Ocena wpływu biotoksyn na funkcje komórek odpornościowych u danio pręgowanego

Podsumowanie

Ten protokół opisuje testy cytometryczne przepływowe, które mogą ocenić wpływ ekspozycji na toksyny na funkcje endocytarne różnych subpopulacji leukocytów danio pręgowanego. Zastosowanie specyficznych inhibitorów funkcjonalnych w teście pozwala na różnicowanie zmienionych mechanizmów endocytarnych.

Streszczenie

Różne toksyny biologiczne mogą być obecne na szkodliwych poziomach w środowisku wodnym. Sinice to zróżnicowana grupa mikroorganizmów prokariotycznych, które wytwarzają cyjanotoksyny w środowisku wodnym. Te biotoksyny mogą być hepatotoksynami, dermatoksynami lub neurotoksynami i mogą wpływać na ryby i ssaki. Przy wysokich poziomach związki te są śmiertelne. Na poziomach nieśmiertelnych działają podstępnie i wpływają na funkcje komórek odpornościowych. Biotoksyny wytwarzane przez algi obejmują mikrocystynę i anatoksynę A. Zwierzęta wodne mogą również spożywać materiał zanieczyszczony neurotoksyną botulinową E (BoNT/E) wytwarzaną przez Clostridium botulinum, co również prowadzi do śmierci lub osłabienia funkcji odpornościowych. Danio pręgowany może być używany do badania, jak toksyny wpływają na funkcje komórek odpornościowych. W tych badaniach ekspozycję na toksyny można przeprowadzać in vivo lub in vitro. W badaniach in vivo wystawia danio pręgowanego na działanie toksyny, a następnie komórki są izolowane. Metoda ta pokazuje, w jaki sposób środowisko tkankowe może wpływać na funkcję leukocytów. W badaniach in vitro najpierw izoluje się komórki, a następnie wystawia je na działanie toksyny w dołkach hodowlanych. Leukocyty uzyskuje się przez ekstrakcję szpiku nerkowego, a następnie wirowanie w gradiacji gęstości. Sposób, w jaki leukocyty internalizują patogeny, zależy od mechanizmów endocytarnych. Testy fagocytozy cytometrii przepływowej pokazują, czy mechanizmy endocytarne zostały zmienione przez ekspozycję na toksyny. Brakuje badań z wykorzystaniem izolowanych leukocytów w celu określenia, w jaki sposób toksyny powodują dysfunkcję odporności. Procedury opisane w tym artykule umożliwią laboratoriom wykorzystanie danio pręgowanego do badania mechanizmów, na które wpływa toksyna środowiskowa zmniejszająca funkcje endocytarne komórek odpornościowych.

Wprowadzenie

Istnieje wiele rodzajów środowiskowych biotoksyn i środków immunosupresyjnych. Zakwity glonów, które zawierają toksyny bakteryjne, występują w wodach śródlądowych i mogą również występować jako biofilmy¹. Sinice (sinice) naturalnie występują we wszystkich ekosystemach słodkowodnych. Zakwity sinic znacznie wzrosły w systemach słodkowodnych². W pewnych momentach cyjanobakterie mogą wytwarzać toksyny, które są szkodliwe dla zwierząt wodnych i lądowych. Toksyny te mogą wpływać na wątrobę, skórę i błony śluzowe i/lub układ nerwowy. Dwa związki wytwarzane przez cyjanobakterie to mikrocystyna i anatoksyna A. Mikrocystyna jest cyklicznym heptapeptydem³. Anatoksyna A jest alkaloidem⁴. Neurotoksyna botulinowa E (BoNT/E) to kolejna toksyna występująca w organizmach wodnych. Jest wytwarzany przez Clostridium botulinum i może być spożywany przez zwierzęta wodne⁵.

