Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Podsumowanie

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Streszczenie

Mikroskop sił atomowych (AFM) zasadniczo mierzy interakcję między końcówką sondy AFM w nanoskali a powierzchnią próbki. Jeśli można określić ilościowo siłę wywieraną przez końcówkę sondy i jej powierzchnię styku z próbką, możliwe jest określenie właściwości mechanicznych w nanoskali (np. modułu sprężystości lub modułu Younga) badanej powierzchni. Szczegółowa procedura przeprowadzania ilościowych eksperymentów z nanotwardością opartą na wspornikach AFM znajduje się tutaj, wraz z reprezentatywnymi przykładami zastosowania tej techniki do określania modułów sprężystości wielu różnych typów próbek, w zakresie od kPa do GPa. Należą do nich żywe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i jądra w buforze fizjologicznym, zanurzone w żywicy odwodnione przekroje sosny loblolly oraz łupki Bakken o różnym składzie.

Dodatkowo, nanoindentacja oparta na wspornikach AFM jest używana do badania wytrzymałości na zerwanie (tj. siły przebicia) dwuwarstw fosfolipidowych. Omówiono ważne kwestie praktyczne, takie jak wybór i rozwój metody, wybór i kalibracja sondy, identyfikacja obszaru zainteresowania, niejednorodność próbki, rozmiar cechy i współczynnik kształtu, zużycie końcówki, chropowatość powierzchni oraz analiza danych i statystyki pomiarowe, aby pomóc w prawidłowym wdrożeniu techniki. Na koniec wykazano kolokalizację map nanomechanicznych pochodzących z AFM za pomocą technik mikroskopii elektronowej, które dostarczają dodatkowych informacji na temat składu pierwiastkowego.

Wprowadzenie

Zrozumienie właściwości mechanicznych materiałów jest jednym z najbardziej podstawowych i niezbędnych zadań w inżynierii. Do analizy właściwości materiałów sypkich dostępnych jest wiele metod charakteryzowania właściwości mechanicznych systemów materiałowych, w tym próby rozciągania¹, testy ściskania² oraz trzy- lub czteropunktowe testy zginania (przy zginaniu)³. Chociaż te testy w mikroskali mogą dostarczyć bezcennych informacji na temat właściwości materiałów sypkich, są one zazwyczaj przeprowadzane do awarii, a zatem są destrukcyjne. Ponadto brakuje im rozdzielczości przestrzennej niezbędnej do....

Protokół

UWAGA: Ze względu na szeroki wybór dostępnych na rynku AFM oraz różnorodność typów próbek i zastosowań, które istnieją dla nanoindentacji opartej na wspornikach, następujący protokół jest celowo zaprojektowany tak, aby był stosunkowo ogólny w swoim charakterze, skupiając się na wspólnych krokach niezbędnych dla wszystkich eksperymentów z nanowgłębieniami opartymi na wspornikach, niezależnie od instrumentu czy producenta. Z tego powodu autorzy zakładają, że czytelnik posiada przynajmniej podstawową wiedzę na temat obsługi konkretnego instrumentu wybranego do wykonywania nanoindentacji na bazie wsporników. Jednak oprócz ogólnego protokołu opisanego poniżej, jako

Wyniki

Krzywe siły-przemieszczenia
Rysunek 7 pokazuje reprezentatywne, bliskie ideału krzywe F-D uzyskane z eksperymentów nanoindentacji przeprowadzonych w powietrzu na próbkach sosny zatopionej w żywicy (Rysunek 7A) i w płynie (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS]) na jądrach mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (Rysunek 7B). Wykorzystanie dowolnego modelu mechaniki kontaktu opiera się na dokładnym i wiarygodnym określeniu początk.......

