Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64485

⸱

18 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Streszczenie

Immunoterapia przeciwciałami specyficznymi dla antygenu lub inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych zrewolucjonizowała terapię raka piersi. Komórki raka piersi wykazujące ekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostu HER2 mogą być celem przeciwciała anty-HER-2 trastuzumabu. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) jest ważnym mechanizmem związanym z przeciwnowotworowym działaniem HER-2. Trastuzumab związany z komórkami nowotworowymi może być rozpoznawany przez receptory Fc komórek efektorowych ADCC (np. komórek NK), makrofagów i granulocytów), wyzwalając aktywność cytotoksyczną tych komórek odpornościowych prowadzącą do śmierci komórek nowotworowych. Postanowiliśmy opracować oparty na obrazie test do oznaczania ilościowego ADCC w celu identyfikacji nowych związków modulatorów ADCC za pomocą badań przesiewowych o wysokiej zawartości. W teście komórki raka piersi JIMT-1 z nadekspresją HER2 są hodowane wspólnie z komórkami NK-92 w obecności trastuzumabu, a śmierć komórek docelowych określa się ilościowo za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii i ilościowej analizy obrazu. Komórki docelowe odróżnia się od komórek efektorowych na podstawie ich fluorescencji EGFP. Pokazujemy, w jaki sposób biblioteki związków mogą być testowane w teście w celu identyfikacji leków modulujących ADCC. W tym celu stworzono płytkę testową biblioteki związków chemicznych przy użyciu losowo wybranych chemikaliów wysokowartościowych z półki laboratoryjnej. W bibliotece testowej znalazły się również trzy związki destabilizujące mikrotubule (kolchicyna, winkrystyna, podofilotoksyna), które mogą zakłócać migrację i degranulację komórek NK. Badanie przesiewowe zidentyfikowało wszystkie trzy związki kontroli pozytywnej jako trafienia potwierdzające przydatność metody do identyfikacji leków modyfikujących ADCC w bibliotece chemicznej. Dzięki temu testowi można przeprowadzić badania przesiewowe biblioteki związków w celu zidentyfikowania związków wzmacniających ADCC, które mogą być stosowane jako uzupełniające środki terapeutyczne w leczeniu pacjentów otrzymujących immunoterapię przeciwnowotworową. Ponadto metoda ta może być również stosowana do identyfikacji wszelkich niepożądanych skutków ubocznych hamujących ADCC leków terapeutycznych przyjmowanych przez pacjentów onkologicznych w różnych wskazaniach.

Wprowadzenie

Immunoterapia z zastosowaniem przeciwciał przeciwnowotworowych, inhibitorów punktów kontrolnych układu odpornościowego lub limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR-T) stanowi potężne podejście w leczeniu raka1,2,3. Trastuzumab jest humanizowanym monoklonalnym przeciwciałem anty-HER-2 (ludzki receptor 2 dla czynnika wzrostu naskórka) stosowanym w leczeniu HER-2 dodatniego raka piersi we wczesnym stadium lub w formie przerzutowej, a także przerzutowego raka żołądka HER-2 dodatniego4,5,6. Działa on przede wszystkim poprzez hamowanie efektu stymulującego proliferację przez czynnik wzrostu naskórka4. Doniesiono jednak, że trastuzumab skutecznie wywołuje śmierć komórek nowotworowych nawet wtedy, gdy komórki te utraciły reaktywność na stymulację HER-27. Ten paradoksalny efekt przeciwciała wynika z cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)7. ADCC może być pośredniczone przez komórki NK (natural killer), granulocyty i makrofagi, określane zbiorczo jako komórki efektorowe ADCC8,9. Jeśli przeciwciało, takie jak trastuzumab, wiąże się z komórkami nowotworowymi, komórki efektorowe wykorzystują swoje receptory Fc do związania stałego (Fc) regionu przeciwciała. Przeciwciało tworzy pomost między komórkami nowotworowymi a komórkami efektorowymi posiadającymi receptor Fc, co wyzwala uwalnianie mediatorów cytotoksycznych10. Komórki NK uwalniają cytotoksyczną zawartość swoich ziarnistości zawierającą perforynę, aby wytworzyć pory w błonie komórkowej komórki docelowej, oraz granzym (wyzwalający szlaki sygnalizacyjne śmierci komórki) do synapsy immunologicznej, co prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych (patrz Rycina 1).