Narażenie na toksyny środowiskowe wpływa na ryby i może również wpływać na zdrowie zwierząt i zwiększać występowanie chorób⁶. Zrozumienie, w jaki sposób te toksyny wpływają na komórki odpornościowe, ma fundamentalne znaczenie dla określenia ryzyka związanego z narażeniem na te substancje. Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badania wpływu toksyn środowiskowych na komórki odpornościowe⁷. Opracowanie metody wykorzystującej cytometrię przepływową i leukocyty danio pręgowanego jest bardzo korzystne. Danio pręgowany ma fizjologiczne znaczenie dla ludzi, a metoda ta może być stosowana w wielu obszarach badawczych, od podstawowej toksykologii i immunologii po odkrywanie leków i biologię rozwojową. Ponieważ są to organizmy wodne, danio pręgowany są szczególnie odpowiednie do badania wpływu toksyn środowiskowych przenoszonych przez wodę⁷. Wykorzystanie danio pręgowanego jest tańsze niż w przypadku innych modeli kręgowców, a ich stosowanie budzi mniej obaw etycznych.

Białe krwinki, czyli leukocyty, są pierwszą linią obrony komórkowej przed organizmami chorobotwórczymi. Endocytoza to proces, w którym komórka pobiera lub internalizuje płyn lub cząsteczkę, która znajduje się na zewnątrz komórki. Osiąga się to dzięki komórce zamykającej związek w pęcherzyku⁸. Leukocyty wykorzystują ten proces jako pierwszy krok w zabijaniu patogenów i przygotowywaniu obrony przed chorobą. Fagocytoza jest rodzajem endocytozy i była jedną z pierwszych metod stosowanych do badania wpływu zanieczyszczeń środowiska na zdrowie ryb⁹. Laboratorium Petrie-Hanson opracowało metody wykorzystujące leukocyty danio pręgowanego do badania biotoksyn pod kątem ich potencjalnej zdolności do zakłócania funkcji endocytarnych i fagocytarnych leukocytów oraz wpływania na obronę immunologiczną. Rodzaje endocytozy zawarte w tych metodach to pinocytoza, fagocytoza, fagocytoza zależna od receptora wapnia i fagocytoza za pośrednictwem receptora mannozy. Stosowanie metod cytometrii przepływowej u danio pręgowanego zostało po raz pierwszy opisane w Petrie-Hanson lab⁹ i są rutynowo używane do badania toksyn wodnych i patogenów. Zmutowany danio pręgowany Rag1^-/- nie ma limfocytów T i B¹⁰ i może być używany do specyficznego badania mechanizmów wrodzonych komórek odpornościowych.

Cytometria przepływowa jest oparta na laserze i może być używana do określania właściwości fizycznych komórek. Rozproszenie do przodu lub wartość FSC jest wykreślana na osi X i reprezentuje rozmiar komórki. Rozproszenie boczne lub SSC jest wykreślane na osi Y i reprezentuje ziarnistość cytoplazmatyczną komórki. Wynikowy wykres przedstawia populacje komórek o podobnych cechach fizycznych zgrupowane razem, przy czym różne typy komórek pojawiają się w różnych miejscach na wykresie punktowym. Populacje te mogą zmieniać położenie na wykresie punktowym wraz ze zmianą cech fizycznych komórek⁹. Zastosowanie tej techniki z leukocytami danio pręgowanego umożliwia naukowcom ocenę zmian w populacjach komórek w odpowiedzi na różne bodźce, w tym toksyny środowiskowe.

Cytometr przepływowy jest wielowymiarowy, a w ocenie można użyć wielu rodzajów fluoroforów, aby dokładniej scharakteryzować komórki i ich aktywność. W testach opisanych w tym protokole endocytoza charakteryzuje się pomiarem ilości materiału fluorescencyjnego, który komórka zinternalizowała. To, czy i w jaki sposób narażenie na toksyny wpływa na mechanizmy endocytarne, można określić, porównując zdolność komórek narażonych na działanie toksyn do wchłaniania materiału w porównaniu ze zdolnością komórek nienarażonych na toksyny za pomocą cytometrii przepływowej. Procesy endocytarne, które można ocenić w ten sposób, obejmują pinocytozę, endocytozę za pośrednictwem receptorów i fagocytozę.

