To badanie opisuje technikę tworzenia modelu szczura z krzemicą z wdychaniem krzemionki przez całe ciało w komorze inhalacyjnej. Szczury z krzemicą mogą ściśle naśladować patologiczny proces krzemicy u ludzi w łatwy, opłacalny sposób z dobrą powtarzalnością.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustalenie modelu szczura krzemicy poprzez wystawienie całego ciała na działanie krzemionki respirabilnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Główną przyczyną krzemicy jest wdychanie krzemionki w środowisku pracy. Pomimo pewnych różnic anatomicznych i fizjologicznych, modele gryzoni nadal są niezbędnym narzędziem do badania ludzkiej krzemicy. W przypadku krzemicy klasyczny proces patologiczny musi być indukowany poprzez wdychanie świeżo wytworzonych cząstek kwarcu, co oznacza w szczególności wywoływanie chorób zawodowych u ludzi. W badaniu tym opisano technikę ustalania i skutecznego naśladowania patologicznego dynamicznego procesu ewolucji krzemicy. Co więcej, technika charakteryzowała się dobrą powtarzalnością i nie wymagała operacji. System narażenia inhalacyjnego został wyprodukowany, zwalidowany i wykorzystany do badań toksykologicznych nad wdychaniem cząstek respirabilnych. Krytyczne elementy były następujące: (1) generator suchego proszku SiO2 wyregulowany za pomocą regulatora przepływu powietrza; 2) komora do inhalacji całego ciała o powierzchni 0,3m3, mieszcząca do 3 dorosłych szczurów; (3) system monitorowania i kontroli do regulacji stężenia, temperatury, wilgotności i ciśnienia tlenu w czasie rzeczywistym; oraz (4) bariery i system usuwania odpadów w celu ochrony techników laboratoryjnych i środowiska. Podsumowując, obecny protokół informuje o wdychaniu przez całe ciało, a komora inhalacyjna stworzyła niezawodny, rozsądny i powtarzalny model krzemikotu szczurów o niskiej śmiertelności, mniejszych obrażeniach i większej ochronie.
Wprowadzenie
Krzemica, która jest spowodowana wdychaniem krzemionki, jest najpoważniejszą chorobą zawodową w Chinach, stanowiącą ponad 80% całkowitej liczby zgłoszeń chorób zawodowych każdego roku1. Etiologia krzemicy jest jasna i można jej zapobiegać i ją kontrolować, ale nie jest dostępna żadna skuteczna metoda leczenia2. Wiele leków zostało udowodnionych w badaniach podstawowych, ale mają one nieprecyzyjne efekty kliniczne3,4. Dlatego patologiczne i fizjologiczne mechanizmy krzemicy nadal wymagają zbadania.
Wiele badań używało jednorazowego wlewu krzemionki do tchawicy szczurów lub myszy w celu zbadania patogenezy krzemicy5,6. Chociaż te modele krzemicotyczne gryzoni można było uzyskać w krótkim czasie7, metody te nadal wiązały się z wyzwaniami, takimi jak trauma zwierząt i wysoka śmiertelność. Niektóre badania polegały na wkraplaniu zmagazynowanej krzemionki do płuc w celu wywołania niespecyficznej reakcji płuc, ale nie wspominały o guzkach krzemionki u myszy8. Ponadto, z dala od ostrej krzemicy, przewlekłe narażenie na krzemionkę w środowisku zawodowym wywołało znacznie niższy stan zapalny płuc i podniosło poziom markerów antyapoptotycznych, a nie markerów proapoptotycznych, w płucach9. Dlatego potrzebny jest wiarygodny, rozsądny i powtarzalny model zwierzęcy, aby dokładniej zbadać patogenezę krzemicy.
