Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Podsumowanie

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Streszczenie

Ten artykuł przedstawia protokół ze szczegółowymi opisami do efektywnego oczyszczania próbek z białek o niskiej obfitości z suszonych próbek. Odbywa się to za pomocą proteolizy opartej na kulkach przed wychwytywaniem peptydów proteotypowych i oznaczaniem tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS / MS). Procedurę można zastosować zarówno do konwencjonalnych suszonych próbek przy użyciu kart papierowych (np. wysuszonych plamek krwi [DBS] i wysuszonych plam surowicy [DSS]), jak i próbek pobranych za pomocą nowszych metod pobierania próbek, takich jak wolumetryczne absorpcyjne mikropobieranie próbek (VAMS). Oprócz opisania tej procedury, w niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku przygotowanie zarówno kulek trypsynowych, jak i kulek pokrytych przeciwciałami. Zaletami przedstawionej procedury są efektywna czasowo proteoliza przy użyciu kulek oraz selektywne, solidne oczyszczanie za pomocą wychwytywania powinowactwa peptydów. Obecna procedura opisuje oznaczanie biomarkera drobnokomórkowego raka płuca o niskiej liczebności (SCLC), peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP), w wysuszonej surowicy (zarówno DSS, jak i VAMS). Szczegółowe procedury przygotowania ściegu ułatwiają wdrożenie przepływu pracy w nowych aplikacjach lub innych laboratoriach. Wykazano, że wyniki mogą być zależne od materiału do pobierania próbek; W przypadku niniejszego projektu zaobserwowano wyższe natężenie sygnału w próbkach pobranych za pomocą VAMS w porównaniu z DSS.

Wprowadzenie

Mikropróbkowanie istnieje od ponad 100 lat, odkąd Ivar Bang opisał monitorowanie poziomu glukozy za pomocą DBS w 1913 roku¹. Po tym, jak Guthrie i Susi wprowadzili DBS w 1963 roku do oznaczania fenyloalaniny u noworodków², technika ta stała się coraz bardziej rozpowszechniona. Pierwsze doniesienia o DBS do pobierania próbek i przechowywania białek pojawiły się na początku lat siedemdziesiątych XX wieku^3,4, a dekadę później, w latach 80., znaleźliśmy pierwszy raport ze spektrometrii mas (MS) do oznaczania białek z DBSs⁵. Pomimo tego wczesnego wprowadzenia, dopiero na przełomie wieków oznaczanie białek z DBS i inne techniki mikropróbkowania za pomocą stwardnienia rozsianego stały się bardziej rozpowszechnione.

W kontekście klinicznym, interesujące jest określenie białek w diagnozie i obserwacji chorób, jak również do monitorowania leczenia i celów dopingowych. To ukierunkowane oznaczanie analitów białkowych przez MS z małych ilości suszonych próbek jest nadal wyzwaniem i często wymaga intensywnego przygotowania próbki przed analizą.

Ukierunkowane ilościowe oznaczanie białek przez MS jest zwykle wykonywane poprzez zastosowanie podejścia oddolnego, trawiąc białka do peptydów przed analizą. Procedura ta wytwarza niezliczoną ilość peptydów, co sprawia, że bezpośrednia analiza strawionej próbki biologicznej jest wyzwaniem. Sposobem na obejście tego problemu jest zastosowanie selektywnego kroku oczyszczania powinowactwa przed analizą MS przed lub po trawieniu^6,7,8. W ten sposób białko będące przedmiotem zainteresowania (lub jego peptyd proteotypowy, jeśli etap wychwytywania powinowactwa jest wykonywany po trawieniu) jest selektywnie izolowane z matrycy próbki przed analizą, co zapewnia niższe granice wykrywalności⁹.

Mikropróbkowanie za pomocą kart DBS ma pewne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami krwi, w tym małą objętość próbki, mniej inwazyjne pobieranie próbek i zwiększoną stabilność przechowywania. Jednak matryca próbki jest inna i może wprowadzać inne wyzwania w analizie (np. sucha i płynna matryca próbki oraz krew włośniczkowa a surowica lub osocze)^10,11. Innym wyzwaniem, które obserwuje się w przypadku DBS, jest tak zwany efekt hematokrytu, w którym hematokryt krwi wpływa na objętość próbki dalej przetwarzanej do analizy, a tym samym wprowadza zmienność międzyosobniczą w analizie¹². Nowsze urządzenia do mikropróbkowania, takie jak VAMS wprowadzone w 2014 roku¹³, rozwiązują ten problem, pobierając stałą objętość krwi zamiast kropli krwi.

Ten protokół opisuje konfigurację do analizy biomarkerów o niskiej obfitości z suszonych mikropróbek. Po elucji wysuszona próbka jest trawiona, a następnie peptyd protetypowy jest izolowany przez wychwytywanie powinowactwa peptydowego. Analitem modelowym jest biomarker SCLC ProGRP. Ponieważ ProGRP nie można wiarygodnie oznaczyć z krwi pełnej, jako matrycę próbki użyto surowicy. Przedstawiono reprezentatywne wyniki zarówno dla DSS, jak i próbek surowicy pobranych za pomocą VAMS.

