Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Streszczenie

Immunoterapia przeciwciałami specyficznymi dla antygenu lub inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych zrewolucjonizowała terapię raka piersi. Komórki raka piersi wykazujące ekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostu HER2 mogą być celem przeciwciała anty-HER-2 trastuzumabu. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) jest ważnym mechanizmem związanym z przeciwnowotworowym działaniem HER-2. Trastuzumab związany z komórkami nowotworowymi może być rozpoznawany przez receptory Fc komórek efektorowych ADCC (np. komórek NK), makrofagów i granulocytów), wyzwalając aktywność cytotoksyczną tych komórek odpornościowych prowadzącą do śmierci komórek nowotworowych. Postanowiliśmy opracować oparty na obrazie test do oznaczania ilościowego ADCC w celu identyfikacji nowych związków modulatorów ADCC za pomocą badań przesiewowych o wysokiej zawartości. W teście komórki raka piersi JIMT-1 z nadekspresją HER2 są hodowane wspólnie z komórkami NK-92 w obecności trastuzumabu, a śmierć komórek docelowych określa się ilościowo za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii i ilościowej analizy obrazu. Komórki docelowe odróżnia się od komórek efektorowych na podstawie ich fluorescencji EGFP. Pokazujemy, w jaki sposób biblioteki związków mogą być testowane w teście w celu identyfikacji leków modulujących ADCC. W tym celu stworzono płytkę testową biblioteki związków chemicznych przy użyciu losowo wybranych chemikaliów wysokowartościowych z półki laboratoryjnej. W bibliotece testowej znalazły się również trzy związki destabilizujące mikrotubule (kolchicyna, winkrystyna, podofilotoksyna), które mogą zakłócać migrację i degranulację komórek NK. Badanie przesiewowe zidentyfikowało wszystkie trzy związki kontroli pozytywnej jako trafienia potwierdzające przydatność metody do identyfikacji leków modyfikujących ADCC w bibliotece chemicznej. Dzięki temu testowi można przeprowadzić badania przesiewowe biblioteki związków w celu zidentyfikowania związków wzmacniających ADCC, które mogą być stosowane jako uzupełniające środki terapeutyczne w leczeniu pacjentów otrzymujących immunoterapię przeciwnowotworową. Ponadto metoda ta może być również stosowana do identyfikacji wszelkich niepożądanych skutków ubocznych hamujących ADCC leków terapeutycznych przyjmowanych przez pacjentów onkologicznych w różnych wskazaniach.

Wprowadzenie

Immunoterapia przeciwciałami przeciwnowotworowymi, inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych lub limfocytami T (CAR-T) eksprymującymi chimeryczny receptor antygenu stanowi potężne podejście do leczenia raka^1,2^,3. Trastuzumab jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-HER-2 (receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2) stosowanym w leczeniu HER-2-dodatniego raka piersi we wczesnym stadium lub przerzutowego, a także HER-2-dodatniego raka żołądka z przerzutami^4,5,6. Działa przede wszystkim poprzez hamowanie stymulującego proliferację działania naskórkowego czynnika wzrostu⁴. Doniesiono jednak, że trastuzumab skutecznie wywołuje śmierć komórek rakowych, nawet jeśli komórki rakowe utraciły odpowiedź na stymulację HER-2⁷. Ten paradoksalny efekt przeciwciała wynika z cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)⁷. W ADCC mogą pośredniczyć komórki NK (natural killer), granulocyty i makrofagi znane jako komórki efektorowe ADCC^8,9. Jeśli przeciwciało, takie jak trastuzumab, wiąże się z komórkami nowotworowymi, wówczas te komórki efektorowe wykorzystują swoje receptory Fc do wiązania stałego (Fc) regionu przeciwciała. Przeciwciało łączy komórki nowotworowe z komórkami efektorowymi przenoszącymi receptor Fc, wywołując uwalnianie ich mediatorów cytotoksycznych¹⁰. Komórki NK uwalniają cytotoksyczny ładunek swoich granulek zawierających perforynę, aby wytworzyć pory w docelowej błonie komórkowej i granzymie (wyzwalając szlaki sygnalizacji śmierci komórki) do synapsy immunologicznej, co prowadzi do apoptozy komórek rakowych (patrz Rysunek 1).