Schemat oddziaływania komórek NK i komórek nowotworowych z procesem wiązania FcγR-trastuzumab-HER2.
Rysunek 1: Oddziaływania komórek efektorowych i docelowych w ADCC. Receptor Fcγ na powierzchni komórki efektorowej NK rozpoznaje region Fc przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu, swoistego dla cząsteczki HER2 wykazywanej na powierzchni komórki nowotworowej. W ten sposób między obiema komórkami tworzy się tzw. synapsa immunologiczna, co indukuje ukierunkowaną egzocytozę ziarnistości cytotoksycznych komórki efektorowej. Uwolnione cząsteczki perforyny i granzymu prowadzą w konsekwencji do apoptozy komórki docelowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wcześniej opracowano kilka testów do ilościowego oznaczania cytotoksyczności, w tym ADCC. Złotym standardem jest metoda uwalniania radioaktywnego chromu, w której komórki docelowe są znakowane radioaktywnym izotopem 51Cr, a stopień ADCC określa się poprzez pomiar radioaktywności nadpływu z lizowanych komórek docelowych11. Ze względu na oczywiste problemy wynikające ze ściśle regulowanej obsługi, przechowywania i utylizacji radioaktywnych farmaceutyków i odpadów, metoda ta staje się coraz mniej popularna wśród naukowców zajmujących się naukami o życiu. Ponadto nie nadaje się ona do zastosowań wysokoprzepustowych. Pomiar aktywności enzymów (np. dehydrogenazy mleczanowej) uwalnianych z zabitych komórek docelowych może stanowić niepromieniotwórczą alternatywę dla testu 51Cr12. Testy te nie pozwalają jednak odróżnić śmierci komórek docelowych od śmierci komórek efektorowych. Metoda elektrycznego pomiaru impedancji między komórką a podłożem (ECIS) okazała się odpowiednia do ilościowego oznaczania ADCC13, jednak aparatura ECIS nie jest dostępna w większości laboratoriów, a sama technika nie jest kompatybilna z zastosowaniami lub przesiewaniem wysokoprzepustowym. Komórki znakowane fluorescencyjnie stanowią popularną alternatywę w wielu testach biologii komórki i są często wykorzystywane w cytometrii przepływowej lub aplikacjach opartych na czytnikach płytek14,15,16. Jednak testy te często obejmują etapy płukania lub są w inny sposób niekompatybilne z zastosowaniami wysokoprzepustowymi (np. techniki oparte na cytometrii przepływowej). Niektóre popularne testy cytotoksyczności, które teoretycznie powinny nadawać się do ilościowego oznaczania ADCC, nie pozwalają na wiarygodne określenie wydajności ADCC13. Ostatnio, wraz z upowszechnieniem fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, testy obrazowe o wysokiej zawartości danych (high-content assays) stają się coraz bardziej popularne w różnych obszarach nauk o życiu17. Z jednej strony sprzęt do obrazowania komórek jest obecnie dość powszechny, a z drugiej strony z uzyskanych obrazów można zebrać niemal nieograniczoną liczbę parametrów morfologicznych. Dlatego postawiliśmy sobie za cel opracowanie testu ADCC kompatybilnego z przesiewaniem wysokoprzepustowym o wysokiej zawartości danych oraz wykazanie jego przydatności do przesiewania bibliotek związków.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy oparty na obrazowaniu test ADCC oraz demonstrujemy, w jaki sposób test ten może być wykorzystany do wysokoprzepustowego przesiewu obrazowego (High-Content Screening, HCS) w celu identyfikacji związków modulujących ADCC. Model opiera się na komórkach docelowych raka piersi JIMT-1, komórkach efektorowych CD16.176V.NK-92 oraz humanizowanym monoklonalnym przeciwciele anty-HER2 trastuzumab. Dzięki tej metodzie możliwe jest zidentyfikowanie leków, które mogą nasilać działanie NK w niszczeniu guzów, lub uzyskanie wglądu w mechanizm ADCC pośredniczonego przez komórki NK poprzez identyfikację małych cząsteczek zakłócających ADCC. Sugerujemy, że naukowcy z dziedziny nauk o życiu, dążący do ilościowego określenia cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki, ze szczególnym uwzględnieniem ADCC, mogą odnieść korzyść z zastosowania tego testu zarówno w badaniach podstawowych, jak i w rozwoju leków. Test ten może stanowić alternatywę w przypadku, gdy laboratorium ma dostęp do obrazowania fluorescencyjnego i analizy ilościowej obrazów oraz posiada w tym zakresie pewne doświadczenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Kluczowe etapy procedury analizy przedstawiono na Rysunku 2.