Protokół

Surowica od zdrowych dawców krwi została użyta do przygotowania roztworów wzorcowych. Stosowanie surowicy od zdrowych dawców krwi odbywało się w ścisłej zgodności z norweskim prawem. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników. Próbki surowicy analizowano metodami zgodnymi z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Opisany protokół jest zmodyfikowaną wersją metody opisanej w poprzednim work¹⁴. Przegląd składu i roztworów oraz sposobu ich przygotowania znajduje się w tabeli uzupełniającej S1, natomiast tabela materiałów zawiera materiały, sprzęt i odczynniki stosowane w tym protokole.

1. Przygotowanie kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami

1. Oblicz ilość przeciwciała niezbędną do przygotowania żądanej liczby koralików. Stosować 1 mg przeciwciała na 50 mg kulek magnetycznych.
   UWAGA: Zazwyczaj w kolejnych doświadczeniach stosuje się 20 μl zawiesiny kulek o stężeniu 20 mg/ml na próbkę (patrz krok 5.1).
2. Oblicz objętość przeciwciała niezbędną do przygotowania żądanej liczby kulek.
   UWAGA: Objętość przeciwciała zależy od stężenia przeciwciał i należy ją obliczyć dla każdego przeciwciała.
3. Przenieść żądaną objętość roztworu przeciwciała do probówki wirówkowej o pojemności 5 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych. Na przykład, jeśli roztwór przeciwciała zawiera 1 mg/ml przeciwciała, użyj 0,4 ml do przygotowania 1,0 ml zawiesiny kulek (20 mg kulek/ml z 1 mg przeciwciała/50 mg kulek).
   UWAGA: Przeciwciała powinny znajdować się w buforze wolnym od amin. Do wszystkich roztworów zawierających białka należy używać probówek wirówkowych o niskiej wiązalności białek, aby uniknąć utraty analitu w wyniku adsorpcji.
4. Dodaj małe mieszadło magnetyczne do roztworu przeciwciała i dostosuj pH do 2,5 przy ciągłym mieszaniu. Użyj pH-metru z mikroelektrodą, aby zmierzyć pH i dostosować pH poprzez stopniowe dodawanie określonych objętości 1,0 M HCl (zacznij od dodania 10 μl porcji 1,0 M HCl i zmniejszaj objętość, gdy pH zbliża się do 2,5). Zanotować całkowitą objętość 1,0 M HCl niezbędną do dostosowania pH do 2,5.
5. Wyjąć mikroelektrodę i inkubować zakwaszone przeciwciało na lodzie na mieszadle magnetycznym przez 1 h.
   UWAGA: Kwasowe traktowanie przeciwciała przeprowadza się w celu promowania prawidłowej orientacji przeciwciał na kulce. Stężenie HCl można zmniejszyć do 0,5 M lub 0,2 M HCl, w zależności od stężenia buforu w roztworze przeciwciała.
6. Zneutralizować roztwór przeciwciała. Użyj pH-metru z mikroelektrodą do pomiaru pH i dostosuj pH do 7 poprzez stopniowe dodawanie określonych objętości 1,0 M NaOH (zacznij od porcji 10 μl i zmniejszaj objętość, gdy pH zbliża się do 7). Zapisać całkowitą objętość 1,0 M Dodanego NaOH.
   UWAGA: Stężenie NaOH powinno być takie samo jak stężenie HCl użyte w kroku 1.4. NaOH jest silnie; Używaj sprzętu ochronnego, w tym rękawic i odpowiedniej ochrony oczu.
7. Oblicz żądaną objętość kulek magnetycznych aktywowanych tozylem, które należy zastosować.
   UWAGA: Zazwyczaj zaleca się stosowanie kulek 20 mg/ml podczas łączenia na małą skalę. Należy użyć co najmniej 5 mg kulek.
8. Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych na mieszalniku wirowym i pobierz objętość zawierającą żądaną ilość zawiesiny kulek. Na przykład, aby przygotować 1 ml zawiesiny kulek, należy pobrać objętość zawierającą 20 mg kulek (667 μl, jeśli stężenie kulek wynosi 30 mg/ml).
9. Umieść zawiesinę ściegu na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usuń supernatant. Umyj kulki 2x równą objętością Typ_{1 H2}O (667 μL, jeśli stosuje się roztwór kulek o stężeniu 30 mg/ml do przygotowania 1 ml kulek pokrytych przeciwciałami o stężeniu 20 mg/ml). Wymieszać za pomocą mieszadła wirowego po każdym dodaniu roztworu myjącego i umieścić na ruszcie magnetycznym na 1 minutę przed usunięciem supernatantu.
10. Do kulek magnetycznych dodać następujące elementy: przeciwciało poddane działaniu kwasu, 0,5 M buforu boranowego (pH 9,5) (1/5 całkowitej objętości, ponieważ końcowe stężenie powinno wynosić 0,1 M; odpowiada to 0,2 ml w celu przygotowania 1 ml zawiesiny kulek) i bufor sprzęgający do sprzężenia przeciwciał (aby przygotować 1 ml kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem, objętość buforu sprzęgającego powinna być równa 1 ml - objętość przeciwciała poddanego działaniu kwasu - 0,2 ml buforu boranowego). Wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego.
    UWAGA: Objętość przeciwciała potraktowanego kwasem jest równa objętości roztworu przeciwciała (0,4 ml w przygotowaniu 1 ml zawiesiny kulek przy użyciu 1 mg/ml roztworu przeciwciała) + objętość 1,0 M HCl użytej do dostosowania pH do 2,5 + objętość 1,0 M NaOH użytej do dostosowania pH do 7).
    UWAGA: Skład 0,5 M buforu boranowego (pH 9,5) i buforu sprzęgającego do sprzęgania przeciwciał można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1.
11. Obracać w temperaturze otoczenia przez noc za pomocą mieszalnika próbek typu end-over-end, najlepiej z obrotem posuwisto-zwrotnym i wibracjami.
12. Wirować przez 10 minut w temperaturze 239 × g. Umieść rurkę na magnesie na 2 minuty i usuń supernatant.
13. Przemyć kulki 2 x 2 godziny i raz na noc, obracając je w buforze do przechowywania kulek przeciwciał w temperaturze otoczenia za pomocą mieszalnika do próbek typu "koniec po końcu". Użyj tego samego woluminu, co całkowity wolumin w kroku 1.10. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i usuń supernatant między każdym praniem.
    UWAGA: Skład buforu do przechowywania kulek przeciwciał znajduje się w tabeli uzupełniającej S1.
14. Przechowywać w żądanym buforze (np. tym samym buforze, co w kroku 1.13), używając żądanego stężenia kulek (zwykle 20 mg/ml). Przechowywać w lodówce.

