Artykuł metodologiczny

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64488

⸱

19 maja 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do samoodnawiania się i potencjał różnicowania wielu linii są ogólnie uważane za cechy definiujące hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC). Jednak liczne badania sugerują, że w kompartmencie HSC istnieje funkcjonalna niejednorodność. Niedawne analizy pojedynczych komórek wykazały istnienie klonów HSC o różnym losie komórek w obrębie przedziału HSC, które są określane jako tendencyjne klony HSC. Mechanizmy leżące u podstaw niejednorodnych lub słabo odtwarzalnych wyników są słabo poznane, zwłaszcza w odniesieniu do długości samoodnawiania, gdy oczyszczone frakcje HSC są przeszczepiane za pomocą konwencjonalnego barwienia immunologicznego. W związku z tym kluczowe znaczenie dla rozwiązania tego problemu ma ustanowienie powtarzalnej metody izolacji długoterminowych HSC (LT-HSC) i krótkoterminowych HSC (ST-HSC), zdefiniowanej na podstawie długości ich samoodnawiania. Korzystając z bezstronnych, wieloetapowych badań przesiewowych, zidentyfikowaliśmy czynnik transkrypcyjny, Hoxb5, który może być wyłącznym markerem LT-HSC w układzie krwiotwórczym myszy. Na podstawie tego odkrycia ustaliliśmy linię myszy reporterowych Hoxb5 i z powodzeniem wyizolowaliśmy LT-HSC i ST-HSC. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół izolacji LT-HSC i ST-HSC za pomocą systemu reporterskiego Hoxb5. Ta metoda izolacji pomoże naukowcom lepiej zrozumieć mechanizmy samoodnawiania się i biologiczne podstawy takiej heterogeniczności w kompartmencie HSC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), które posiadają zdolność do samoodnawiania się i wielomocność, znajdują się na szczycie hierarchii hematopoetycznej 1,2. W 1988 roku Weissman i współpracownicy po raz pierwszy wykazali, że izolację mysich HSC można osiągnąć za pomocą cytometrii przepływowej3. Następnie stwierdzono, że frakcja zdefiniowana przez kombinację markerów powierzchni komórki, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, zawiera wszystkie HSC u myszy4,5,6,7,8.

Immunofenotypowo zdefiniowane (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC (zwane dalej pHSC) były wcześniej uważane za funkcjonalnie jednorodne. Jednak ostatnie analizy pojedynczych komórek wykazały, że pHSC nadal wykazują niejednorodność pod względem zdolności do samoodnawiania się9,10 i multipotency11,12. W szczególności wydaje się, że we frakcji pHSC istnieją dwie populacje pod względem ich zdolności do samoodnawiania: długoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste (LT-HSC), które mają ciągłą zdolność do samoodnawiania, oraz krótkoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste (ST-HSC), które mają przejściową zdolność do samoodnawiania9,10.

Do tej pory molekularne mechanizmy zdolności do samoodnawiania się, które odróżniają LT-HSC i ST-HSC, pozostają słabo poznane. Kluczowe znaczenie ma wyizolowanie obu populacji komórek w oparciu o ich zdolności do samoodnawiania się i odkrycie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Wprowadzono również kilka systemów reporterskich do oczyszczania LT-HSCs13,14,15; jednak czystość LT-HSC definiowana przez każdy system reporterowy jest zmienna, a wyłączne oczyszczanie LT-HSC nie zostało do tej pory osiągnięte.

Dlatego opracowanie systemu izolacji dla LT-HSC i ST-HSC przyspieszy badania nad zdolnością do samoodnawiania się we frakcji pHSC. W izolacji LT-HSC i ST-HSC, badanie wykorzystujące wieloetapowe, bezstronne badania przesiewowe zidentyfikowało pojedynczy gen, Hoxb5, który jest niejednorodnie wyrażany w pHSC frakcja16. Ponadto analiza szpiku kostnego myszy reporterowych Hoxb5 wykazała, że około 20%-25% frakcji pHSC składa się z komórekpos Hoxb5. Konkurencyjny test transplantacyjny z użyciem Hoxb5pos pHSC i Hoxb5neg pHSC wykazał, że tylko Hoxb5pos pHSC posiadają długoterminową zdolność do samoodnawiania, podczas gdy Hoxb5neg pHSC tracą swoją zdolność do samoodnawiania się w krótkim czasie, co wskazuje, że Hoxb5 identyfikuje LT-HSC w pHSC fraction16.