Rysunek 1: Interakcje efektorów i komórek docelowych w ADCC. Receptor Fcγ na powierzchni komórki efektorowej komórki NK rozpoznaje region Fc przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu specyficznego dla cząsteczki HER2 wyrażonej na powierzchni komórki nowotworowej. W ten sposób między dwiema komórkami powstaje tak zwana synapsa immunologiczna, indukująca ukierunkowaną egzocytozę cytotoksycznych ziarnistości komórki efektorowej. Uwolnione cząsteczki perforyny i granzymu ostatecznie powodują apoptozę komórki docelowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wcześniej opracowano kilka testów do ilościowego określenia cytotoksyczności, w tym ADCC. Złotym standardem jest metoda uwalniania radioaktywnego chromu, w której komórki docelowe są znakowane radioaktywnym izotopem ⁵¹Cr, a ADCC określa się ilościowo, mierząc radioaktywność z supernatantu lizowanych komórek docelowych¹¹. Ze względu na oczywiste problemy związane ze ściśle regulowanym obchodzeniem się, przechowywaniem i usuwaniem radioaktywnych farmakodonów i odpadów, metoda ta staje się coraz mniej popularna wśród naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi. Ponadto nie nadaje się również do zastosowań o wysokiej przepustowości. Pomiar aktywności enzymów (np. dehydrogenazy mleczanowej) uwalnianych z zabitych komórek docelowych może stanowić nieradioaktywną alternatywę dla testu ⁵¹Cr ¹². Testy te nie są jednak w stanie odróżnić śmierci komórek docelowych od efektorowych. Wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego (ECIS) okazało się odpowiednie do ilościowego oznaczania ADCC¹³, ale sprzęt ECIS nie jest dostępny w większości laboratoriów, a technika ta nie jest kompatybilna z aplikacjami o wysokiej przepustowości/badaniami przesiewowymi. Komórki znakowane fluorescencyjnie stanowią popularną alternatywę w wielu testach biologii komórki i są często używane w cytometrii przepływowej lub aplikacjach opartych na czytnikach płytek^14,15,16. Jednak testy te często zawierają etapy płukania lub są w inny sposób niekompatybilne z zastosowaniami o wysokiej przepustowości (np. technikami opartymi na cytometrii przepływowej). Niektóre popularne testy cytotoksyczności, które teoretycznie powinny być odpowiednie do ilościowego oznaczania ADCC, nie są w stanie wiarygodnie określić skuteczności ADCC¹³. Ostatnio, wraz z rozpowszechnieniem się fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, testy oparte na obrazie o wysokiej zawartości stają się coraz bardziej popularne w różnych dziedzinach nauk przyrodniczych¹⁷. Z jednej strony sprzęt do obrazowania komórek jest obecnie dość wszechobecny, a z drugiej strony z pozyskanych obrazów można uzyskać praktycznie nieskończoną ilość parametrów morfologicznych. W związku z tym postanowiliśmy opracować test ADCC kompatybilny z badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości i wykazać jego przydatność do badań przesiewowych w bibliotece związków.

Tutaj prezentujemy test ADCC oparty na obrazie i pokazujemy, jak ten test może być wykorzystany do badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do identyfikacji związków modulujących ADCC. Model oparty jest na komórkach docelowych raka piersi JIMT-1, komórkach efektorowych CD16.176V.NK-92 oraz humanizowanym przeciwciałie monoklonalnym anty-HER2 trastuzumab. Dzięki tej metodzie możliwe jest zidentyfikowanie leków, które mogą wzmocnić zabijanie nowotworów przez komórki NK lub uzyskanie wglądu w mechanizm ADCC za pośrednictwem komórek NK poprzez identyfikację małych cząsteczek zakłócających ADCC. Sugerujemy, że naukowcy zajmujący się badaniami biologicznymi dążący do ilościowego określenia cytotoksyczności za pośrednictwem komórek, ze szczególnym uwzględnieniem ADCC, mogą odnieść korzyści z zastosowania tego testu zarówno do odkryć, nauki, jak i opracowywania leków. Ten test może być alternatywą, jeśli laboratorium ma dostęp i pewne doświadczenie w obrazowaniu fluorescencyjnym i ilościowej analizie obrazu.

Protokół

UWAGA: Kluczowe etapy procesu testowania są przedstawione w Rysunek 2.

Rysunek 2: Przepływ pracy na ekranie ADCC. Komórki docelowe JIMT-1-EGFP wysiane na 96-dołkowych płytkach HCS są traktowane lekami z biblioteki związków. Z kolei dodaje się niebarwione komórki NK (efektorowe) i trastuzumab, a płytkę obrazuje się w punkcie czasowym 0 i po 3 godzinach inkubacji. Ocena ADCC opiera się na zmianie liczby żywotnych (przylegających do powierzchni) komórek docelowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Powłoka płyty HCS

1. Pokryj 96 dołkowych płytek przesiewowych o wysokiej zawartości (HSC) 50 μl/dołek pożywki JIMT-1 (pożywka DMEM/F-12 uzupełniona 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,3 U/ml insuliny (100 IU / ml, Humulina R i 1% penicylina-streptomycyna).
2. Umieścić płytkę w inkubatorze CO₂ na 1 godz.
   UWAGA: Powłoka ma kluczowe znaczenie dla mocowania ogniw JIMT-1 do szklanej powierzchni płyty.