Niniejsze badanie opisuje metodę naśladowania procesu chorobowego u pacjentów z krzemicą poprzez wdychanie krzemionki przez całe ciało, cząsteczki dostarczane powietrzem w komorze inhalacyjnej, która składała się z generatora krzemionki dostarczanego powietrzem, komory całego ciała i systemu usuwania odpadów. Ta metoda jest prosta, łatwa w obsłudze i skutecznie naśladuje patologiczny dynamiczny proces ewolucji krzemicy. Za pomocą tej metody zidentyfikowano również wiele możliwych mechanizmów i patogenezę krzemicy10,11,12. Oczekuje się, że proponowany protokół pomoże w dalszych badaniach w pokrewnej dziedzinie badań nad krzemicą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals z USA i zatwierdzone przez Komitet Etyki North China University of Science and Technology (kody protokołów zatwierdzenia: LX2019033 oraz 2019-3-3). W niniejszym badaniu wykorzystano samce szczurów Wistar w wieku 3 tygodni. Wszystkie szczury utrzymywano w klatkach statycznych z trocinami. Zwierzęta przebywały w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności (12 h/12 h) i miały dostęp do pokarmu oraz wody ad libitum. Eksperymenty obserwacyjne przeprowadzono po 1 tygodniu karmienia adaptacyjnego.
1. Przygotowanie zwierząt
- Po przyjeździe umieścić wszystkie szczury w pomieszczeniu wolnym od patogenów swoistych (SPF).
- Zdrowe szczury podzielić losowo na dwie grupy (n = 10): grupę kontrolną wdychającą czyste powietrze oraz grupę szczurów z pylicą krzemową wdychającą krzemionkę.
2. Przygotowanie krzemionki
OSTRZEŻENIE: Wdychanie pyłu krzemionkowego może uszkodzić płuca. W związku z tym podczas prac należy stosować kombinezony, rękawice medyczne oraz maski ochronne (N95).
- Przed każdą ekspozycją rozcieraj cząsteczki krzemionki (patrz Tabela materiałów) w moździerzu agatowym przez 1,5 h. Wynika to z faktu, że świeżo rozkruszony kwarc generuje większą ilość aktywnych form tlenu niż kwarc starej daty13, a krzemionka o średnicy 1-5 µm jest najbardziej patogenna.
- Po rozcieraniu odważ krzemionkę (30 g) za pomocą wagi elektronicznej, umieść ją w szklanym pojemniku i wypalaj w temperaturze 180 °C przez 6 h w elektrycznej suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza (patrz Tabela materiałów), aby usunąć patogeny z powierzchni cząsteczek krzemionki.
3. Narażenie szczurów na krzemionkę
- Podłącz system wtrysku i dostępne komercyjnie systemy generatora (patrz Tabela materiałów) i umieść krzemionkę (30 g) w generatorze. Sprawdź, czy przewody połączeniowe są sprawne, czy przewód zasilający jest podłączony i czy zasilanie jest prawidłowe.
- Ręcznie sprawdź poziom wody w wieży natryskowej oraz w nawilżaczu urządzenia do oczyszczania gazów odlotowych (patrz Tabela materiałów) i dolej wody, jeśli jej poziom jest niewystarczający (poniżej linii standardowej).
- Dolej wodę z kranu do wieży natryskowej urządzenia do oczyszczania gazów odlotowych oraz wodę destylowaną do nawilżacza (Rysunek 1).
- Włącz urządzenie do odprowadzania gazów wylotowych (patrz Tabela materiałów) oraz przełącznik źródła powietrza, aby potwierdzić, czy wewnątrz kabiny osłonowej panuje podciśnienie.
- Upewnij się, że zawory mieszania cieczy, mieszania proszków, przepływu czystego gazu oraz zawór odpływu ścieków pod komorą inhalacyjną są zamknięte.
- Umieść łącznie 10 szczurów w komorze inhalacyjnej (patrz Tabela materiałów), a następnie zamknij przedział inhalacyjny oraz drzwi kabiny osłonowej.
- Ustaw następujące parametry eksperymentalne na panelu instrumentu lub w komputerze: ciśnienie w kabinie: -50 do -30 Pa; stężenie tlenu: 21%; temperatura w kabinie: 26-30 °C; wilgotność: 30%-70%; szybkość wprowadzania pyłu: 2,0-2,5 mL/min; stężenie pyłu w kabinie: 60 ± 5 mg/m3.
UWAGA: Przez cały czas trwania eksperymentu stale monitoruj dane eksperymentalne i stan sprzętu. W przypadku pojawienia się alarmu o awarii sprzętu należy niezwłocznie podjąć odpowiednie działania.- Poddawaj każde zwierzę ciągłej ekspozycji na krzemionkę przez 3 h dziennie, 5 dni w tygodniu; zwierzęta w grupie kontrolnej powinny wdychać czyste powietrze.