2. Przygotowanie 2 ml kulek immobilizowanych trypsyną (20 mg/mL kulek)

1. Dodaj 20 ml 1 mM HCl do 2 ml kulek agarozy aktywowanych przez NHS, aby umyć kulki.
2. Mieszać i odwirowywać w stężeniu 2,655 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
3. Dodać 20 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,8). Mieszać za pomocą mieszalnika wirowego i odwirowywać w ilości 2 655 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
   UWAGA: Skład 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,8) można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1.
4. Dodać 2 ml 20 mg/ml trypsyny (rozpuszczonej w zimnym buforze sprzęgającym do sprzęgania trypsyny).
   UWAGA: Skład bufora sprzęgającego do sprzęgania trypsyny można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.
5. Inkubować przez 25 minut w temperaturze 22 °C i prędkości 1 100 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze. Wirować przy 2 655 × g przez 5 min. Usunąć supernatant.
6. Dodać 2 ml buforu modyfikującego do przygotowania kulek trypsyny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 22 °C i 1 100 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze. Wirować przy 2 655 × g przez 5 min. Usunąć supernatant.
   UWAGA: Skład buforu modyfikującego do otrzymywania kulek trypsyny znajduje się w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.
7. Dodać 10 ml buforu blokującego do przygotowania kulek trypsyny i inkubować przez 10 minut w temperaturze 22 °C i 1 100 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze. Wirować przy 2 655 × g przez 5 min. Usunąć supernatant.
   UWAGA: Skład buforu blokującego do przygotowania kulek trypsyny znajduje się w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.
8. Dodaj 2 ml bufora do przechowywania, wymieszaj za pomocą miksera wirowego i przechowuj w lodówce do czasu użycia.
   UWAGA: Skład bufora do przechowywania kulek trypsyny można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.

3. Pobieranie próbek DSS/VAMS i późniejsza ekstrakcja wysuszonej surowicy

1. Przygotuj wzorce, dodając do surowicy ProGRP (lub interesujące Cię białko) na odpowiednim poziomie. Utrzymuj objętość skoku ≤ 1% całkowitej objętości.
   UWAGA: W tym przypadku do przygotowania wzorców surowicy z dodatkiem wzbogaconych użyto roztworu podstawowego 295 μg/ml ProGRP w wodzie.
2. Wymieszaj standardy na mieszalniku wirowym.
3. Nanieść 10 μl surowicy (wzorce z dodatkami) na karty DBS lub pozwolić na zebranie 10 μl surowicy za pomocą VAMS (10 μL) zgodnie z wytycznymi producenta. W przypadku DSS upewnij się, że miejsce znajduje się w przerywanym okręgu.
4. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze otoczenia przez co najmniej 2 godziny.
5. Wyciąć całe miejsce i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml o niskiej zawartości wiązania białek lub wyjąć VAMS z uchwytu i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml o niskiej zawartości białka wiążącej białka.
6. Dodać 1 000 μl 100 mM roztworu wodorowęglanu amonu (ABC). Ekstrahować wysuszoną surowicę z miejsca/VAMS przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C za pomocą mieszalnika o regulowanej temperaturze przy 1 000 obr./min.
7. Przenieś ekstrakt do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych w celu proteolizy tryptycznej.

4. Trawienie ekstraktów DSS/VAMS

1. Na próbkę należy użyć 30 μl kulek trypsyny (przygotowanych w sekcji 2). Przenieść objętość zawierającą kulki trypsyny dla wszystkich próbek do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania białek, odwirować przy 2,655 × g przez 5 minut i usunąć supernatant.
2. Przemyj kulki trypsyny 2x 1 ml zimnego 50 mM ABC, a następnie ponownie wymieszaj w tej samej objętości, która została odpipetowana. Odwirować przy 2,655 × g przez 5 minut i usunąć supernatant między etapami.
3. Dodaj 30 μl umytych kulek trypsyny do każdego ekstraktu DSS/VAMS, aby zainicjować trawienie.
4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 1 000 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze lub podobnego urządzenia. Odwirować przy 2,655 × g przez 5 minut i przenieść supernatant (nie kulki) do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych.
5. Dodać 25 μl roztworu wzorca wewnętrznego (IS) o stężeniu 14 ng/ml zawierającego peptyd ALGNQQPSWDSEDSSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂] w 100 mM roztworze ABC.