Pinocytoza polega na pobieraniu rozpuszczalnych składników i nie wykorzystuje receptorów komórkowych. Wychwyt obejmuje cytoplazmatyczne przegrupowanie przez mikrofilamenty i mikrotubule w celu utworzenia małych wakuoli. Lucyferazy żółtej (LY) to barwnik fluorescencyjny używany do pomiaru wychwytu cieczy przez nieselektywną pinocytozę¹¹. Endocytoza zależna od receptorów polega na selektywnym wychwytywaniu dużych cząsteczek. Do oceny tego procesu można użyć dekstranu (DX) 40 znakowanego fluoresceiną (FITC). Fagocytoza jest formą endocytozy, która pochłania cząstki większe niż 0,5 mikrometra. Proces ten jest badany za pomocą procedur z użyciem FITC-DX70 i FITC-Eschericia coli. DX40 i DX70 mają masę cząsteczkową odpowiednio 40 000 i 70 000. FITC-E. coli jest standardowym laboratoryjnym szczepem E. coli związanym z fluorem, który można zmierzyć za pomocą cytometru przepływowego. Wiele form endocytozy zależnej od receptora wymaga wapnia jako cząsteczki sygnałowej i do przegrupowania cytoszkieletu⁹. Innym rodzajem endocytozy zależnej od receptora jest endocytoza za pośrednictwem receptora mannozy (MR). Receptory mannozy to białka transbłonowe, które rozpoznają formy mannanu na powierzchni komórek drobnoustrojów⁹. Aby zoptymalizować te procedury, należy utworzyć krzywą dawka-odpowiedź dla każdej toksyny w celu ustalenia dawek, które należy zastosować. Należy wykonać krzywą nasycenia dla LY, FITC-DX40, FITC-DX70 i FITC-E. coli, aby ocenić prawidłowe stężenie do użycia.

Mechanizmy używane przez leukocyty do internalizacji różnych cząsteczek mogą się różnić. Aby zasugerować, na który składnik procesu może mieć wpływ ekspozycja na toksyny, można dodać inhibitory w celu zablokowania mechanizmów fagocytarnych. Cytochalazyna D (CCD) hamuje ruch mikrotubul, a tym samym pinocytozę. CCD nie wpływa na endocytozę za pośrednictwem receptora¹¹. EDTA blokuje endocytozę zależną od receptora wapnia (Ca²⁺). Mannan jest naturalnym ligandem dla MR. Mannan jest używany jako inhibitor receptora mannozy do oceny, czy fagocytoza lub pinocytoza jest zależna od receptora mannozy⁹.

Celem tego protokołu jest pokazanie procedur określających, czy ekspozycja na toksyny wpłynęła na zdolność leukocytów fagocytarnych do wychwytywania patogenów. Protokoły te mogą również rozpoznać, czy zaburzony jest określony mechanizm endocytarny. Wykonanie tych testów na cytometrze przepływowym pozwala na dalszą dyskryminację poprzez wybór populacji leukocytów na podstawie wielkości i ziarnistości cytoplazmy w celu określenia, czy subpopulacje leukocytów zostały dotknięte w różny sposób. Metoda ta opiera się na elektronicznym bramkowaniu populacji komórek.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Mississippi (MSU-IACUC). Wszystkie danio pręgowane użyte w tym badaniu zostały wyhodowane z homozygotycznej kolonii zmutowanego rag1^-/- danio pręgowanego, wcześniej umieszczonej w specyficznej wylęgarni wolnej od patogenów w College of Veterinary Medicine, Mississippi State University (MSU)¹⁰. W wylęgarni tej rozmnażano również danio pręgowanego typu dzikiego. W tych badaniach ekspozycję na toksyny można przeprowadzać in vivo lub in vitro. Badania in vivo wystawiają danio pręgowanego na działanie toksyny, po czym leukocyty są izolowane, wskazując, w jaki sposób toksyna i mikrośrodowisko tkankowe mogą wchodzić w interakcje i wpływać na funkcję leukocytów. W badaniach in vitro izoluje się leukocyty, a następnie wystawia komórki na działanie toksyny w dołkach hodowlanych.