Dyskusja

Przygotowanie próbki
W przypadku nanowgłębienia w powietrzu typowe metody przygotowania obejmują kriosekcję (np. próbki tkanek), mielenie i/lub polerowanie, a następnie ultramikrotoming (np. próbki biologiczne zatopione w żywicy), mielenie jonowe lub przygotowanie skupionej wiązki jonów (np. próbki półprzewodnikowe, porowate lub o mieszanej twardości nienadające się do polerowania), polerowanie mechaniczne lub elektrochemiczne (np. stopy metali) lub osadzanie cienkowarstwowe (np. osadzanie warstwy a.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop sił atomowych	Bruker	Dimension Icon	Wykorzystuje oprogramowanie sterujące Nanoscope, w tym PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV) i eksperymentalne przestrzenie robocze Point-and-Shoot Ramping
AtomicJ	Amerykański Instytut Fizyki	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Elastyczny, wydajny, bezpłatny pakiet oprogramowania do analizy krzywych sił oparty na języku Java o otwartym kodzie źródłowym. Obsługuje wiele modeli mechaniki kontaktowej, takich jak Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis oraz stożek lub piramida (w tym i ścięty). Zawiera również różne metody szacowania początkowego punktu kontaktowego do wyboru. Obsługuje przetwarzanie wsadowe danych i późniejszą analizę statystyczną (np. średnie, odchylenia standardowe, histogramy, dobre dopasowanie itp.). Cytowanie w literaturze: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, H. Gabry, “ AtomicJ: Oprogramowanie typu open source do analizy krzywych sił" Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014),
https://doi.org/10.1063/1.4881683 Roztwór buforowy (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 oraz KH2PO4)	S271 (czystość >99% NaCl), P9541 (czystość >99% KCl), BP332(>99% czystości Na2HPO4), BP362 (czystość >99% KH2PO4)	Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) została przygotowana w laboratorium jako roztwór wodny składający się ze 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4 rozpuszczone w ultraczystej wodzie. Odczynniki odmierzano za pomocą wagi analitycznej, a szkło czyszczono wodą z mydłem, a następnie sterylizowano w autoklawie bezpośrednio przed użyciem.
chloroformu
	Bruker	PDNISP	Fabrycznie skalibrowana sonda kątowa z diamentowym (E = 1140 GPa) końcówka AFM (nominalna R = 40 nm) z wspornikiem ze stali nierdzewnej (nominalnie k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Stała sprężystości jest mierzona fabrycznie (k = 256 N/m dla sondy, numer seryjny #13435414, użyty tutaj), a dane kalibracyjne (w tym obrazy AFM wgłębień pokazujących geometrię sondy) są dostarczane z sondą.
Diamentowa tarcza ultramikrotomowa	Diatome	Ultra 35°	Szerokość 2,1 mm. Użyto również standardowego szklanego ostrza do początkowego zgrubnego cięcia powierzchni próbki przed przejściem do ostrza diamentowego w celu końcowego przygotowania powierzchni
Żywica epoksydowa	Gorilla Glue	26853-31-6	i utwardzacz zmieszano w stosunku 1: 1, niewielką kroplę umieszczono na krążku na próbkę ze stali nierdzewnej (Ted Pella), a mikę muskowitową klasy V1 (Ted Pella) przymocowano, aby stworzyć atomowo płaską powierzchnię do przygotowania błon fosfolipidowych.
Biała żywica etanolowa
LR, średniej jakości (katalizowana)	Electron Microscopy Sciences	14381	Butelka 500 ml, partia #150629