5. Wychwyt proteotypowego peptydu ProGRP za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami

1. Użyć 20 μl kulek pokrytych przeciwciałem (20 mg/ml, jak przygotowano w sekcji 1) na ekstrakcję. Przenieś wszystkie kulki pokryte przeciwciałami do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania białek, umieść na magnesie na 1 minutę i wyjmij bufor do przechowywania.
2. Przemyć kulki pokryte przeciwciałami magnetycznymi 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 i 2 x 1 ml PBS przed ponownym wymieszaniem w tej samej objętości, która została odpipetowana. Wymieszać na mieszalniku wirowym i umieścić na magnesie na 1 minutę między wymianami.
   UWAGA: PBS zawiera 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ i 1,8 mM KH₂PO₄. Zaleca się przygotowanie roztworu o stężeniu 10x w celu zwiększenia stabilności. Skład 100 ml 10x PBS znajduje się w tabeli uzupełniającej S1. Rozcieńczenie 10x PBS 10x pozwoli osiągnąć pH ~7,4.
3. Dodać 20 μl przemytej zawiesiny kulek magnetycznych do każdej probówki mikrowirówki o niskiej zawartości wiązania białek, zawierającej strawiony ekstrakt DSS/VAMS i IS. Przeprowadzać immunoekstrakcję przez 1 godzinę przy użyciu mieszalnika próbek typu end-over-end w temperaturze otoczenia.
4. Umyj kulki magnetyczne za pomocą następujących roztworów: 500 μL PBS z 0,05% (v/v) polisorbatem 20, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) i 300 μL 100 mM ABC.
   1. Po dodaniu każdego roztworu do mycia wyjąć rurkę wirówkową z kulkami i roztworem myjącym o niskiej zawartości białek ze stojaka magnetycznego i ostrożnie odwrócić, aż do uzyskania jednorodności. Następnie umieść probówkę mikrowirówkową o niskiej zawartości wiązania białek na magnesie na 30 s, odwróć na 30 s i umieść na magnesie na 1 min. Usuń roztwór myjący.
   2. Pozostałą zawiesinę odwirować za pomocą mikrowirówki. Umieść na magnesie na 1 minutę i usuń pozostały roztwór myjący.
5. Dodać 15 μl 2% (v/v) kwasu mrówkowego w typie 1 H₂O do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze 22 °C i 1 000 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze lub podobnego, w celu wymycia wychwyconych peptydów. Umieść na magnesie na 1 minutę i przenieś eluat do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych. Powtórzyć raz i przenieść drugi eluat do tej samej probówki mikrowirówkowej o niskiej wiązalności białek, co pierwszy eluat.
6. Dodać 20 μl 100 mM ABC do każdego eluatu (całkowita objętość 50 μl).
7. Odwirować (mikrowirówkę) i przenieść 40 μl eluatu do mikrowkładek do fiolek z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC).