1. Przygotowanie odczynnika i roztworu

1. Bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS): (Zbilansowany roztwór soli Hanksa bez wapnia i magnezu (HBSS) + 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) (patrz tabela materiałów). Przygotuj to na świeżo przed izolacją komórki.
2. Pożywki do hodowli tkankowych (TCM): Użyj RPMI-1640 uzupełnionego glutamaxem i 10% płodową surowicą bydlęcą (patrz tabela materiałów).
3. Cytochalazyna D (CCD): Przygotować roztwór podstawowy, ponownie zawieszając dostępny w handlu produkt (patrz Tabela materiałów) w 1 ml 200-procentowego absolutnego etanolu. Przygotuj roztwór roboczy, dodając 20 μl podstawowego CCD do 980 μl buforu FACS, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 μg/ml.
4. EDTA: Roztwór podstawowy ma stężenie 1 mg/ml. Przygotować roztwór roboczy, dodając 100 μl roztworu podstawowego do 900 μl buforu FACS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
5. Mannan: Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml (patrz Tabela Materiałów). Następnie należy przygotować roztwór roboczy, dodając 100 μl roztworu podstawowego do 900 μl buforu FACS, aby uzyskać końcowe stężenie 500 μg/ml.
6. Przygotuj Lucyfer-Yellow (10 μg/ml) (LY, barwnik fluorescencyjny), Dextran-40 (DX-40, 500 μg/ml) i Dextran-70 (DX-70, 500 μg/mL) oddzielnie, sporządzając roztwór 1 mg/ml każdego z nich, ponownie zawieszając dostępne w handlu odczynniki (patrz Tabela Materiałów) w sterylnej wodzie.
7. Bakterie fluoresceinowe (FITC): Hoduj Escherichia coli DH5α (patrz tabela materiałów) z wytrząsaniem w 100 ml pożywki Luria Bertani (LB) uzupełnionej 50 μg/ml FITC przez noc w temperaturze 37 °C w środowisku chronionym przed światłem, uzyskując gęstość optyczną (OD) 0,8 przy 540 nm.
   1. Przemyć bakterie (3x) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez odwirowanie przez 10 minut przy 1000 x g, a następnie ogrzewanie w temperaturze 60 °C przez 20 min. Przemyć jeszcze 1 raz, a następnie dostosować stężenie bakterii do OD₅₄₀ 0,8. To będzie roztwór podstawowy.
   2. Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:100 (1 ml podstawy: 99 ml buforu FACS). Dostosuj końcowe stężenie do 1,8 x 10⁸ komórek/ml.

2. Pielęgnacja danio pręgowanego

1. Utrzymuj danio pręgowanego w jednoprzebiegowym systemie przepływowym na odchlorowanej wodzie miejskiej i karm wysokobiałkową mączkę rybną i żywą artemię do sytości.
2. W wieku 6 miesięcy usuń danio pręgowanego mieszanej płci z ich zbiorników i przetransportuj je do laboratorium badawczego w celu wykorzystania w eksperymencie. Jest to najlepszy wiek do wyizolowania optymalnej liczby leukocytów ze szpiku nerkowego⁹.

3. Izolacja komórek

1. Poddaj eutanazji 10 danio pręgowanego w tricainie (~100 ml 4 mg/ml buforowanego fosforanem sulfonianu trikainy/litr wody rybnej) (patrz Tabela materiałów) zgodnie z ustalonymi metodami⁹.
2. Umieść sitko o wielkości 40 μm w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
3. Usuń tkanki szpiku nerkowego⁹ i umieść je w C-probówce z 3 ml pożywki do hodowli tkankowej i homogenizuj tkankę za pomocą dysocjatora tkankowego. Jest to preferowana procedura.
4. Alternatywnie, rozbij tkanki gumową końcówką strzykawki o pojemności 3 ml w sitku do komórek. Po homogenizacji (lub rozbiciu) tkanki przelać zawiesinę przez sitko do komórek o wielkości 40 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
5. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 16 °C. Odlać sklarowany sklarent nadpokojowy. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml TCM. Powtórz ten krok dwukrotnie.
6. Ostrożnie ułóż komórki na 3 ml sterylnie przefiltrowanej pożywki o gradientzie gęstości (1,077 g/ml) w temperaturze pokojowej.
7. Następnie odwirować przy 800 x g przez 20 minut w temperaturze 16 °C. Upewnij się, że hamulec jest ustawiony na najniższe ustawienie, aby komórki nie zostały ponownie zawieszone po zatrzymaniu wirówki.
8. Usuń nieprzezroczystą warstwę kożucha z interfejsu do probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml.
9. Umyj komórki, dodając 5 ml TCM i mieszając pipetą Pasteura. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 16 °C.
10. Powtórz ten krok, odrzucając supernatant i ponownie zawieszając osad komórkowy w TCM, aby uzyskać około 1 x 10⁶ komórek/ml.