- Po zakończeniu eksperymentu zamknij zawór przepływu mieszaniny gazów i otwórz zawór przepływu czystego gazu. Wtryskuj czysty gaz w sposób ciągły do komory inhalacyjnej.
UWAGA: W niniejszym badaniu czysty gaz (przepływ 7,0-7,5 m3/h) wtryskiwano przez co najmniej 20 min, aż do całkowitego zastąpienia gazów toksycznych w komorze inhalacyjnej.- Zamknij zawór przepływu czystego powietrza, otwórz drzwi, wyjmij szczury i przenieś je z powrotem do pomieszczenia wolnego od patogenów.
- Koleno po kolei wyjmij stojak dla szczurów oraz elementy rur rozdzielczych i umieść je w zlewie w celu oczyszczenia. Po wypłukaniu zamknij automatyczny zawór czyszczący i otwórz klapę.
- Przetrzyj wewnętrzną ściankę czystą szmatką lub włącz dopływ czystego gazu, aby osuszyć zbiornik. Na koniec przeprowadź dezynfekcję. Po oczyszczeniu i zdezynfekowaniu 75% etanolem zamknij wylot gazów i jak najszybciej lekko uchyl drzwi kabiny inhalacyjnej, aby odparować wilgoć, tak aby wnętrze kabiny pozostało suche.
- Dwa razy w tygodniu sprawdzaj stężenie krzemionki w kabinie za pomocą kompleksowego próbnika atmosferycznego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów), aby zapewnić stabilność stężenia krzemionki podczas eksperymentu. Przed pobraniem próbek skalibruj próbnik atmosferyczny.
- Do oznaczenia grawimetrycznego użyj cyfrowej wagi analitycznej z jedną szalką. Obliczone stężenie krzemionki wynosiło 65 mg/m3 (Rysunek 1 i Tabela 1).
UWAGA: Zważ papier filtracyjny przed i po absorpcji krzemionki. Stężenie krzemionki obliczono według następującego wzoru12:
gdzie W2 = masa papieru filtracyjnego po pobraniu próbki, W1 = masa papieru filtracyjnego przed pobraniem próbki, a V = objętość powietrza.
- Do oznaczenia grawimetrycznego użyj cyfrowej wagi analitycznej z jedną szalką. Obliczone stężenie krzemionki wynosiło 65 mg/m3 (Rysunek 1 i Tabela 1).
4. Pobieranie i utrwalanie tkanek płuc
- Uśmierć szczury poprzez wewnątrzbrzuszne wstrzyknięcie pentobarbitalu (100 mg/kg masy ciała) i lidokainy (4 mg/kg masy ciała). Potwierdź śmierć poprzez stwierdzenie braku bicia serca14.
- Po zakończeniu eksperymentu utrwal prawy dolny płat płuca, nerkę, wątrobę, śledzionę i kość w 4% paraformaldehydzie przez co najmniej 24 h, zatop w parafinie i wykonaj przekroje o grubości 5 µm7,15.
5. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
- Deparafinizować skrawki parafinowe w ksylolu (patrz Tabela materiałów) dwukrotnie po 10 min każdego razu16, a następnie rehydratować w 100% etanolu, 95% etanolu, 90% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej przez 3 min w każdym z tych roztworów.
- Barwić skrawki hematoksyliną (patrz Tabela materiałów) przez 5 min, a następnie przemyć skrawki wodą10.
- Umieścić skrawki w 2% alkoholu solnocłowym, a następnie w wodzie destylowanej do momentu zmiany barwy na niebieską.
- Barwić skrawki eozyną przez 1 min, odwodnić je 95% etanolem, przejrzyć w ksylenie, zamknąć w gumie neutralnej i poddać obserwacji pod mikroskopem świetlnym12.
6. Barwienie immunohistochemiczne
- Regularnie płucz skrawki parafinawe w wodzie.
- Ujawń antygeny pod wysokim ciśnieniem (60 kPa) i w wysokiej temperaturze (100 °C) przez 80 s, a następnie zablokuj endogenne peroksydazy przy użyciu blokera endogennej peroksydazy (3%) przez 15 min w celu ich wyeliminowania7.