6. Analiza przez LC-MS/MS

1. Użyj mikro LC potrójny kwadrupol MS z jonizacją elektrorozpylającą, aby uzyskać wysoką wytrzymałość.
2. Przygotować system LC-MS/MS do analizy, przepłukując pompy fazą ruchomą A (20 mM FA w_H2Oi MeCN, 95:5 v/v) i B (20 mM FA w_H2Oi MeCN, 5:95 v/v).
3. Włożyć kolumnę analityczną (C18, średnica wewnętrzna 50 mm x 1 mm [ID], cząstki 3 μm).
4. Należy kontynuować przygotowanie instrumentu do analizy, postępując zgodnie z procedurami uruchamiania dla danego instrumentu.
5. W oprogramowaniu przyrządu ustaw temperaturę pieca kolumnowego na 25 °C, a natężenie przepływu na 50 μl/min (100% ruchoma faza A).
6. Równoważyć kolumnę z fazą ruchomą A przez co najmniej 15 minut.
7. Umieść próbki w automatycznym podajniku próbek.
8. Przygotuj metodę instrumentu do analizy specyficznego dla ProGRP, tryptycznego peptydu ALGNQQPSWDSEDSSSNFK i jego IS.
   UWAGA: Kilka parametrów metody jest specyficznych dla danego instrumentu i należy je zoptymalizować pod kątem konkretnego używanego instrumentu. Szczegółowe informacje na temat parametrów metody zastosowanych w tym miejscu opisano w krokach od 6.9 do 6.11.
9. Dla programu gradientu w LC należy użyć następujących ustawień: natężenie przepływu: 50 μl/min; od czasu 0,0 do 3,0 min: 100% ruchoma faza A; od czasu 3,0 do 18,0 min: uruchomić gradient liniowy od 0% do 50% ruchomej fazy B; od czasu 18,0 do 18,1 min: zwiększyć ruchomą fazę B z 50% do 100%; od czasu 18,1 do 20,0 min: W 100% mobilna faza B; od czasu 20,0 do 20,1 min: zmniejsz ruchomą fazę B ze 100% do 0%; od czasu 20,1 do 30 min: 100% ruchoma faza A w celu ponownego wyrównania kolumny (użyj co najmniej 10 objętości kolumny).
10. W przypadku ustawień MS/MS uruchom MS/MS w trybie dodatnim, korzystając z ustawień urządzenia, które zapewniają wydajną jonizację. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć napięcia rozpylania +4 000 V, temperatury podgrzanej kapilary 270 °C, azotu jako gazu arkuszowego (5 dowolnych jednostek) i argonu (2 mTorr) do fragmentacji dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID). Jeśli przyrząd na to pozwala, skieruj przepływ LC tak, aby zmarnować pierwsze 2 minuty (0-2 min) i ostatnią 1 minutę (29-30 minut) przebiegu, zamiast do MS.
11. Użyj wybranych przejść monitorowania reakcji (SRM) dla (A) peptydu sygnatury (ALGNQQPSWDSEDSSSNFK): 1 005,45→913,3, 1 005,45→1 028,3 i 1 005,45→1 398,5 oraz (B) peptydu IS SIL (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂]): 1 009,45→921,3, 1 009,45→1 036,3 i 1 009,45→1 406,5. Użyj zoptymalizowanej energii zderzenia (35 V w tym protokole) dla wszystkich monitorowanych przejść.
12. Przygotuj sekwencję zawierającą próbki do uruchomienia za pomocą oprogramowania dostępnego dla systemu LC-MS/MS. Ustawić objętość wtrysku na 10 μl.
    UWAGA: W razie potrzeby należy dodać puste próbki i próbki kontroli jakości.
13. Naciśnij "Uruchom sekwencję" w oprogramowaniu instrumentu, aby rozpocząć sekwencję.
14. Monitoruj obszar piku wychwyconego przez powinowactwo, specyficznego dla ProGRP, peptydu tryptycznego ALGNQQPSWDSEDSSSNFK i jego peptydu IS SIL.
    UWAGA: Wybór i potwierdzenie peptydu sygnatury, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, jest opisane w innym miejscu¹⁴.

Wyniki

Przegląd analitycznego przepływu pracy przy użyciu zarówno próbkowania DSS, jak i VAMS jest pokazany w Rysunek 1. Z wyjątkiem różnic w metodzie pobierania próbek, procedury są identyczne. Obrazy surowicy pobranej przy użyciu dwóch metod pobierania próbek można zobaczyć na Rysunek 2.

Obie formy pobierania próbek (VAMS i DSS) są odpowiednie do pobierania próbek surowicy zawierającej ProGRP. Można to zobaczyć na Rysunek 3, gdzie pokazane są chromatogramy MS peptydu proteotypowego i peptydu IS SIL z próbkowania DSS i VAMS. Ponadto włącza się chromatogram MS po analizie próbki kontrolnej składającej się z 10 μl wzbogaconej próbki surowicy ciekłej, przetworzonej w taki sam sposób, jak próbki wysuszone. Ten ostatni rozcieńczono w tej samej objętości co objętość roztworu ekstrakcyjnego DSS/VAMS, poddano trawieniu za pomocą kulek trypsyny i oczyszczono za pomocą wychwytywania powinowactwa peptydów.

Porównując próbkowanie VAMS i DSS (Rysunek 4), VAMS zapewnia wyższy stosunek powierzchni peptydu proteotypowego do powierzchni IS niż DSS. Wskazuje to, że może dojść do utraty docelowego białka ProGRP na rzecz papieru używanego do DSS (czystej celulozy). W porównaniu z próbką kontrolną, w której surowica nie jest suszona przed dalszym przetwarzaniem i analizą (Rysunek 4), wykazano, że VAMS zapewnia podobne proporcje powierzchni jak próbka kontrolna (dwustronny test t, p≤ 0,65), co wskazuje na brak strat w materiale do pobierania próbek, podczas gdy DSS zapewnia znacznie niższy stosunek powierzchni (dwustronny test t, p≤ 0,005), co wskazuje na ubytek materiału do pobierania próbek.

Krótka ocena została przeprowadzona przy użyciu VAMS. Liniowość wykazano w zakresie od 10 do 1 000 ng/ml (R² = 0,9996), przy granicy wykrywalności (LOD, S/N = 3) wynoszącej 6,7 ng/ml. LOD jest uważany za zadowalający, ponieważ analizę przeprowadzono na dość starym potrójnym kwadrupolu (2008) z kolumną o średnicy wewnętrznej 1 mm. Powtarzalność wszystkich poziomów przy S/N > 10 została również uznana za zadowalającą przy RSD między 7% a 17% (n = 3), przy użyciu korekcji IS.

Wychwytywanie powinowactwa może być przeprowadzone zarówno przed, jak i po etapie trawienia, poprzez wychwycenie interesującego białka lub jego peptydu proteotypowego. Obecna procedura opisuje wychwytywanie powinowactwa peptydów. Zaletą tego podejścia w porównaniu z wychwytywaniem białek jest to, że wychwytywany jest tylko peptyd będący przedmiotem zainteresowania, co pozwala na jeszcze bardziej efektywne oczyszczanie próbki. Jest to zilustrowane na Rysunek 5, pokazujący bardziej złożony chromatogram pełnego skanowania z większą ilością szumu po wychwyceniu białka w porównaniu po wychwyceniu peptydu. Próbki analizowane w Rysunek 5 nie są próbkowane przy użyciu próbkowania DSS ani VAMS; Jednak surowica jest również matrycą próbki, a wychwytywanie powinowactwa odbywa się przy użyciu tego samego przeciwciała, które jest używane do wychwytywania peptydów w opisanej procedurze.