4. Test żywotności komórek

1. Aby monitorować żywotność komórek, oceń śmierć komórki za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI).
   1. Dodać PI (200 μg/ml) w stężeniu 5 μl/ml komórek, które mają być analizowane. Czytaj na kanale PE/Texas Red.
      UWAGA: Jodek propidyny dyfunduje przez otwory w błonach martwych komórek, barwiąc je w ten sposób. Oceniona żywotność w niniejszym badaniu wyniosła 85%.

5. Inkubacja toksyn

1. Podamy 200 μl komórek z izolowanej zawiesiny komórkowej do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (3 dołki do kontroli i 3 dołki do ekspozycji na toksyny). Pozwala to na przeprowadzanie replik w trzech egzemplarzach.
2. Dodaj 2 ml TCM do każdej studzienki.
3. Dodaj toksynę (~2,5 μg/ml) do trzech studzienek.
   UWAGA: Stężenie toksyny powinno być zoptymalizowane przed rozpoczęciem eksperymentu i będzie zależało od toksyny użytej do testu.
4. Inkubować płytkę do hodowli tkankowej przez żądany czas ekspozycji. Pożądany czas ekspozycji powinien być zoptymalizowany przed rozpoczęciem eksperymentu i będzie zależał od toksyny użytej do testu. W niniejszym badaniu czas ekspozycji wynosił ~1 h.
5. Po upływie czasu ekspozycji umieścić płytkę z kulturą tkankową na lodzie na 10 minut.
6. Pipetuj komórki w każdym dołku w górę i w dół, ostrożnie, aby usunąć wszelkie przylegające komórki z płytki.
7. Usunąć komórki z płytki do probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 14 ml.
8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 16 °C. Zawiesić komórki w 3 ml buforu FACS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
9. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml buforu FACS.
   UWAGA: W przypadku badań in vivo należy wystawić danio pręgowanego na działanie toksyny (w podobnym stężeniu, jak wspomniano powyżej), a następnie wyizolować komórki.

6. Test endocytozy

1. Podwielokrotność 100 μl komórek na 5 ml probówek do cytometrii przepływowej. Oznaczyć probówki w następujący sposób czterema probówkami z replikami z każdej studzienki: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Dodaj barwnik fluorescencyjny, jak podano w kroku 1.6 i kroku 1.7, do odpowiednich probówek: 50 μl LY do probówki (1), 50 μl DX40 do probówki (2); 50 μL DX70 do probówki (3); 50 μL FITC-E. coli do probówki (4).
3. Inkubować przez 1 godzinę. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej probówki.
4. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 16 °C. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS. Powtórz ten krok trzy razy. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej.