2. Wysiewanie komórek JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)

UWAGA: Komórki JIMT-1 z ekspresją EGFP zostały wygenerowane w naszym poprzednim work¹⁸, a komórki były hodowane w kolbach do hodowli tkankowych T25 w pożywce JIMT-1 (patrz skład w kroku 1.1).

1. Umyj komórki 2 ml sterylnego PBS.
2. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do kolby i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze CO_{2 na} 10 minut.
3. Po inkubacji postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 są odłączone.
4. Zatrzymaj trawienie za pomocą 2 ml pożywki JIMT-1 i zbierz zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.
5. Policz komórki za pomocą 0,4% błękitu trypanowego (80 μl barwnika + 20 μl zawiesiny komórek) w komorze Bürkera i dostosuj liczbę komórek do 133 000 komórek/ml.
6. Odessać podłoże powlekające z płytki 96-dołkowej (krok 1.2).
7. Odpipetować 75 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na płytkach HCS (patrz tabela materiałów).
8. Pozwolić komórkom przyczepić się podczas całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .

3. Wstępna obróbka komórek JIMT-1 EGFP za pomocą biblioteki związków

1. Odessać pożywkę z komórek JIMT-1 i dodać 50 μl/dołek świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek. Przenieść płytkę do wysokoprzepustowego laboratorium przesiewowego.
   UWAGA: Korzystanie z robota do obsługi cieczy sprawia, że dodawanie bibliotek związków jest bardziej wydajne i powtarzalne.
2. Przenieść badane związki z płytki biblioteki związków na płytkę testową za pomocą narzędzia kołkowego skalibrowanego na objętość 25 nL. Wykonaj to cztery razy. Cztery rundy transferu dają końcową objętość 100 nL (i końcowe stężenie 20 μM).
3. Pomiędzy każdym krokiem umyj narzędzie do szpilek, najpierw 50% DMSO, a następnie 70% etanolem.
4. Inkubować płytki przez 1 godzinę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.

4. Rozpoczęcie testu ADCC poprzez dodanie komórek efektorowych

UWAGA: Komórki CD16.176V.NK92 (zwane dalej komórkami NK92) hodowano w α-MEM z dodatkiem 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pirogronianu, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 100 IU/ml IL-2.

1. Policz komórki NK92 za pomocą błękitu trypanowego (80 μl barwnika + 20 μl zawiesiny komórek). Dostosuj liczbę komórek do 400 000 komórek/ml.
2. Odwirować 4 ml zawiesiny komórkowej o stężeniu 150 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować pożywkę ADCC, dodając 20 μg/ml przeciwciała anty-HER2 (trastuzumab) do pożywki JIMT-1.
4. Zawiesić osad komórek NK w 5 ml pożywki ADCC.
5. Odpipetować 20 000 komórek NK w 50 μl pożywki ADCC do docelowych komórek JIMT-1. Ostateczna objętość wynosi 100 μl, a końcowe stężenie trastuzumabu wynosi 10 μg/ml.
6. Umieścić płytkę do oznaczania w urządzeniu do analizy o wysokiej zawartości z wbudowanym inkubatorem ustawionym na 37 °C.

5. Obrazowanie

UWAGA: Płytki powinny być zobrazowane w dwóch punktach czasowych, po pierwsze, bezpośrednio po dodaniu komórek efektorowych do komórek docelowych, a po drugie, po 3 godzinach od dodania komórek NK. Do obrazowania można użyć analizatora o wysokiej zawartości i jego oprogramowania lub odpowiednich alternatyw (patrz tabela materiałów).

1. Wybierz Typ płytki (96-dołkowy nośnik komórek ultra) z listy płytek.
2. Wybierz autofokus z dwoma szczytami, jeśli test jest przeprowadzany na płytkach.
3. Użyj obiektywu 10x w trybie niekonfokalnym.
4. Wybierz opcję Binning 2 (Grupowanie 2), aby podwoić stosunek sygnału do szumu.
5. Wykonaj zdjęcia w jasnym polu przy długości fali 650-760 nm i obrazy fluorescencyjne komórek JIMT-1 transdukowanych przez EGFP przy długościach fal 488 nm (wzbudzenie) i 500-550 nm (emisja).
6. Wybierz liczbę pól i liczbę punktów czasowych dla obrazowania.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Aby przeanalizować wydajność ADCC, zliczane są żywotne ogniwa JIMT-1. Komórki docelowe zabite przez ADCC odrywają się od powierzchni i oddalają się od płaszczyzny ogniskowej mikroskopu. Dlatego różnica między liczbą żywotnych komórek na początku i na końcu reakcji ADCC odpowiada komórkom docelowym wyeliminowanym przez ADCC. Aby pokazać, jak zbudować sekwencję oceny, na filmie pokazano kontrolną studnię ADCC.