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy analitycznej przy użyciu próbkowania zarówno DSS, jak i VAMS. Skróty: DSS = wysuszona plama surowicy; VAMS = objętościowe absorpcyjne mikropróbkowanie; LC-MS/MS = chromatografia cieczowa – tandemowa spektrometria mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazy surowicy pobranej różnymi metodami. (A) karta celulozowa DBS i (B) VAMS. Skróty: DBS = wysuszona plama krwi; VAMS = objętościowe absorpcyjne mikropróbkowanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne chromatogramy MS peptydu proteotypowego i peptydu IS SIL po pobraniu próbek DSS i VAMS, a także dla próbki surowicy z dodatkiem dodanym bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego. Chromatogramy MS pokazują 10 μl próbek surowicy wzbogaconych 1,5 μg/ml ProGRP i nałożonych na (A) VAMS, (B) kartę do pobierania próbek celulozy (dla DSS) lub (C) bezpośrednio do buforu ekstrakcyjnego (próbka kontrolna). Dwadzieścia pięć mikrolitrów 14 ng / ml to peptyd SIL dodawany do wszystkich próbek przed wychwyceniem powinowactwa do peptydów. Skróty: DSS = wysuszona plama surowicy; VAMS = objętościowe absorpcyjne mikropróbkowanie; MS = spektrometria mas; ProGRP = peptyd uwalniający progastrynę; IS = wzorzec wewnętrzny; SIL = stabilny znakowany izotopem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki stosunku powierzchni ALGNQQPSWDSEDSSSNFK/IS dla próbek surowicy wzbogaconych ProGRP i zastosowanych (10 μL) do VAMS, DSS lub bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego (próbka kontrolna). Stężenie ProGRP wynosi 1,5 μg/ml, n = 4 dla każdego stanu; 25 μl 14 ng/ml peptydu IS SIL dodaje się do wszystkich próbek przed wychwyceniem powinowactwa do peptydów. *wskazuje, że stosunek powierzchni znacznie różni się od próbek zastosowanych do VAMS (dwustronny test t, p≤ 0,005). Słupki błędów są ± odchyleniu standardowym. Skróty: DSS = wysuszona plama surowicy; VAMS = objętościowe absorpcyjne mikropróbkowanie; ProGRP = peptyd uwalniający progastrynę; IS = wzorzec wewnętrzny; SIL = stabilny znakowany izotopem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Porównanie chromatogramów pików bazowych (pełna analiza Orbitrap) po ekstrakcji nienaruszonego białka (niebieski) i ekstrakcji peptydów epitopowych proteotypowych (czerwony). Ekstrahowane chromatogramy jonowe proteotypowego peptydu epitopowego (ALGNQQPSWDSEDSSSNFK, m/z 1005.45) pokazano po prawej stronie. Jako próbkę użyto surowicy wzbogaconej 150 ng mL⁻¹ ProGRP. Ten rysunek jest przedrukowany z Levernæs et al.¹⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca S1: Przegląd składu i roztworów oraz sposobu ich przygotowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisany protokół zawiera informacje o tym, jak przeprowadzić kilka ważnych etapów w analizie biomarkerów o niskiej liczebności z wysuszonych mikropróbek (DSS i VAMS), w tym przygotowanie kulek trypsyny i kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, zawsze traktujemy przeciwciało kwasem przed unieruchomieniem kulek, aby poprawić orientację przeciwciał¹⁵.

Jednym z kluczowych etapów tej procedury jest wybór najbardziej odpowiedniego formatu mikropróbkowania. Po pierwsze, należy rozważyć, czy dany analit można oznaczyć z krwi pełnej, czy też na stężenie mają wpływ komórki krwi i należy je oznaczyć w surowicy lub osoczu (jak w przypadku analitu modelowego, ProGRP).

Zarówno podejście oparte na papierze, jak i polimerach ma swoje zalety i ograniczenia; w przypadku ProGRP VAMS zapewnia wyraźną przewagę w odniesieniu do odzysku analitu po ekstrakcji z próbnika. Można to jednak prawdopodobnie zoptymalizować przy użyciu innego roztworu ekstrakcyjnego dla próbek DSS. Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę tę potencjalną interakcję między analitem a materiałem do pobierania próbek, ponieważ może ona skutkować zwiększoną zmiennością analityczną i wyższymi granicami wykrywalności. Ponieważ stosowany IS jest peptydem SIL i jest dodawany po raz pierwszy po mineralizacji, IS koryguje się o etapy następujące po mineralizacji (np. ekstrakcja powinowactwa i analiza LC-MS/MS). Korekcja IS nie jest możliwa w przypadku ekstrakcji z DSS/VAMS i etapu mineralizacji.