Tutaj demonstrujemy krok po kroku protokół izolowania LT-HSC i ST-HSC za pomocą systemu reporterskiego Hoxb5. Ponadto przedstawiamy konkurencyjny test transplantacyjny w celu oceny zdolności do samoodnawiania się Hoxb5pos/neg pHSC (Rysunek 1). Ten system reporterski Hoxb5 pozwala nam prospektywnie izolować LT-HSC i ST-HSC i przyczynia się do zrozumienia cech specyficznych dla LT-HSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Wstępne kondycjonowanie myszy biorcy

  1. Przygotuj samce myszy kongenicznych C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni jako myszy biorców. Liczba myszy biorców zależy od protokołu eksperymentalnego. Zazwyczaj przygotowujemy 10-20 myszy na każdy stan.
    1. Nakarm myszy wysterylizowaną wodą uzupełnioną enrofloksacyną (170 mg/l). Ponieważ napromieniowane myszy biorcze są bardzo podatne na infekcje, należy utrzymywać klatki w jak największej czystości.
      UWAGA: Suplementacja antybiotykami rozpoczyna się 24 godziny przed napromienianiem i trwa przez 3 tygodnie po przeszczepie, aby uniknąć infekcji.
  2. Napromienianie całego ciała
    1. Napromienianie całego ciała niszczy komórki szpiku kostnego biorcy, aby zapewnić wszczepienie komórek dawcy. Przenieś myszy biorcę do klatki do napromieniania. Myszy biorcę należy napromieniować w sposób śmiertelny pojedynczą dawką 8,7 Gy na 12-16 godzin przed przeszczepem.
      UWAGA: Dawka i czas promieniowania mogą się różnić w zależności od sprzętu. Śmiertelna dawka promieniowania powinna zostać potwierdzona za pomocą naświetlacza i szczepu myszy badacza.
    2. Wróć do ich klatek po napromieniowaniu całego ciała.

2. Pobieranie komórek szpiku kostnego dawcy

  1. Przygotuj samca myszy Hoxb5-tri-mCherry w wieku 12 tygodni i poddaj mysz eutanazji poprzez ekspozycję na CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub przy użyciu metod zatwierdzonych przez lokalną komisję etyki zwierząt.
    UWAGA: Objętość odczynnika na mysz jest opisana w poniższych krokach.
  2. W sterylnych warunkach usuń skórę i odsłoń kości (kość udowa, piszczelowa, miednica, kość ramienna). Wytnij główne mięśnie i zabierz kości (kość udową, piszczelową, miednicę, kość ramienną) od myszy. Umieść je w sterylnych naczyniach do hodowli komórkowych z lodowatym PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+.
  3. Przytnij mięśnie i tkanki włókniste z kości za pomocą pęsety, małych nożyczek i chusteczek, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Uważaj, aby nie złamać kości podczas tego kroku. Wyrzuć wszelkie złamane kości, aby zachować sterylność.
  4. Wysterylizuj moździerz i tłuczek 70% etanolem (EtOH) i pozwól im całkowicie wyschnąć. Zrównoważyć buforem barwiącym komórki (PBS wolny od Ca2 + i Mg2 + uzupełniony 2% inaktywowanym termicznie FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
  5. Umieść kości w moździerzu i dodaj 3 ml buforu barwiącego komórki. Zmiażdż kości tłuczkiem. Zdezagregować grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm do probówki o pojemności 50 ml.
  6. Powtarzaj krok 2.5, aż roztwór stanie się klarowny. Zwykle wystarczą trzy razy.

3. Separacja komórek c-kit+ przez sortowanie magnetyczne

  1. Barwienie przeciwciał do sortowania magnetycznego
    1. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do barwienia komórek. Dodać 10 μl szczurzej IgG (5 mg/ml) w celu zmniejszenia nieswoistego wiązania przeciwciał i delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety P1,000. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
    2. Dodać przeciwciało c-Kit (klon 2B8) o stężeniu 4 μg/ml i wymieszać z pipetą P1,000. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
    3. Dodaj 5 ml buforu do barwienia komórek i dobrze wymieszaj. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g, 4 °C, 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do barwienia komórek.
    4. Dodaj 35 μl mikrogranulek anty-APC, aby wzbogacić komórki c-Kit+ i wymieszaj z pipetą P1,000. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
    5. Dodaj 4-5 ml buforu barwiącego komórki. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do barwienia komórek.
  2. Magnetyczne sortowanie ogniw c-Kit+
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby posortować komórki. Krótko mówiąc, zalać magnetyczną kolumnę sortującą 3 ml buforu do barwienia komórek. Przefiltrować próbkę (1 ml) przez sitko o wielkości 40 μm i załadować próbkę do magnetycznej kolumny sortującej.
    2. Przemyć, dodając trzykrotnie 3 ml buforu do barwienia komórek. Bufor do barwienia komórek należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty.
    3. Umieść magnetyczną kolumnę sortującą na lodowatej probówce o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml buforu do barwienia komórek. Wypłukać komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Utrzymuj przepływ na lodzie.
      UWAGA: W przypadku przypadkowej utraty próbki utrzymujemy przepływ do końca eksperymentu.