7. Cytometria przepływowa

1. Wykonaj cytometrię przepływową, aby zwizualizować populacje komórek i zebrać dane. Szczegółowe informacje można znaleźć w Hohn et al.⁹.
2. W pierwszym kroku zidentyfikuj docelowe populacje komórek. Użyj rozproszenia bocznego (SSC) (zwykle osi pionowej), aby usunąć zanieczyszczenia i małe, piknotyczne komórki po lewej stronie i rozproszenia do przodu (FSC) (zwykle osi poziomej), aby usunąć te same zanieczyszczenia na spodzie wykresu.
3. Wyeliminuj odczyty dubletów (komórki liczone dwukrotnie). Odbywa się to za pomocą bramki o geometrii impulsów (FSC-H x FSC-A).
4. Określ sygnał tła. Uruchom kontrolę fluorescencji tylko komórek i kontrolę fluorescencji izotypu dla każdego użytego fluorochromu, aby zidentyfikować poziomy fluorescencji tła.
   UWAGA: Każdy fluorochrom ma swój własny, unikalny poziom fluorescencji tła, na który wpływa autofluorescencja komórek i niespecyficzne wiązanie. Rozróżnia to prawdziwe sygnały dodatnie i fluorescencję tła. Podczas identyfikacji i bramkowania populacji komórek na podstawie fluorescencji, te wartości kontrolne są odejmowane od liczby pozytywnych zdarzeń, a wynikowa liczba jest liczbą używaną do analizy.
5. Uruchom próbki i zidentyfikuj populacje komórek, które mają zostać przebadane. Za pomocą FSC i SSC można morfologicznie scharakteryzować i zidentyfikować różne populacje komórek w mieszaninie komórek.
   UWAGA: FSC jest przede wszystkim związane z rozmiarem komórki. Większe ogniwa rozpraszają więcej światła w kierunku do przodu, co skutkuje wyższymi wartościami FSC, podczas gdy mniejsze ogniwa rozpraszają mniej światła i mają niższe wartości FSC. Komórki o różnych rozmiarach będą grupować się w klastry. Na przykład limfocyty, będąc mniejszymi, mogą pojawiać się jako osobne skupisko o niższych wartościach FSC w porównaniu z granulocytami. SSC jest związane z ziarnistością, złożonością i wewnętrzną strukturą komórki. Komórki o większej ziarnistości cytoplazmatycznej będą miały wyższe wartości SSC. Podobne komórki będą się ze sobą grupować. Na przykład neutrofile mają ziarnistości cytoplazmatyczne i grupują się przy wyższej wartości SSC niż limfocyty.
6. Uruchom wszystkie próbki i w oparciu o FSC/SSC zastosuj bramki do populacji komórek, które mają być dalej analizowane. Obszary bramkowane są stosowane na podstawie gęstości komórek i populacji będących przedmiotem zainteresowania.
7. Wykreśl bramkowane obszary na histogramach, aby przeanalizować średnią intensywność fluorescencji (MFI) FITC w każdej bramce dla fluorescencji przy 495 nm / 519 nm za pomocą niebieskiego lasera.
8. Eksportuj liczbę komórek zgodnie z ustaleniami oprogramowania, aby wyróżniać się w programie do analizy.
9. Analizuj dane w pakiecie oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów).
10. Porównaj MFI każdej populacji komórek kontrolnych z MFI populacji komórek narażonych na działanie toksyny.

8. Wpływ toksyny na mechanizmy endocytarne oraz wpływ inhibitorów CCD, EDTA i mannanu na mechanizmy endocytarne

UWAGA: Aby wchłonąć płyny lub cząsteczki, cytoplazma komórki aktywnie się porusza. Ruch ten wymaga wielu elementów strukturalnych i ścieżek sygnałowych. Biotoksyny mogą wpływać na każdy z tych elementów lub szlaków. Porównanie działania konkretnie scharakteryzowanych inhibitorów może pomóc w rozeznaniu, w jaki sposób biotoksyna może działać¹¹.

1. Wykonaj izolację komórek zgodnie z opisem w kroku 3.
2. Podwielokrotność 100 μl komórek do 5 ml probówek do cytometrii przepływowej (z czterema probówkami z kontrpróbami z każdej studzienki).
   UWAGA: Oznacz probówki w następujący sposób: (5) CCD + LY (CCD hamuje pinocytozę poprzez hamowanie przegrupowania mikrowłókien i mikrotubul; LY służy do oceny wychwytu cieczy przez mikropinocytozę)⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA blokuje fagocytozę i mikropinocytozę za pośrednictwem receptora zależnego od Ca^{2 +}; mierzenie, czy wychwyt obejmuje mechanizm zależny od wapnia). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Mannan + DX40 (mannan hamuje specyficzny wychwyt przez receptor mannozy, mierząc endocytozę zależną od MR⁹). (10) Mannan + DX70. (11) Mannan + FITC-E. coli.
3. Dodaj inhibitory: 1 μl CCD do probówki (5); 10 μl EDTA do probówek (6-8); 100 μl Mannanu do probówek (9-11). Postępuj zgodnie ze stężeniami wymienionymi w kroku 1. Inkubować przez 5 minut.
4. Dodać fluorescencyjną wtórną do odpowiednich probówek: 50 μL LY do probówki (1) i (5); 50 μL DX40 do probówki (2), (6) i (9); 50 μL DX70 do probówki (3), (7) i (10); 50 μL FITC-E. coli do probówki (4), (8) i (11). Inkubować przez 30 minut.
5. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej probówki. Wirować przy 400 x g w temperaturze 16 °C przez 5 min.
6. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS. Powtórz kroki 8.5-8.6 dwa razy.
7. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym, wykonując krok 7.