W zabiegu stosuje się dwa rodzaje kulek: kulki trypsynowe do trawienia po ekstrakcji próbki surowicy z próbnika oraz kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami do wychwytywania peptydu proteotypowego po trawieniu. Głównym powodem stosowania kulek trypsyny, oprócz przyspieszenia trawienia, jest zminimalizowanie resztkowej aktywności trypsyny w próbce podczas wychwytywania powinowactwa. Jest to ważne, aby uniknąć tryptycznej proteolizy mAb podczas wychwytywania powinowactwa.

Kulki agarozowe użyto do przygotowania kulek trypsyny, natomiast kulki magnetyczne użyto do przygotowania kulek pokrytych przeciwciałem. Koraliki agarozowe są tańsze niż kulki magnetyczne, ale mają ograniczenie polegające na tym, że oddzielenie kulek od roztworu wymaga odwirowania. To sprawia, że separacja kulek i supernatantu jest mniej wydajna niż w przypadku stosowania kulek magnetycznych. Ponadto automatyzacja przepływu pracy jest trudna przy użyciu koralików agarozowych. Dostępne są jednak kulki magnetyczne aktywowane przez NHS, które można wykorzystać do bardziej usprawnionego i zautomatyzowanego procesu przygotowywania próbek.

Mikropobieranie próbek jest ważnym trendem w bioanalizie zarówno leków, jak i biomarkerów. Jednym z wyzwań związanych z obecnym podejściem jest ograniczona objętość próbki (10 μl), co może mieć szczególne znaczenie w oznaczaniu analitów o bardzo niskiej obfitości, takich jak ProGRP (pg/mL-niski poziom ng/ml). Wyzwanie to można jednak obejść za pomocą najnowocześniejszego sprzętu analitycznego. W przypadku tych analitów o niskiej liczebności wybór przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie, a najczęściej konieczne jest selektywne oczyszczanie próbki poprzez wychwytywanie powinowactwa na podstawie przeciwciał. Ponieważ wykazano, że wychwytywanie peptydów zapewnia czystsze ekstrakty i niższe granice wykrywalności niż wychwytywanie białek (przy użyciu tego samego przeciwciała)¹⁴, niniejsza metoda koncentruje się na tym podejściu w połączeniu z mikropróbkowaniem. Kolejną zaletą podejścia opartego na wychwytywaniu peptydów jest to, że peptyd IS SIL koryguje również etap wychwytywania powinowactwa.