4. Barwienie krwiotwórczych komórek macierzystych

  1. Odwirować próbkę przygotowaną w kroku 3.2.3 w temperaturze 400 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
  2. Dodać przeciwciało CD34 (klon RAM34) o stężeniu 50 μg/ml do osadu i inkubować na lodzie przez 60 min.
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie komórek podporowych w ciągu pierwszej godziny inkubacji z CD34 w celu skrócenia czasu przetwarzania.
  3. Przygotować główną mieszaninę przeciwciał zgodnie z tabelą 1. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do próbki i inkubować na lodzie przez 30 minut. Przeciwciało przeciwko antygenowi CD34 (klon; RAM34) wymaga 90 minut na wystarczające zabarwienie.
  4. Dodaj 4-5 ml buforu do barwienia komórek. Odwirować próbkę w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Dodać streptawidynę-BUV737 w stężeniu 3 μg/ml do osadu i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  5. Dodaj 4-5 ml buforu do barwienia komórek. Odwirować próbkę w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl buforu do barwienia komórek. Próbkę należy przechowywać na lodzie.

5. Wspomaganie przygotowania komórek

  1. Przygotuj mysz kongeniczną CD45.1 + CD45.2 + w wieku 12 tygodni; najlepiej, aby była to mysz dawca. Poddaj mysz eutanazji poprzez narażenie na CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub przy użyciu metod zatwierdzonych przez lokalną komisję etyki zwierząt.
    UWAGA: W podanym przykładzie myszy kongeniczne CD45.1 + CD45.2 + zostały wyhodowane we własnym zakresie przez skrzyżowanie B6. Myszy kongeniczne CD45.1 z myszami C57BL/6J16.
  2. W sterylnych warunkach weź zarówno kości udowe, jak i piszczelowe i umieść je w sterylnych naczyniach do hodowli komórkowych z lodowatym PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+. Przytnij mięśnie i tkanki włókniste z kości za pomocą pęsety i małych nożyczek.
  3. Odetnij oba końce kości ostrymi, sterylnymi nożyczkami. Użyj igły 23 G i strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej lodowatym buforem zawiesiny komórek (PBS wolny od Ca2 + i Mg2 + uzupełniony 2% inaktywowanym termicznie FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny), aby wypłukać szpik kostny do sterylnego naczynia do hodowli komórkowych z buforem zawiesiny komórek. Zdezagregować grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania.
  4. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm za pomocą pipety P1 000. Policzyć liczbę komórek w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru i przygotować zawiesinę komórek szpiku kostnego zawierającą 1 x 106 komórek/ml.
  5. Przenieść 200 μl zawiesiny komórek szpiku kostnego (2 x 105 komórek) na 96-dołkową płytkę o okrągłym dnie. Przechowywać na lodzie aż do użycia.
    UWAGA: Płytki z okrągłym dnem są zalecane do łatwego zbierania komórek.

6. Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC sortowanie

  1. Konfiguracja bramkowania
    1. Przenieść 400 μl próbki przygotowanej w kroku 4.5 do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskiem z sitkiem o wielkości 35 μm. Przygotuj odczynnik do barwienia martwych komórek i dodaj go do próbki przed analizą zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Włącz cytometr przepływowy i uruchom oprogramowanie analityczne zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie naciśnij przycisk Załaduj i pobierz plik data.
      UWAGA: W celu zwiększenia czystości sortowanych komórek zaleca się stosowanie cytometru przepływowego wyposażonego w pięć laserów i dyszę o średnicy 70 μm.
    3. Po wykluczeniu dubletów, martwych komórek i komórek dodatnich pod względem linii, bramka frakcji Lineage−c-Kit + Sca-1 +. Następnie wyklucz frakcję Flk2+. Następnie bramka Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC w CD150+CD34−/low fraction (Rysunek 2). Wykonaj kompensację nakładania się widma w pierwszym eksperymencie.
      UWAGA: Oczekuje się, że komórki dodatnie Hoxb5 będą reprezentować 20%-25% frakcji Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34− / lowFlk2−.
  2. Sortowanie Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC
    1. Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości białka z 600 μl PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+ uzupełnionego 10% inaktywowanym termicznie FBS.
    2. Umieść probówkę o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml na urządzeniu do sortowania i posortuj Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC do probówki o pojemności 1,5 ml, korzystając ze strategii bramkowania ustawionej w kroku 6.1.3. W pierwszym sortowaniu należy użyć wydajności z trybu dokładności sortowania.
    3. Ustawić 96-dołkową płytkę z komórkami podporowymi przygotowanymi w kroku 5.5 na etapie automatycznego osadzania komórek (ACDU). Umieścić 1,5 ml probówki o niskiej zawartości białka, przygotowanej w kroku 6.2.2, do portu ładowania cytometru przepływowego.
    4. Posortuj Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC na 96-dołkową płytkę z komórkami nośnymi, używając strategii bramkowania ustawionej w kroku 6.1.3. Posortuj 10 punktów Hoxb5lub Hoxb5neg pHSC, aby przetestować ich zdolność do samoodnawiania.
      UWAGA: W celu zwiększenia czystości zaleca się podwójne sortowanie. W drugim sortowaniu należy użyć czystości jako zalecanego trybu precyzji sortowania.
    5. Zazwyczaj po podwójnym sortowaniu zbiera się 500-1,000pHSC Hoxb5 pos i 1,500-4,000Hoxb5 neg pHSC. Kontynuuj procedury przeszczepu tak szybko, jak to możliwe po sortowaniu HSC, aby zwiększyć żywotność komórek (najlepiej w ciągu 1-2 godzin).

7. Przeszczep

  1. Umieścić 96-dołkową płytkę posortowaną przez HSC, przygotowaną w kroku 6.2.4, na lodzie. Z 96-dołkową płytką sortowaną przez HSC należy obchodzić się w sterylnych warunkach, najlepiej w kapturze komórki.
  2. Znieczulić mysz biorcę 2% izofluranem w komorze indukcyjnej znieczulenia gazowego. Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, usuń je i połóż na boku. Aby zapewnić wystarczające znieczulenie, upewnij się, że nie ma ruchu w odpowiedzi na szkodliwy bodziec.
  3. Po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia należy jak najszybciej wykonać iniekcję zaoczodołową, aby zapobiec odzyskaniu przytomności przez mysz. Iniekcja retroorbitalna trwa mniej niż 30 s.
    UWAGA: Ponieważ czas iniekcji jest krótki, zabieg kończymy bez nakładania maści okulistycznej do oczu. Jeśli jednak zabieg trwa dłużej, zalecamy zastosowanie maści okulistycznej.
  4. Delikatnie odpipetować komórki na posortowanej przez HSC 96-dołkowej płytce, aby je wymieszać. Zebrać komórki dawcy na płytce sortującej za pomocą strzykawki insulinowej 30 G i wstrzyknąć je do zaoczodołowego splotu żylnego myszy biorcy. Zalecana objętość do wstrzykiwań to ≤200 μl.
  5. Obserwuj, aż myszy będą przytomne i poruszają się w czystej klatce. Wróć do klatek po potwierdzeniu ich wyzdrowienia.