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC)	N/A	N/A	MSC do badań nanomechanicznych były komórkami pierwotnymi pobranymi od 8-10 tygodniowych samców myszy C57BL/6, jak opisano w Goelzer, M. i wsp. "Lamina A/C jest zbędna do mechanicznej represji adipogenezy" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 oraz Peister, A. i in. "Dorosłe komórki macierzyste ze szpiku kostnego (MSC) izolowane z różnych szczepów myszy wsobnych różnią się epitopami powierzchniowymi, szybkością proliferacji i potencjałem różnicowania" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Standardy modułu	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Używany HOPG (E = 18 GPa) i PS (E = 2,7 GPa). Zawiera również 2x PDMS (Tack 0, E = 2,5 MPa; Tack 4, E = 3,5 MPa), PS-LDPE (E = 2,0/0,2 GPa), stopiona krzemionka (E = 72,9 GPa), próbka szafiru (E - 345 GPa) i charakterystyka końcówki (chropowatość tytanu). Wszystkie próbki są wstępnie zamontowane na stalowej tarczy o średnicy 12 mm (krążek na próbkę).
Mika moskiewska	Ted Pella	50-12	o średnicy 12 mm, klasa V1 Mika muskowitowa
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Darmowy pakiet oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazu AFM, ale przeznaczony i zastrzeżony/ograniczony do AFM Bruker; podobna funkcjonalność jest dostępna w bezpłatnych, niezależnych od platformy pakietach oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów AFM, takich jak Gwyddion, WSxM i inne. Ma wbudowane możliwości analizy krzywej siły, ale AtomicJ jest bardziej elastyczny/w pełni funkcjonalny (np. więcej wbudowanych modeli mechaniki kontaktowej do wyboru, analiza statystyczna wyników dopasowania krzywej siły itp.) do analizy krzywych sił i obsługuje przetwarzanie wsadowe krzywych sił.
Fosfolipidy: POPC, Cholesterol (owiec)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	Lipid POPC rozpuszczony w chloroformie (25 mg / mL) został uzyskany od dostawcy i użyty bez dalszego oczyszczania. Cholesterol w proszku od tego samego dostawcy został rozpuszczony w chloroformie (20 mg / ml).
Uchwyt sondy (płyn, dwuwarstwy lipidowe)	Bruker	MTFML-V2	Specyficzny dla konkretnego zastosowanego AFM; MTFML-V2 to szklany uchwyt sondy do skanowania w płynie na MultiMode AFM.
Uchwyt sondy (płyn, MSC)	Skaner Z Bruker	FastScan Bio	Używany z głowicą Dimension FastScan (skanery zginające XY). Numer seryjny MXYPOM5-1B154.
Uchwyt sondy (standardowy, otoczenia)	Bruker	DAFMCH	Specyficzny dla konkretnego zastosowanego AFM; DAFMCH to standardowy uchwyt sondy kontaktowej i stukającej do Dimension Icon AFM, odpowiedni do nanotwardości (PF-QNM, FFV i ramping point-and-shoot)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Numer produktu dotyczy krążka do próbek ze stali nierdzewnej o średnicy 15 mm. Dostępne również w średnicach 6 mm, 10 mm, 12 mm i 20 mm na
podłożu https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459 Szafirowym Bruker		PFQNM-SMPKIT-12M	Ekstremalnie twarda powierzchnia (E = 345 GPa) do pomiaru czułości sond na ugięcie (chcesz, aby całe ugięcie pochodziło z sondy, a nie z podłoża). Część zestawu wzorców PF-QNM/modułu.
Skaningowy mikroskop elektronowy	Hitachi	S-3400N-II	znajduje się w stanie Boise. Służy do wykonywania kolokowanego SEM/EDS na wszystkich próbkach z wyjątkiem Ti-6Al-4V wytwarzanych addytywnie (AM).
Silikonowe sondy AFM (standard)	NuNano	Scout 350	Standardowa sonda silikonowa w trybie gwintowania z odblaskową aluminiową powłoką tylną; k = 42 N/m (nominalnie), f0 = 350 kHz. Nominalna R = 5 nm. Dostępne również w wersji niepowlekanej lub z odblaskową złotą powłoką tylną. Sondy o podobnych specyfikacjach są dostępne u innych producentów (np. Bruker TESPA-V2).