1. Użyj modułu Znajdź komórki, aby wykryć regiony na obrazie, które odpowiadają komórkom.
   UWAGA: Każda komórka jest wykrywana jako obszar na obrazie o większej intensywności fluorescencji niż jej otoczenie.
2. Wybierz komórki za pomocą wbudowanego algorytmu M o średnicy co najmniej 80 μm.
3. Ustaw czułość podziału, która dzieli duży obiekt na mniejsze, na 0,5.
4. Ustaw Wspólny próg (najniższy poziom intensywności pikseli) na 0.
5. Wyklucz wykrywanie obszaru tła o wysokiej intensywności fluorescencji EGFP w dwóch krokach.
   1. Najpierw użyj funkcji Oblicz właściwości intensywności, aby określić intensywność fluorescencji EGFP w poprzednio wybranym regionie komórek.
   2. Ustaw minimalny i maksymalny próg intensywności za pomocą opcji Wybierz populację.

Wyniki

Aby zademonstrować, jak test działa w rzeczywistości, stworzyliśmy bibliotekę testową składającą się z 16 związków wybranych losowo z półek laboratoryjnych (Rysunek 3). Ponadto DMSO został również włączony jako kontrola negatywna, a trzy związki inhibitora polimeryzacji mikrotubul (kolchicyna, winkrystyna i podofilotoksyna) jako kontrole pozytywne. Oczekiwano, że te ostatnie hamują ADCC poprzez zakłócanie migracji komórek NK do komórek nowotworowych i degranulacji komórek NK. Wszystkie badane związki ...

Dyskusja

Reakcja ADCC została opisana stosunkowo dawno temu. Opisano również kluczowe zdarzenia molekularne tego procesu¹⁹. Metody pomiaru ADCC wahają się od złotego standardu testu uwalniania chromu promieniotwórczego, testów uwalniania enzymów cytoplazmatycznych do kilku testów cytometrii przepływowej lub mikropłytek opartych na fluorescencji²⁰. Jednak częstym ograniczeniem tych testów jest to, że nie nadają się one do zastosowań o wysokiej przepustowości. Wcześniej opracowaliśmy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-fluorouracyl	Applichem	A7686	w bibliotece złożonej
96-dołkowa płytka Cell Carrier Ultra	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	w bibliotece złożonej
CD16.176V.NK92 ogniwa	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	w bibliotece złożonej
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	w bibliotece złożonej
Colchicine	Sigma	C9754	w bibliotece złożonej
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	w bibliotece złożonej
Deksametazon	Sigma	D4902	w biblioteka związków
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	w JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	w bibliotece złożonej
Etopozyd	Sigma	E1383	E1383
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biosurica	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP i pożywka NK
Fisetin	Sigma	F4043	w bibliotece
złożonejRobot do obsługi cieczy Freedom EVO	, TECAN,
Gallotannin,	Fluka, Chemical Corp.	16201	w bibliotece złożonej
Glutamina	Gibco	35,050– 061	w oprogramowaniu NK medium
Harmony	PerkinElmer
Humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2 (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapeszt, Węgry	N/A Humulin
R (insulina)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP podłoże
IL-2	Novartis Hungá ria Kft.	PHC0026	w pożywce NK
Isatin	Sigma	114618	w bibliotece złożonej
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140– 050	w podłożu NK
Na-pirogronian	Lonza	BE13-115E	w podłożu
NK Naringenina	Sigma	N5893	w bibliotece złożonej
NQDI-1	Sigma	SML0185	w bibliotece złożonej
Sprzęt do analizy wysokiej zawartości Opera Phenix	PerkinElmer
Penicylina– streptomycyna	Biosura	LM-A4118	JIMT-1 EGFP i pożywka NK
Pentoksyfilline	Sigma	P1784	w bibliotece złożonej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Lonza	BE17-517Q	do mycia komórek
Podofilotoksyna	Sigma	P4405	w bibliotece złożonej
Kwercetyna	Sigma	Q4951	w bibliotece
złożonejKwas garbnikowy	Sigma	T8406	w bibliotece złożonej
Temozolomid	Sigma	T2577	w bibliotece złożonej
Błękit trypanowy 0,4% roztwór	Sigma	T8154	do zliczania komórek
Siarczan winkrystyny	Sigma	V0400000	w bibliotece złożonej
α-MEM	Sigma	M8042	w podłożu NK