- Inkubuj próbki z przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD68 (rozcieńczenie 1:200 – dodaj 4 µL CD68 do 396 µL rozcieńczalnika przeciwciał; patrz Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.
- Inkubuj próbki z przeciwciałem wtórnym (polimer anty-mysi IgG z koziego białka sprzężony z HRP; patrz Tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 30 min, a następnie płucz próbki w 1x PBS.
- Wizualizuj immunoreaktywność za pomocą 3,3-diaminobenzydyny (DAB; patrz Tabela materiałów). Po nałożeniu DAB na tkankę obserwuj barwienie tkanki pod mikroskopem świetlnym10.
UWAGA: Czas barwienia różnił się od kilku sekund do kilku minut, w zależności od czasu barwienia tkanki. Procedurę barwienia przerywano poprzez przeniesienie skrawków do wody. W niniejszym badaniu brązowe barwienie tkanki oznaczało pozytywną ekspresję CD68. Wszystkie przeciwciała rozcieńczono w 1x PBS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zastosowanie proponowanej metody pozwoliło na zbadanie potencjalnych mechanizmów oraz patogenezy krzemicy u szczurów. Schemat komory inhalacyjnej przedstawiono na Rysunku 1. Komora składała się z generatora krzemionki z dopływem powietrza, komory dla całego ciała oraz systemu utylizacji odpadów, zgodnie z wcześniejszym opisem17. Funkcje płuc, poziomy czynników zapalnych w surowicy i płucach, odkładanie kolagenu oraz różnicowanie miofibroblastów zostały opisane w poprz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jako główna przyczyna krzemicy, krzemionka odgrywa decydującą rolę w formowaniu. Cząsteczki krzemionki wdychane przez pacjentów z pylicą płuc są świeżymi, wolnymi cząstkami krzemionki wytwarzanymi przez cięcie mechaniczne. Krzemionka może wytwarzać reaktywne formy tlenu bezpośrednio na świeżo rozszczepionych powierzchniach cząstek lub pośrednio poprzez wpływ na makrofagi25. Dlatego mielenie cząstek krzemionki ma duże znaczenie. W proponowanym protokole krzemionka była mielona zaprawą agatową przez...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82003406), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hebei (H2022209073) oraz Projekt Nauki i Technologii Departamentu Edukacji Hebei (ZD2022127).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Detektor powietrza (próbnik sprężającego powietrza) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Stół | Żadna konkretna marka nie jest zalecana. | ||
| Przeciwciało CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Elektryczna suszarka powietrzna do ogrzewania | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Waga elektroniczna | OHRUS | ||
| Maszyna do zatapiania | leica | ||
| Urządzenie do odprowadzania spalin | NADZIEJA Przemysł i Handel Co., Sp. z o.o. | ||
| Systemy generatorów | NADZIEJA Przemysł i Handel Co., Sp. z o.o. | ||
| Rękawice (cienkie rękawice laboratoryjne) | secco medical | ||
| Hematoxylin i eozyna | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 aparatura do kontroli ekspozycji | HOPE Industry and Trade Co., Ltd. | ||
| Komora inhalacyjna | NADZIEJA Przemysł i Handel Co., Sp. z o.o. | ||
| Strzykawka | Żadna konkretna marka nie jest zalecana. | ||
| Mikroskop świetlny | olympus | ||
| Object slide | shitai | ||
| PV-6000 (polimer anty-mysi IgG sprzężony z HRP) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd | s5631 | |
| Dwutlenek krzemu | Sigma-Aldrich | ||
| Krajalnica | Leica | RM2255 | |
| Urządzenie do oczyszczania gazów odlotowych | HOPE Industry and Trade Co., Ltd. | ||
| Mokre pudełko | Spółdzielnia wyrobów z tworzyw sztucznych Fabryka | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
Bibliografia
- Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114(2019).
- The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283(2019).
- Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
- Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162(2021).
- Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656(2022).
- Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
- Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408(2020).
- Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
- Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
- Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
- Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301(2012).
- Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
- Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
- Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
- Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
- Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
- Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
- Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
- Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
- Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
- Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
- Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251(2022).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063(2021).
- Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
- Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
- Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
- Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
- Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