Schemat ADCC; inkubacja komórek, trastuzumab, komórki NK i JIMT-1, analiza wysokoprzepustowa (high-content analysis).
Rysunek 2: Schemat badania przesiewowego ADCC. Komórki docelowe JIMT-1-EGFP wysiane na płytki HCS z 96 dołkami są traktowane związkami z biblioteki chemicznej. Następnie dodaje się niebarwione komórki NK (efektorowe) oraz trastuzumab, a płytkę obrazuje się w punkcie czasowym 0 oraz po 3 h inkubacji. Ocena ADCC opiera się na zmianie liczby żywych (przylegających do powierzchni) komórek docelowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

1. Powlekanie płytki HCS

  1. Pokryj płytki 96-dołkowe do wysokoprzepustowego obrazowania (HSC) 50 µL/dołek pożywki JIMT-1 (pożywka DMEM/F-12 uzupełniona o 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,3 U/mL insuliny (100 IU/mL, Humulin R) oraz 1% penicyliny-streptomycyny).
  2. Umieść płytkę w inkubatorze CO2 na 1 h.
    UWAGA: Pokrycie jest kluczowe dla przyczepienia komórek JIMT-1 do szklanej powierzchni płytki.

2. Wysiew komórek JIMT-1 z ekspresją wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP)

UWAGA: Komórki JIMT-1 ekspresujące EGFP zostały wygenerowane w naszej poprzedniej pracy18, a komórki hodowano w kolbach do hodowli tkankowej T25 w pożywce JIMT-1 (patrz skład w kroku 1.1).

  1. Przemyć komórki 2 mL sterylnego PBS.
  2. Do kolby dodać 1 mL trypsyny-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze CO2 na 10 min.
  3. Po inkubacji opukać kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 odłączyły się od podłoża.
  4. Zatrzymać proces trawienia, dodając 2 mL pożywki JIMT-1, a następnie zebrać zawiesinę komórkową do probówki 15 mL.
  5. Policzyć komórki z użyciem 0,4% błękitu trypanowego (80 µL barwnika + 20 µL zawiesiny komórkowej) w komorze Bürkera i dostosować liczbę komórek do poziomu 133 000 komórek/mL.
  6. Odssać pożywkę do powlekania z płytki 96-dołkowej (krok 1.2).
  7. Do każdego dołka płytek HCS pipetować 75 µL zawiesiny komórkowej (patrz Tabela materiałów).
  8. Pozostawić komórki do przytwierdzenia podczas inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2.

3. Wstępna inkubacja komórek JIMT-1 EGFP z biblioteką związków

  1. Odssać pożywkę z komórek JIMT-1 i dodać do studni 50 µL/well świeżej pożywki dla komórek JIMT-1. Przenieść płytkę do laboratorium wysokoprzepustowych przesiewów.
    UWAGA: Użycie robota do manipulacji cieczami zwiększa wydajność i powtarzalność dodawania bibliotek związków.
  2. Przenieść badane związki z płytki biblioteki związków na płytkę testową za pomocą narzędzia z pinami skalibrowanego do objętości 25 nL. Powtórzyć tę czynność cztery razy. Cztery serie transferu zapewniają objętość końcową 100 nL (i końcowe stężenie 20 µM).
  3. Pomiędzy poszczególnymi krokami przemyć narzędzie z pinami, najpierw 50% DMSO, a następnie 70% etanolem.
  4. Inkubować płytki przez 1 h w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.