Wyniki

Testy endocytozy wykorzystują mieszane leukocyty wyizolowane z gradientów i bramkowane dla fagocytów i limfocytów, aby określić, czy określone mechanizmy komórkowe zostały zmienione przez ekspozycję na toksyny. Po pierwsze, komórki są bramkowane na podstawie rozmiaru i stopnia szczegółowości¹⁰. Martwe, pofragmentowane lub umierające komórki są wizualizowane w lewym dolnym rogu wykresu punktowego i są eliminowane, a nie analizowane pod kątem fagocytozy. Brama fagocytów obejmuje makrofagi, Natural Killer (komórki NK) i granulocyty, podczas gdy brama limfocytów obejmuje limfocyty, fagocytarne limfocyty B i niespecyficzne komórki cytotoksyczne (NCC) (Rysunek 1).

Fagocytoza jest determinowana przez absorpcję cząstek znakowanych FITC, jak wykazano odczytując fluorescencję przy 495 nm / 519 nm za pomocą niebieskiego lasera. Autofluorescencja tła i niespecyficzna fluorescencja wiązania są eliminowane przez uwzględnienie średniej intensywności fluorescencji (MFI) emitowanej przez komórki kontrolne i kontrolę izotypu. Dla każdego inhibitora należy wykonać krzywą dawka-odpowiedź w celu ustalenia stężeń, które należy zastosować. Jeśli wyniki cytometrii przepływowej komórek wystawionych na działanie badanej toksyny są takie same, jak wyniki komórek wystawionych na działanie inhibitora, oznacza to, że toksyna wywołuje podobny efekt i może hamować ten mechanizm endocytarny. Jeśli reakcje toksyny i inhibitora są addytywne, sugeruje to, że toksyna może hamować endocytozę za pomocą innego mechanizmu niż inhibitor.

Porównania są dokonywane między komórkami nieleczonymi a komórkami leczonymi badaną toksyną (Rysunek 2), komórkami leczonymi toksyną lub inhibitorem (Rysunek 3A) oraz komórkami leczonymi samym inhibitorem (Rysunek 3B). Reprezentatywne wyniki pokazują, że komórki leczone mikrocystyną były hamowane, podobnie jak komórki leczone CCD. Wyniki te pokazują, że mikrocystyna hamowała wychwyt płynów przez mikropinocytozę. Bramkowane komórki są analizowane za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a wyniki powinny być podawane jako średnia liczba komórek dodatnich dla FITC.

Rysunek 1: Reprezentatywny wykres rozrzutu cytometrii przepływowej leukocytów wyizolowanych z tkanki nerki danio pręgowanego typu dzikiego na podstawie charakterystyk rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC). Brama fagocytów obejmuje makrofagi/monocyty i granulocyty (23% bramkowanych komórek. Brama limfocytów obejmuje limfocyty, fagocytarne limfocyty B i niespecyficzne komórki cytotoksyczne (NCC) (26% bramkowanych komórek). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Średnia intensywność fluorescencji (MFI) komórek fagocytarnych bramkowanych w Rysunek 1 po ekspozycji na toksynę. Probówka (1) pokazuje niebarwione komórki, podczas gdy komórki w probówce (2) emitują fluorescencję poprzez wychwyt LY. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Średnia intensywność fluorescencji (MFI) fagocytów bramkowanych w Rysunek 1. Wychwyt żółcieni Lucyfera (LY) bez obecności inhibitora cytochalazyny D (CCD) (A); wychwyt LY z obecnością CCD. Probówka (1) pokazuje niebarwione komórki, podczas gdy komórki w probówce (2) emitują fluorescencję poprzez wychwyt LY. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przegląd kroków związanych z protokołem. *Czas trwania i zakres, w jakim ryby są narażone na działanie biotoksyny, będą się różnić w zależności od konkretnej użytej biotoksyny oraz przepisów i protokołów dotyczących opieki nad zwierzętami i bezpieczeństwa biologicznego różnych instytucji. **Zastosowane pożądane stężenie i zastosowany czas ekspozycji powinny być zoptymalizowane przed eksperymentem i będą zależeć od użytej toksyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wykorzystanie cytometrii przepływowej z leukocytami danio pręgowanego oferuje potężne i wszechstronne podejście do szczegółowego badania układu odpornościowego, oceny wpływu toksyn środowiskowych i ułatwiania badań toksykologicznych. Umożliwia szybką i skuteczną ocenę wpływu toksyn na komórki odpornościowe i odpowiedź immunologiczną. Wyniki ujawniają czynniki humoralne i sugerują, w jaki sposób fizjologia i metabolizm ryb wchodzą w interakcje z biotoksynami środowiskowymi. Przegląd protokołu przedstawiono na rysunku 4.