8. Analiza krwi obwodowej

  1. Zebrać 50 μl krwi obwodowej z żyły ogonowej i ponownie zawiesić ją ze 100 μl PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+ z 2 mM EDTA. Przenieść wszystkie próbki na płytkę 96-dołkową. Odwirować w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  2. Dodać 200 μl buforu do lizy krwinek czerwonych i inkubować na lodzie przez 3 minuty. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, a supernatant odrzucić. Powtórz jeszcze raz.
  3. Dodać 200 μl buforu do barwienia komórek. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  4. Przygotować główną mieszaninę przeciwciał zgodnie z tabelą 2. Dodać 50 μl głównej mieszanki przeciwciał i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  5. Dodać 150 μl buforu do barwienia komórek. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  6. Dodać 200 μl buforu do barwienia komórek. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić ponownie w 200 μl buforu do barwienia komórek i dodać odczynnik do barwienia martwych komórek przed analizą zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Analizuj chimeryzm krwi obwodowej za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano wcześniej16. Zbierz krew po 4 tygodniach, 8 tygodniach, 12 i 16 tygodniach po przeszczepie, aby śledzić rekonstrukcję wieloliniową. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej znajdują się na Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednio, zdolność do samoodnawiania była mierzona za pomocą konkurencyjnych testów transplantacyjnych, w których uważa się, że HSC dawcy zachowują swoją zdolność do samoodnawiania się tylko wtedy, gdy obserwuje się wieloliniowe komórki dawcy we krwi obwodowej biorcy17. Ponadto kilka raportów definiuje LT-HSC jako komórki, które kontynuują wytwarzanie komórek krwi obwodowej kilka miesięcy po drugim przeszczepie szpiku kostnego10,18. Dlat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, HSC zdefiniowane na powierzchni komórki zostały przygotowane do badania funkcji HSC, takich jak zdolność do samoodnawiania się i multipotencja 19,20,21. Jednak zdefiniowana immunofenotypowo (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) frakcja HSC zawiera dwie dyskretne populacje HSC: LT-HSCs i ST-HSCs 9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Hiroshi Kiyonari za opiekę nad zwierzętami i dostarczenie myszy odbiorcom w RIKEN BDR, a także Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka i Masaki Miyahashi za zarządzanie laboratorium na Uniwersytecie Kobe. Autorzy bardzo doceniają również nieustanne wsparcie dla tych prac. Masanori Miyanishi był wspierany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant Grants Numery JP17K07407 i JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders oraz AMED-PRIME, AMED w ramach grantu o numerze JP18gm6110020. Taro Sakamaki jest wspierany przez JSPS KAKENHI Granty o numerach JP21K20669 i JP22K16334 oraz był wspierany przez JSPS Core-to-Core Program oraz RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi otrzymał wsparcie od JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 ml pasek z 8 probówkami, nasadka kopułkowaSSIbio3230-00
0,5 M EDTA pH 8,0IinvtrogenAM9260G
100 µ m Strzykawka do insulinyFalcon352360
30GBD326668
40 & mikro; m Sitko do komórekFalcon352340
5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem z sitkiem do komórekFALCON352235
7-AAD Roztwór do barwienia żywotnościBioLegend420404
96 well U-BottomFALCON351177
Anti-APC-MicroBeadsMilteny biotec130-090-855
Aspirator z pułapką kolbaBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotyna (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6. Myszy kongeniczne CD45.1 Sankyo Labo ServiceN/A Baytril
10%BAYER341106546
BD FACS Aria II na specjalne zamówienie BDN/A
Brilliant bare bufferBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotyna (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotyna (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)Myszy
CD45.1/CD45.2N/A/AWyhodowane w naszym laboratorium
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotyna (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotyna (53-6.7)BioLegend
15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Probówka wirówkowa 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) bez Ca i Mg, płyn Nacalai14249-24
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo wersja 10BD Biosciences 
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotyna (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mMyszy wiśniowe (C57BL/6J tło) N/AN/AWyhodowane w naszym laboratorium
IgG z surowicy szczurów, klasy technicznej, >=80% (SDS-PAGE), buforowany roztwór wodnySigma-AldrichI8015-100MG
izofluranPfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
LS KolumnyMilteny biotec130-042-401
Bufor do lizy BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Mikropłytka do hodowli tkankowej (do komórki adhezyjnej) 6WellIWAKI3810-006
Separator MidiMACSMilteny biotec130-042-302
Klatki dla myszyNatsume SeisakushoKN-331
Wielofunkcyjna wirówka chłodniczaTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Mieszanina penicyliny i streptomycynyNacalai26253-84
Zaprawa porcelanowa φ 120mm z tłuczkiemAsone6-549-03
Białkowa tubka LoBind 1,5 ml Eppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Ostrze skalpela ze stali nierdzewnejFastGeneFG-B2010
Streptawidyna-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Ogranicznik żył ogonowych dla myszy standardBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-Biotyna (TER-119)BioLegend116204
Terumo 5ml Koncentryczna strzykawka Luer-SlipTERUMOSS-05LZ
Igła podskórna Terumo 23G x 1TERUMONN-2325-R
kongeniczne BioLegend 100341 N 553775 Probówka wirówkowa 100704 https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
  4. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  5. Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
  6. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  7. Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
  8. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  9. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
  10. Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
  11. Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
  12. Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075(2016).
  13. Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
  14. Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
  15. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  16. Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
  17. Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
  18. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
  19. Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
  20. Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  23. Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
  24. Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
  25. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
  26. Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
  27. Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

d ugoterminowe kom rki macierzyste krwikr tkoterminowe kom rki macierzyste krwimyszy reporterowe Hoxb5cytometria przep ywowaizolacja szpiku kostnegomechanizmy samoodnawianiasortowanie kom rekkom rki lineage negativer nicowanie wieloliniowe

Powiązane artykuły