4. Rozpoczęcie testu ADCC poprzez dodanie komórek efektorowych

UWAGA: Komórki CD16.176V.NK92 (dalej nazywane komórkami NK92) hodowano w pożywce α-MEM uzupełnionej o 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% pirogronianu sodu, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 100 IU/mL IL-2.

  1. Policz komórki NK92 przy użyciu błękitu trypanu (80 µL barwnika + 20 µL zawiesiny komórkowej). Dostosuj liczbę komórek do poziomu 400,000 cells/mL.
  2. Odwiruj 4 mL zawiesiny komórkowej przy 150 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj medium ADCC, dodając 20 µg/mL przeciwciała anty-HER2 (trastuzumabu) do medium JIMT-1.
  4. Resuspenduj osad komórek NK w 5 mL medium ADCC.
  5. Pipetuj 20,000 komórek NK w 50 µL medium ADCC do komórek docelowych JIMT-1. Objętość końcowa wynosi 100 µL, a końcowe stężenie trastuzumabu to 10 µg/mL.
  6. Umieść płytkę testową w urządzeniu do analizy wysokotreściowej (high-content analysis) z wbudowanym inkubatorem ustawionym na 37 °C.

5. Obrazowanie

UWAGA: Płytki należy obrazować w dwóch punktach czasowych: po pierwsze, natychmiast po dodaniu komórek efektorowych do komórek docelowych, a po drugie, 3 h po dodaniu komórek NK. Do obrazowania można wykorzystać analizator wysokoprzepustowy (high-content analyzer) wraz z oprogramowaniem lub odpowiednie alternatywy (patrz Tabela materiałów).

  1. Wybierz typ płytki (96-well cell carrier ultra) z listy dostępnych płytek.
  2. Wybierz opcję Two peak autofocus, jeżeli badanie jest przeprowadzane w płytkach.
  3. Użyj obiektywu 10x w trybie niekonfokalnym.
  4. Wybierz Binning 2, aby podwoić stosunek sygnału do szumu.
  5. Wykonaj obrazy w polu jasnym w zakresie 650-760 nm oraz obrazy fluorescencyjne komórek JIMT-1 transdukowanych EGFP przy długościach fal 488 nm (pobudzenie) i 500-550 nm (emisja).
  6. Wybierz liczbę pól oraz liczbę punktów czasowych dla obrazowania.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Aby przeanalizować wydajność ADCC, należy zliczyć żywe komórki JIMT-1. Komórki docelowe zniszczone w procesie ADCC odrywają się od powierzchni i oddalają od płaszczyzny ogniskowej mikroskopu. W związku z tym różnica między liczbą żywych komórek na początku i na końcu reakcji ADCC odpowiada liczbie komórek docelowych wyeliminowanych przez ADCC. W celu zademonstrowania sposobu opracowania sekwencji oceny, w filmie pokazano kontrolną studzienkę ADCC.

  1. Użyj modułu Find cells, aby wykryć na obrazie obszary odpowiadające komórkom.
    UWAGA: Każda komórka jest wykrywana jako obszar na obrazie o wyższej intensywności fluorescencji niż obszar go otaczający.
  2. Wybierz komórki, korzystając z wbudowanego algorytmu M, przyjmując minimalną średnicę 80 µm.
  3. Ustaw wartość Splitting sensitivity (czułość rozdzielania), która dzieli duży obiekt na mniejsze obiekty, na 0,5.
  4. Ustaw Common threshold (najniższy poziom intensywności pikseli) na 0.
  5. Wyklucz detekcję obszarów tła o wysokiej intensywności fluorescencji EGFP w dwóch krokach.
    1. Najpierw użyj funkcji Calculate Intensity Properties, aby określić intensywność fluorescencji EGFP w wcześniej wybranym obszarze Cells.
    2. Ustaw minimalny i maksymalny próg intensywności za pomocą opcji Select population.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować działanie testu w praktyce, stworzono bibliotekę testową składającą się z 16 związków wybranych losowo z zasobów laboratoryjnych (Rysunek 3). Dodatkowo, jako kontrolę negatywną zastosowano DMSO, a jako kontrole pozytywne trzy związki hamujące polimeryzację mikrotubul (kolchicynę, winkrystynę i podofilotoksynę). Oczekiwano, że te ostatnie zahamują ADCC poprzez zakłócenie migracji komórek NK do komórek nowotworowych oraz degranulacji komórek NK. Wszystkie związki testowe ora...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Reakcja ADCC została opisana stosunkowo dawno temu. Opisano również kluczowe zdarzenia molekularne tego procesu19. Metody pomiaru ADCC wahają się od złotego standardu testu uwalniania chromu promieniotwórczego, testów uwalniania enzymów cytoplazmatycznych do kilku testów cytometrii przepływowej lub mikropłytek opartych na fluorescencji20. Jednak częstym ograniczeniem tych testów jest to, że nie nadają się one do zastosowań o wysokiej przepustowości. Wcześniej opracowaliśmy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

