sterylnie zbilansowanego roztworu soli (BSS, patrz tabela materiałów) przez 2 minuty.
    1. Wlej BSS do zlewki.
    2. Powtórz krok 3 i potwierdź wzrokowo, że podłoże glicerolowe nie jest obecne w szalce Petriego BSS.
      UWAGA: Powtórz krok 3. w razie potrzeby, aż do momentu, gdy podłoże glicerolowe nie będzie obecne w szalce Petriego BSS.
  4. Inkubować AM z 10 ml dypazy II (1,7 j.m./ml, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min.
    UWAGA: Dyspaza II jest neutralną proteazą o delikatnym działaniu na komórki nabłonka. Enzym ten skutecznie oddziela nienaruszony naskórek od skóry właściwej i izoluje nienaruszone arkusze nabłonka18.
  5. Po inkubacji dispazy wykonaj mechaniczną deepitelializację14 z gumowym policjantem (patrz Tabela Materiałów). Potwierdź denabłonkowość za pomocą wizualizacji mikroskopowej.
    UWAGA: Proces denabłonkowania potwierdza się w mikroskopie odwróconym przy użyciu obiektywów 4x i 20x. Wizualizuj tkankę, aby wykluczyć obecność jakiejkolwiek warstwy komórkowej.
  6. Myć AM na szalce Petriego z 10 ml BSS przez 2 min. Wlać BSS do zlewki.
  7. Umieść pozbawioną nabłonka AM (dAM) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Zanurz dAM w ciekłym azocie na 40 minut.
  8. Zamrożony dAM należy ręcznie mielić przez 2-3 minuty we wstępnie schłodzonej zaprawie w temperaturze -85 °C, aż do uzyskania drobnego proszku.
  9. W moździerzu rozpuścić proszek dAM z 2,5 ml roztworu inhibitora proteazy (BSS z inhibitorami proteazy).
    UWAGA: Każda tabletka inhibitora proteazy składa się z następującej mieszaniny enzymów: ekstraktu z trzustki (0,02 mg/ml), termolizyny (metaloproteazy) (0,0005 mg/ml), chymotrypsyny (0,002 mg/ml), trypsyny (0,02 mg/ml) i papainy (0,33 mg/ml) (patrz tabela materiałów).
  10. Zebrać mieszaninę za pomocą mikropipety i oczyścić ścianki zaprawy za pomocą noża do skalpela. Umieść mieszaninę w probówce o pojemności 5 ml.
  11. Dobrze wymieszaj z wirem przez 30 sekund.
  12. Homogenizować mieszaninę tkanek przez odwirowywanie przy 34 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i natychmiast odwirować przy 3360 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Zebrany supernatant to AME (Rysunek 1). Przechowuj 0,7 ml każdego AME w różnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml przez 6, 12, 20 i 33 dni w różnych warunkach temperaturowych -20 °C, 4 °C i temperaturze pokojowej (RT).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Proces przygotowania AME i pomiar stężenia lumikanu. 100 mg AM inkubowano z dypazą II w temperaturze 37 °C przez 30 minut i mechanicznie deepitelializowano. Pozbawioną nabłonka AM przemyto i zanurzono w ciekłym azocie na 40 minut, a następnie rozdrobniono do uzyskania drobnego proszku, który rozpuszczono w 2,5 ml buforu soli fizjologicznej z inhibitorami proteazy i odwirowano. Supernatant pobrano i przechowywano w temperaturze -20 °C, 4 °C i RT przez 6, 12, 20 i 32 dni do momentu ilościowego określenia całkowitej zawartości białka i lumikanu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Kterminyfikacja białka AME

UWAGA: Kwantyfikacja całkowitej ilości białka w AME musi być przeprowadzona natychmiast po zapotrzebowaniu. Określ ilościowo białka za pomocą testu białkowego Lowry'ego i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Zaleca się, aby wszystkie wzorce i próbki były oznaczane w trzech egzemplarzach.