Istnieją jednak ograniczenia tych metod. Przygotowanie leukocytów danio pręgowanego do cytometrii przepływowej może być bardziej złożone w porównaniu z innymi modelami. Mały rozmiar danio pręgowanego może ograniczać ilość krwi i liczbę leukocytów dostępnych do analizy ^9,10. Procedury te wymagają dysocjacji tkanek w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, a żywotność komórek może wpływać na dokładność wyników. W porównaniu z modelami takimi jak myszy, zakres dostępnych narzędzi immunologicznych, takich jak przeciwciała specyficzne dla markerów komórkowych danio pręgowanego, jest bardziej ograniczony w przypadku danio pręgowanego. To ograniczenie może ograniczyć głębokość analizy, którą można przeprowadzić na leukocytach danio pręgowanego. Co więcej, interpretacja danych cytometrii przepływowej wymaga specjalistycznej wiedzy, zwłaszcza w przypadku złożonych odpowiedzi immunologicznych. Błędna interpretacja danych może prowadzić do błędnych wniosków, szczególnie w kontekście wpływu toksyn środowiskowych.

Wyniki próbek komórek bez dodatku inhibitorów można porównać z próbkami komórek z inhibitorami. Wyniki próbek komórek z dodatkiem toksyny należy porównać z próbkami komórek z inhibitorami. Jeśli rearanżacja cytoszkieletu została zaburzona, wychwyt LY będzie ograniczony. Jeśli toksyna hamuje wychwyt DX-40 lub DX-70, fagocytoza nie będzie fagocytozowana o różnych rozmiarach cząstek. Jeśli komórki nie pobierają FITC-E. coli, oznacza to, że toksyna zahamowała fagocytozę.

Podsumowując, danio pręgowany służy jako doskonały model do badania wpływu toksyn środowiskowych na komórki odpornościowe. Protokół ten przedstawia metodę wykorzystującą cytometrię przepływową i leukocyty danio pręgowanego do badań przesiewowych biotoksyn, ze szczególnym uwzględnieniem procesów endocytozy i fagocytozy¹¹. Celem tego badania jest ustalenie, czy narażenie na toksyny wpływa na zdolność leukocytów fagocytarnych do wychwytywania patogenów i dostrzeżenie potencjalnego wpływu na określone mechanizmy endocytarne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% płodowa surowica bydlęca	Gibco	A3160501
14 ml probówki wirówkowe z okrągłym dnem	BD Biosciences	352059
40 µ m Szczepnik komórek	Corning	07-201-430
ml probówki do cytometrii przepływowej	BD Biosciences	352235
50 ml stożkowa probówka wirówkowa	Corning	14-959-49A
Etanol absolutny	Fisher	BP2818-500
Automatyczny licznik komórek	Life Technologies Countess II FL		do badania żywotności komórek
Bydło albumina surowicy (BSA)	Sigma	A3059
cytochalazyna D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dekstran 40	Sigma	FD40-100MG
Dekstran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5&alfa; (lub inny laboratoryjny szczep bakteryjny)	New England Biolabs	C29871
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma	ED4SS
Oprogramowanie do analizy przepływu	Oprogramowanie
Cytometr przepływowy	Novocyte 3000
Fluoresceina	Fluka BioChemica	46950
motków zrównoważony roztwór soli bez wapnia i magnezu	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Yellow	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	P3813
RPMI-1640 z GlutaMax	Gibco	61870036
Oprogramowanie statystyczne	SPSS
Toksyna
Tricaine	Western Chemical Inc NC0342409