LV otrzymało dofinansowanie z grantów Krajowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE i OTKA K132193, K147482. Komórki CD16.176V.NK-92 uzyskano od dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, w imieniu Brink Biologics, lnc. San Diego, Kalifornia), są chronione patentami na całym świecie i były licencjonowane przez Nantkwest, lnc. Autorzy są wdzięczni Györgyowi Verebowi i Árpádowi Szöőrowi za pomoc w zastosowaniu linii komórkowej NK-92 oraz za porady techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-fluorouracylApplichemA7686w bibliotece złożonej
96-dołkowa płytka Cell Carrier UltraPerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757w bibliotece złożonej
CD16.176V.NK92 ogniwaNankwest Inc. 
CeruleninChemCruzsc-396822w bibliotece złożonej
CisplatinSanta Cruz Biotechnologysc-200896w bibliotece złożonej
ColchicineSigmaC9754w bibliotece złożonej
Concanavalin-ACalbiochem234567w bibliotece złożonej
DeksametazonSigmaD4902w biblioteka związków
DMEM/F-12 mediumSigmaD8437w JIMT-1 EGFP medium
DMSOSigmaD2650w bibliotece złożonej
EtopozydSigmaE1383E1383
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BiosuricaFB-1090/500JIMT-1 EGFP i pożywka NK
FisetinSigmaF4043w bibliotece
złożonejRobot do obsługi cieczy Freedom EVO, TECAN,
Gallotannin,Fluka, Chemical Corp.16201w bibliotece złożonej
GlutaminaGibco35,050– 061w oprogramowaniu NK medium
Harmony PerkinElmer
Humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2 (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, Budapeszt, WęgryN/A Humulin
R (insulina)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP podłoże
IL-2Novartis Hungá ria Kft.PHC0026w pożywce NK
IsatinSigma114618w bibliotece złożonej
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)Gibco11,140– 050w podłożu NK
Na-pirogronianLonzaBE13-115Ew podłożu
NK NaringeninaSigmaN5893w bibliotece złożonej
NQDI-1SigmaSML0185w bibliotece złożonej
Sprzęt do analizy wysokiej zawartości Opera PhenixPerkinElmer
Penicylina– streptomycynaBiosuraLM-A4118JIMT-1 EGFP i pożywka NK
PentoksyfillineSigmaP1784w bibliotece złożonej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)LonzaBE17-517Qdo mycia komórek
PodofilotoksynaSigmaP4405w bibliotece złożonej
KwercetynaSigmaQ4951w bibliotece
złożonejKwas garbnikowySigmaT8406w bibliotece złożonej
TemozolomidSigmaT2577w bibliotece złożonej
Błękit trypanowy 0,4% roztwórSigmaT8154do zliczania komórek
Siarczan winkrystynySigmaV0400000w bibliotece złożonej
α-MEMSigmaM8042w podłożu NK

Bibliografia

  1. Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
  2. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013(2022).
  3. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  4. Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
  5. Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
  6. Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
  7. Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
  8. Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261(2021).
  9. Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581(2021).
  10. Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
  11. van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
  12. Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
  13. Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
  14. Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
  15. Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
  16. Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
  17. Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
  18. Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
  19. Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462(2022).
  20. Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
  21. Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytotoksyczność komórek NKtest z trastuzumabemimmunoterapia raka piersikomórki HER2-dodatnieautomatyczna mikroskopiaanaliza obrazuprzesiew biblioteki związkówmodulatory ADCC
Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.