  1. Pobrać pipetę 40 μl z każdej próbki AME do 96-dołkowej mikropłytki.
    1. Przygotować krzywą wzorcową na tej samej mikropłytce przy użyciu wzorca albuminy surowicy bydlęcej (BSA) dla końcowego stężenia BSA 0-1,500 μg/ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1,000 i 1,500 μg/ml).
  2. Odpipetować 200 μl zmodyfikowanego odczynnika Lowry'ego do każdego dołka. Natychmiast mieszaj na mikserze płytowym przez 30 sekund.
  3. Przykryj mikropłytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  4. Odpipetować 20 μL 1x odczynnika Folin-Ciocalteu do każdego dołka. Natychmiast wymieszaj na mikserze płytowym przez 30 s.
    UWAGA: Aby przygotować 1x odczynnik Folin-Ciocalteu, rozcieńczyć 2x (2N) odczynnik 1:1 w ultraczystej wodzie. Przygotować 1x odczynnik Folin-Ciocalteu w tym samym dniu użycia, w którym rozcieńczony odczynnik jest niestabilny.
  5. Przykryj mikropłytkę przed światłem folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Zmierzyć absorbancję próbek przy długości fali 660 nm w spektrometrze płytkowym ELISA (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Barwę można mierzyć przy długościach fal od 650 nm do 750 nm.
  7. Uśrednić wartość absorbancji 660 nm wzorcowych próbek ślepych i odjąć ją od innych wartości 660 nm próbek wzorcowych i nieznanych.
    1. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrometru płytkowego ELISA w trybie końcowym z niskim wstrząsem przez 10 s.
  8. Użyj krzywej wzorcowej, aby określić stężenie białka w każdej nieznanej próbce.
  9. W celu obliczenia białka należy określić stężenie na podstawie wykresu regresji liniowej, wykorzystując wartości absorbancji na osi Y w stosunku do stężeń w mg/ml na osi X każdej wzorcowej krzywej BSA.
    1. Uzyskaj równanie regresji liniowej i wartość r, aby obliczyć stężenie białka.
      UWAGA: Wyniki są wyrażone jako znormalizowane względne wartości stężenia białka całkowitego w stosunku do mg AM (μg/mL białka/mg AM tkanki).

3. Kwantyfikacja Lumican w AME

UWAGA: Stężenie lumikanu musi być mierzone w AME przechowywanym w różnych warunkach przechowywania i okresach czasu. Określ ilościowo lumican za pomocą testu SLIMA typu sandwich i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zaleca się, aby wszystkie wzorce i próbki były badane w dwóch egzemplarzach.