W tej pracy do wychwytywania peptydów wykorzystano przeciwciało skierowane przeciwko białku. Jest to zaleta, ponieważ dostępność gotowych przeciwciał ukierunkowanych na białka jest wyższa niż gotowych przeciwciał skierowanych przeciwko peptydom proteotypowym. Jednak, aby przeciwciało antybiałkowe mogło skutecznie wychwycić peptyd proteotypowy, epitop musi być nienaruszony po strawieniu białka. Ponadto w przypadku wielu przeciwciał dokładny epitop nie jest znany, co sprawia, że poszukiwanie przeciwciała antybiałkowego jest żmudne. Ogranicza to liczbę dostępnych przeciwciał przeciwbiałkowych mających zastosowanie do wychwytywania peptydów. Opisaną procedurę demonstruje się przy użyciu surowicy jako matrycy i ProGRP jako docelowego analitu. Procedura ma być stosowana do innych matryc i innych docelowych analitów. Zamiast używać dostępnego na rynku przeciwciała antybiałkowego do wychwytywania powinowactwa peptydu proteotypowego, możliwe jest również użycie niestandardowych przeciwciał antypeptydowych. Skuteczność wychwytywania peptydów w porównaniu z wychwytywaniem białek przedstawiono na rysunku 5. Dzięki zamianie kulek agarozowych wykorzystywanych do przygotowania kulek trypsyny na kulki magnetyczne, procedura powinna być również kompatybilna z dostępnymi na rynku zrobotyzowanymi stanowiskami do przygotowywania próbek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy N-hydroksysukcynimid	estr Carbosynt (Staad, Szwajcaria)	FA33719	Przechowywać w zamrażarce w temperaturze poniżej -20 stopni; C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%)	Innovagen (Lund, Szwecja)	Nie dotyczy	Przechowywać w zamrażarce w temperaturze poniżej -20 stopni; C
Wodorowęglan amonu BioUltra (≥ 99,5%) )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	09830-500G
Kolumna Aquasil C18, 3 i mikro; m, 50 mm x 1 mm	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	77503-051030	Kolumna analityczna kompatybilna ze 100% wodną fazą ruchomą
Benzamidyna (≥ 95.0% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	12072	Przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 stopni Celsjusza; C
Chlorek wapnia dwuwodny  (&g; 99% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	223506-500G
Wirówka 5804	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	5804000010
Sklonowana izoforma ProGRP 1	Szpital radowy, Szpital Uniwersytecki w Oslo (Oslo, Norwegia)	Nie dotyczy	Przechowywać w zamrażarce poniżej -20 stopni; C
Wodorofosforan disodowy dwuwodny (analiza pro)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	30435-500G
Dwunastowodny wodorofosforan disodowy (pro analiza)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06579.0500
Dynabeads M-280 tosylaktywowany 10 ml	Invitrogen (Carlsbad, USA)	14204	Przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 stopni; C
DynaMag-2	Invitrogen (Carlsbad, USA)	123-21D
Etanoloamina (pro analiza, ≥ 99%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	#02400
Kwas mrówkowy (≥ 99% ) dla LC-MS	VWR International (Radnor, PA, USA)	84865.260
Karta celulozowa FTA DMPK-C	Whatman (Kent, Wielka Brytania)	WB129243	Karta
DBSFiolki HPLC, przezroczyste szkło, 1,5 mL, 32 x 11,6 mm, Clean Pack	Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)	LPP 11 09 0519
Mieszalnik próbek Hulamixer	Invitrogen (Carlsbad, USA)	101561503016	Mieszalnik próbek z mieszaniem end-over-end oraz odwrotnym obrotem i wibracjami
Surowica ludzka od zdrowych dawców krwi	Bank, Ullevå l, Szpital Uniwersytecki w Oslo (Oslo, Norwegia)	Nie dotyczy	Przechowywać w zamrażarce poniżej -20 stopni C
Dymiący kwas solny 37% (Emsure do analizy)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00317.1000
System LC-MS/MS: System Ultimate 3000 (Autosampler, WPS-3000TRS; Mikropompa LPG-3400M; Menedżer przepływu, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) i TSQ Quantum dostęp. Kontrolowany przez Xcalibur 2.2 SP1.48	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	Nie dotyczy
LiChrosolv Acetonitryl hypergrade for LC-MS	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00029.2500
LL Biotrode, Kombinowana elektroda szklana	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0224.100
Mieszadło magnetyczne, typ M10	Franz Morat KG (Eisenbach, Niemcy)	10236
Mikrowkładki, szkło (31 x 6 mm, 0,1 ml)	VWR International (Radnor, PA, USA)	548-0006
Całka MilliQ 3 z Q-POD	Merck Millipore (Molsheim, Francja)	ZRXQ003T0	Do produkcji
wodnego przeciwciała monoklonalnego typu 1 M18	Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norwegia)	Nie dotyczy	Przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 & C
Mikropróbnik Neoteryx Mitra (10 μ L) 4 próbniki	Clamshell Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	NC1382947
kulki sefarozy aktywowane przez NHS 4 szybkie przepływy	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	GE17-0906-01	Koraliki agarozowe, przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 stopni; C
Optifit, Końcówki do pipet do napełniania, 10 ml	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	613-2911
- Optifit, Końcówki do pipet do napełniania, 10 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	790012
Optifit, Końcówki do pipet uzupełniających, 1,000 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	791002
- Optifit, Końcówki do pipet uzupełniających, 200 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	790202
szklana elektroda pH	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0233.100
pH-metr 744	Metrohm (Herisau, Sveits)	8.744.1003
Pipeta 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725090
Pipet m10 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725020
Pipet m100 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725050
Pipet m1,000 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725070
Pipet m20 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725030
Chlorek potasu (KCl ≥ 99,9%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	P-3911
Diwodorofosforan potasu (pro analiza)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.04873.0250
Białko LoBind Eppendorf probówka 0,5 mL	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0133 (0030 108.094)
Białko LoBind Eppendorf tubka 1,5 ml	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0132 (0030 108.116)
Białko LoBind Eppendorf tubka 2,0 ml	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0134 (0030 108.450)
Białko LoBind Eppendorf tubka 5,0 ml	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0792 (0030108.302)
Nożyczki	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	Z186716-1EA
Azydek sodu (BioUltra; ≥ 99,5% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	71289-5G
Chlorek sodu (do analizy)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06404.1000
Diwodorofosforan sodu jednowodny (pro analiza)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06346.0500
Wodorotlenek sodu (AnalaR NORMAPUR)	VWR International (Radnor, PA, USA)	28244.295
Dekahydrat tetraboranu sodu (≥ 99. %)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	S9640-500G S9640-500G
Miniwirówka spektraugowa	LABNET International (Edison, NJ, USA)	C1301
Magnes mieszający, 25 mm x 6 mm Ø, okrągły	Leybold (Kolonia, Niemcy)	666  851
Stuart  Scientific SA8 Vortex	Mixer Stuart (Staffordshire, Wielka Brytania)	Z648531-1EA
Probówki wirówkowe SuperClear (15 mL)	VWR International (Radnor, PA, USA)	525-0150
Probówki wirówkowe SuperClear (50 mL)	VWR International (Radnor, PA, USA)	525-0155
Thermomixer comfort 1,5 ml	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	53,55,27,831	Mieszalnik z kontrolowaną temperaturą
Baza trizma (klasa odczynnika, ≥ 99,0 %)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	T6066	Tris(hydroksymetylo)aminometan (tris)
Trizma HCl (klasa odczynnika, ≥ 99,0%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	T3253-100G	Tris(hydroksymetylo)aminometan HCl (tris HCl)
Trypsyna (traktowana TCPK z trzustki bydlęcej, 10 000-15 000 jednostek BAEE / mg białka)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	T8802	Przechowywać w zamrażarce poniżej -20 & stopni; C
Tween 20	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	P7949-500ML	polisorbat 20
Pęseta	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	TEM-78511-27
Nasadki na fiolki, białe, 9 mm	Nerliens Meszańki (Oslo, Norge)	LPP 09 15 0981
Mikrosampler Mitra z technologią VAMS (wolumetryczne mikropróbkowanie adsorpcyjne), 10 i mikro; L, 4-próbnik z klapką	Neoteryx (Torrance, CA, Stany Zjednoczone)