Silikonowe sondy AFM (sztywne)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Sondy silikonowe z wytrawioną końcówką z odblaskową aluminiową powłoką tylną; k = 200 N/m (nominalnie), f0 = 525 kHz. Nominalna R = 8 nm dla RTESPA-525, R = 30 nm dla RTESPA-525-30. Stała sprężystości każdego RTESPA-525-30 jest mierzona indywidualnie w fabryce za pomocą laserowej wibrometrii dopplerowskiej i dostarczana z sondą.
Papier z węglika krzemu (krążki ścierne)	Sondy	50-10005	o ziarnistości 120
(miękka półkulista końcówka o dużym promieniu)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Również MLCT-SPH-1UM-DC. Nowa linia produktów sond półkulistych (na końcu wału cylindrycznego o długości 23 mm) o dużym promieniu (R = 1 lub 5 mm) z fabrycznie skalibrowaną końcówką (na końcu wału cylindrycznego o długości 23 mm). DC = powłoka kompensacji dryftu. 6 wsporników/sonda (A-F). Nominalne stałe sprężystości: A, k = 0,07 N/m; B, k = 0,02 N/m; C, k = 0,01 N/m; D, k = 0,03 N/m; E, k = 0,1 N/m; F, k = 0,6 N/m.
Sondy AFM z azotku krzemu (miękka, średnio ostra końcówka)	Wsporniki	DNP	4 (A-d). Nominalne stałe sprężystości: A, k = 0,35 N/m; B, k = 0,12 N/m; C, k = 0,24 N/m; D, k = 0,06 N/m. Nominalne promienie krzywizny, R = 10 nm.
Sondy AFM z azotku krzemu (miękka, ostra końcówka)	Bruker	ScanAsyst-Air	Wartości nominalne: częstotliwość rezonansowa, f0 = 70 kHz; stała sprężystości, k = 0,4 N/m; promień krzywizny, R = 2 nm. Zaprojektowany do obrazowania AFM opartego na krzywej siły.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Klej błyskawiczny na bazie cyjanoakrylanu. Wiele mniej więcej równoważnych produktów jest łatwo dostępnych.
Pompa strzykawkowa	New Era Pump Systems	NE1000US	Jednokanałowy system pompy strzykawkowej z możliwością infuzji i pobierania
Standard charakteryzacji końcówki	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Tytan (Ti) wzorzec chropowatości. Część zestawu wzorców PF-QNM/modułu.
Azot o ultrawysokiej czystości (UHP N2), 99,999%	Norco	SPG TUHPNI -	Butla ze sprężonym gazem o ultrawysokiej czystości (99,999%) w rozmiarze T T azotu do suszenia próbek
Ultramikrotom	Leica	EM UC6	Wyposażony w szklane ostrze (standardowe, do wstępnego przygotowania próbki) i diamentowe ostrze (do końcowego przygotowania)
Woda ultraczysta	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model został wycofany z produkcji, ale dostępne są jego odpowiedniki. Produkuje ≥ 18,2 MΩ*cm ultraczysta woda o TOC (całkowitej zawartości organicznej) 1-5 ppb, na monitorowanie UV w linii produkcyjnej. Zawiera 0,2 i mikro; m filtr cząstek stałych, kolumny jonowymienne i komora utleniania UV.
Szlifierka o zmiennej prędkości	obrotowej Buehler	EcoMet 3000	Używana z papierami z węglika krzemu podczas polerowania ręcznego.
Stół wibroizolacyjny (aktywny)	Herzan	TS-140	Używany z Bruker MultiMode AFM. Siedzi na stole wibroizolacyjnym TMC 65-531. Bruker Dimension Icon AFM wykorzystuje ściśle pasywną izolację drgań (pochodzi od producenta z niestandardowym okapem akustycznym, stołem powietrznym i płytą granitową).
Stół wibroizolacyjny (pasywny)Stół wibroizolacyjny	TMC	65-531	35" x 30" z opcjonalnym tłumieniem powietrza (wyłączony). Używany z Bruker MultiMode AFM. Stół aktywnej kontroli drgań Herzan TS-140 "Table Stable" znajduje się na górze.