  1. Rozcieńczyć ludzkie przeciwciało wychwytujące lumikan (patrz tabela materiałów) do zastosowanego stężenia w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
    UWAGA: Fiolka z przeciwciałem do wychwytywania zawiera 120 μg przeciwciała. Po rozpuszczeniu w 0,5 ml PBS rozcieńczyć przeciwciało wychwytywane w roztworze roboczym o stężeniu 2 μg/ml.
    1. Natychmiast odpipetować 100 μl rozcieńczonego przeciwciała wychwytującego na 96-dołkową mikropłytkę na studzienkę. Zamknąć płytkę i inkubować ją przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać każdą studzienkę i przepłukać ją pipetując 300 μl buforu do płukania: 0,05% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu 20 w PBS, pH 7,2-7,4 (patrz tabela materiałów) za pomocą pipetora wielokanałowego. Powtórz trzy razy.
    UWAGA: Po ostatnim praniu usuń pozostały bufor do mycia, odrywając płytkę i delikatnie postukaj nią o ręczniki papierowe.
  3. Płytki blokowe przez dodanie 300 μl rozcieńczalnika odczynnika: 1% BSA w PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm przefiltrowane (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Powtórz krok 2.
  5. Przygotować wzorcową krzywą na 96-dołkowej mikropłytce, używając dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń od 0-8 000 pg / ml dla końcowych stężeń 125, 250, 500, 1 000, 2 000, 4 000 i 8 000 pg / ml. Zestaw ELISA lumican zawiera rekombinowany wzorzec lumikanu o stężeniu 75 ng (patrz tabela materiałów).
  6. Dodać 100 μl próbek i krzywą wzorcową do 96-dołkowej mikropłytki pokrytej przeciwciałem wychwytującym.
  7. Przykryć mikropłytkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy niskim poziomie mieszania w kompaktowym kołysce, utrzymując prędkość w zakresie 2-3 obr./min.
  8. Powtórz krok 2.
  9. Dodać 100 μl przeciwciała wykrywającego biotynylację (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Przykryć ze światła i inkubować 2 godziny przy temperaturze pokojowej z niskim mieszaniem w kompaktowym kołysce, utrzymując prędkość w zakresie 2-3 obr./min.
    UWAGA: Fiolka z przeciwciałami wykrywającymi biotynylację zawiera 24 μg przeciwciała. Po rozpuszczeniu w 1,0 ml rozcieńczalnika odczynnika rozcieńczyć przeciwciało wykrywające biotynylację w roztworze roboczym 400 ng/ml.
  10. Powtórz krok 2.
  11. Dodać 100 μl roboczego rozcieńczenia peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej (HRP, patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Przykryć mikropłytkę przed światłem i inkubować przez 20 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Reaktywna streptawidyna-HRP była 40-krotnie skoncentrowana. Roztwór roboczy 1x streptawidyny-HRP wykonano z rozcieńczalnikiem odczynnika.
    UWAGA: Unikaj umieszczania płyty w bezpośrednim świetle.
  12. Powtórz krok 2.
  13. Na koniec dodać 100 μl roztworu substratu tetrametylobenzydyny (TMB, patrz tabela materiałów) do każdej studzienki.
    UWAGA: Przygotować roztwór TMB z równą objętością 30% stabilizowanego roztworu nadtlenku wodoru dostarczonego w zestawie.
    UWAGA: Przygotuj roztwór bezpośrednio przed użyciem i utrzymuj go w temperaturze pokojowej.
  14. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.
    UWAGA: Unikaj umieszczania płyty w bezpośrednim świetle. Nie zasysać roztworu TMB, ponieważ nie jest potrzebne dalsze mycie.
  15. Dodać 50 μl roztworu 1N H2SO4 stop, aby zatrzymać reakcję kolorymetryczną. Delikatnie postukaj w płytkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
  16. Natychmiast określić absorbancję każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek ustawionych na 450 nm w spektrometrze płytkowym ELISA.
  17. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrometru płytkowego ELISA w trybie końcowym z niskim wstrząsem przez 10 s.
  18. Uśrednić wartość absorbancji 450 nm wzorcowych próbek ślepych i odjąć ją od innych wartości 450 nm próbek wzorcowych i nieznanych.
  19. Użyj krzywej standardowej, aby określić stężenie lumikanu w każdej nieznanej próbce.
  20. W celu obliczenia stężenia lumikanu należy wykonać wykres regresji liniowej, używając wartości absorbancji na osi Y w stosunku do stężeń w pg/ml na osi X każdej standardowej krzywej lumikan.
    1. Uzyskaj równanie regresji liniowej i wartości r, aby obliczyć stężenie lumikanu.
      UWAGA: Stężenie lumikanu zostało znormalizowane w stosunku do mg pobranej tkanki. Wyniki są wyrażone jako znormalizowane względne wartości stężenia lumikanu do mg AM (ng/ml lumikan/mg AM tkanka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki są podawane jako średnia wartość odchylenia standardowego (SD) ±. Przeprowadzono testy t-Studenta oraz analizę wariancji (ANOVA). Wartości P < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów).

Na całkowitą ilość białka w AME wpływ miał czas i warunki przechowywania. Podstawowe stężenie białka było podobne wśród wszystkich AME; zakres białka całkowitego wynosił...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy analizowano obecność lumikanu w AME i jego bezpośrednią korelację z jego stabilnością w różnych warunkach przechowywania. Co ciekawe, gdy określono ilościowo całkowite stężenie białka w AME, stężenie białka wzrosło po przechowywaniu. Dowody wskazują na trzy mechanizmy, które mogą zmieniać stężenie białka w zamrożonym przechowywaniu: denaturacja na zimno, zamrożone stężenie substancji rozpuszczonych i częściowe rozwijanie struktury białka wywołane lodem19. Proces zamrażania może ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało sfinansowane ze środków Programu Wsparcia Projektów Badawczych i Innowacji Technologicznych Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Grant No. PAPIIT IN203821) oraz Ministerstwa Edukacji, Nauki, Technologii i Innowacji (grant nr SECTEI 250/2019).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 N H2SO4 roztwór zatrzymującyR& D SystemsDY994
100 μ L mikropipetaEppendorf
1000 μ L MikropipetaEppendorf
15 mm szalka PetriegoSymlaboratorios
18 G Igła (1,2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 
Probówka do mikrowirówek 2 mlEppendorfZ606340
20 ml plastikowa strzykawka BD Becton Dickinson 
20 μ L mikropipetaEppendorf
20-200 μ L mikropipetaEppendorf
5 ml probówka do mikrowirówekEppendorf30119401
96-dołkowa mikropłytkaSARSTEDT821581
Folia aluminiowaniedotyczy
Membrana owodniowaInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Zrównoważony roztwór soliBausch + LombBSS-403802
ZlewkaN/AN/A
BioRender BioRender 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
kompletny, wolny od EDTA, inhibitor proteazy
tabletki koktajlowe		Roche11 873 580 001Inhibitor proteazy
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
Spektrometr płytkowy ELISAThermo Labsystems& nbsp;35401106
Zamrażarka
GraphPad Prism GraphPad Software, Incwersja 9analiza statystyczna i program graficzny 
Ludzki lumican DuoSet Zestaw ELISAR& D SystemsDY2846-05zawiera inkubator przeciwciał wychwytujących Lumican dla ludzi
 Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
Mikroskop ze światłem odwróconymOlympus 6A13921w celu potwierdzenia denabłonkowania  Mod.CK2
Okap z przepływem laminarnymForma Scientific 14753-567Mod.1184
Ciekły azotN/AN/A
Pipeta wielokanałowaEppendorf
Zbiornik azotuThermo ScientificMod. Biocan 20
Ręczniki papieroweN/AN/D
Sola fizjologiczna buforowana fosforanamiR& D SystemsDY006
Zestaw do oznaczania białek Lowry'ego modyfikowany przez PierceThermo Scientific23240
Uszczelniacze do płytR& D SystemsDY992
Rozcieńczalnik odczynnikaR& D SystemsDY9951% BSA w PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 i mu; m filtrowana
Wirówka z chłodzeniemcenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Gumowy skrobak do komórek policyjnychNEST710001do mechanicznej denabłonkalizacji
Nóż skalpelowyBraunBB521Nr 10 lub 21
Streptawidyna-HRP 40-krotnie skoncentrowany R& D Systemsczęść 893975
Substrate roztwór tetrametylobenzydyny (TMB)R& D SystemsDY999
Pęseta zębataInvent Germany6binox 
Woda ultraczystaPISA
Bufor do płukaniaR& D SystemsWA1260,05% Tween 20 w PBS, pH 7,2-7,4
305211302562 dotyczy Nie Projektowanie figurek Multiscan Zaprawa N/A N/A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
  2. Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
  3. Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
  4. Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479(2005).
  5. Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
  6. Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426(2017).
  7. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
  8. Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
  9. Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
  10. Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
  11. Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
  12. Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
  13. Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
  14. Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
  15. Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88(2005).
  16. Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
  17. Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
  18. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  19. Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
  20. McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292(2019).
  21. Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
  22. Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
  23. Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
  24. Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
  25. Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
  26. Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
  27. Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
  28. Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
  29. Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  30. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja bia ekepitelializacja rog wkimechaniczna deepitelializacjainhibitory proteazzamra anie w ciek ym azocietechnika wirowaniaekstrakt z b ony p odowej

Powiązane artykuły