Artykuł metodologiczny

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

DOI:

10.3791/64499

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) pochodzące z tkanki mogą odzwierciedlać stan funkcjonalny komórek źródłowych i charakterystykę przestrzeni śródmiąższowej tkanki. Skuteczne wzbogacenie tych sEV jest ważnym warunkiem wstępnym dla badań nad ich funkcją biologiczną i kluczem do rozwoju klinicznych technik wykrywania i technologii nośników terapeutycznych. Trudno jest wyizolować sEV z tkanki, ponieważ są one zwykle silnie zanieczyszczone. Badanie to dostarcza metody szybkiego wzbogacania wysokiej jakości sEV z tkanki raka wątroby. Metoda obejmuje czteroetapowy proces: inkubację enzymów trawiennych (kolagenazy D i DNazy Ι) z tkanką, filtrację przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm, ultrawirowanie różnicowe i filtrację przez filtr membranowy 0,22 μm. Dzięki optymalizacji etapu ultrawirowania różnicowego i dodaniu etapu filtracji, czystość sEV uzyskanych tą metodą jest wyższa niż uzyskana przy użyciu klasycznego ultrawirowania różnicowego. Dostarcza ważnej metodologii i danych pomocniczych do badania sEV pochodzących z tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) mają średnicę około 30 nm do 150 nm i są wydzielane przez różne komórki1. Mogą komunikować się z komórkami tkankowymi i regulować lokalne lub odległe mikrośrodowisko, transportując ważne cząsteczki biologiczne, takie jak lipidy, białka, DNA i RNA do różnych narządów, tkanek, komórek i części wewnątrzkomórkowych. W ten sposób mogą również zmienić zachowanie komórek odbiorcy2,3. Izolacja i oczyszczenie określonych sEV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do badania ich zachowania biologicznego podczas rozwoju i przebiegu choroby. Ultrawirowanie różnicowe - uważane za złoty standard - jest powszechnie stosowane do oddzielania sEV od tkanek, w których normalnie się znajdują4. Za pomocą tej techniki można usunąć szczątki tkanek, szczątki komórek, duże pęcherzyki i ciała apoptotyczne, pozostawiając tylko sEV.

Wykazano, że klasa Wykazano, że kolagenaza D i DNaza I nie wpływają na cechy molekularne komórek lub pęcherzyków, a właściwości obu enzymów przyczyniają się do uwalniania pęcherzyków w macierzy zewnątrzkomórkowej 5. Enzymy te zostały użyte do ekstrakcji sEV z ludzkiej tkanki czerniaka z przerzutami, tkanki raka jelita grubego i tkanki błony śluzowej okrężnicy5,6,7. Jednak stężenie i czas trawienia kolagenazy D i DNazy I w tych metodach różnią się, co prowadzi do niespójnych wniosków. Aby uniknąć współwytrącania innych podtypów sEV, naukowcy usunęli większe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (o średnicy 0,1 μm lub 0,2 μm) poprzez filtrację i/lub wirowanie różnicowe8. W zależności od tkanki źródłowej mogą być wymagane różne metody izolacji i oczyszczania9,10.

Użycie tradycyjnej metody ultrawirowania różnicowego do ekstrakcji sEVs z tkanki wątroby powoduje powstanie warstwy istoty białej na powierzchni supernatantu, bez żadnego sposobu określenia jej właściwości. W poprzednim badaniu11 stwierdzono, że ta warstwa istoty białej wpływa na czystość sEVs. Chociaż liczba cząstek i stężenie białka w próbkach wyizolowanych metodą tradycyjną były wyższe niż w przypadku obecnej metody, współczynnik zmienności był duży, prawdopodobnie dlatego, że wiele zanieczyszczeń może prowadzić do słabej powtarzalności wyników. Oznacza to, że przy użyciu detergentu (tj. wykrywając rozpuszczalność cząstek w 1% Triton X-100), stwierdziliśmy, że czystość sEV uzyskanych tą metodą była większa. Dlatego używamy tej metody do izolowania i oczyszczania sEV pochodzących z tkanki raka jelita grubego do badań proteomicznych.

Obecnie badania nad sEVs w raku wątroby koncentrują się głównie na surowicy, osoczu i supernatencie hodowli komórkowej12,13,14. Jednak sEV pochodzące z tkanki raka wątroby mogą dokładniej odzwierciedlać patologię fizjologiczną i otaczające mikrośrodowisko raka wątroby oraz skutecznie zapobiegać degradacji i zanieczyszczeniu innych EVs15,16. Dzięki zastosowaniu ultrawirowania różnicowego, metoda ta może wzbogacić plon i uzyskać wysokiej jakości sEV, stanowiąc ważną podstawę do dalszych badań nad rakiem wątroby. Metoda ta umożliwia oddzielenie tkanki raka wątroby przez ostre oddzielenie i dysocjację przez kolagenazę D i DNazę I. Następnie szczątki komórkowe, duże pęcherzyki i ciała apoptotyczne są dalej usuwane przez filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Na koniec sEV są izolowane i oczyszczane do późniejszych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka tkanka raka wątroby została pobrana od pacjentów, u których zdiagnozowano nowotwór złośliwy wątroby w Pierwszym Szpitalu Stowarzyszonym Uniwersytetu Medycznego Gannan. Wszyscy pacjenci podpisali formularz świadomej zgody, a pobranie próbek tkanek ludzkich zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego Gannan. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Przygotowanie

  1. Umieścić wytrząsarkę odbarwiającą przeniesieniową w inkubatorze i ustawić temperaturę na 37 °C. Zobacz Rysunek 1 dla wszystkich innych potrzebnych urządzeń.
  2. Oczyść skalpel i kleszcze, spryskując je 75% alkoholem.
  3. Przygotuj roztwór trawienny, odmierzając 6 mg kolagenazy D (4 mg/ml) i 24 μl DNazy Ι (80 U/ml) i dodając je do 1,5 ml pożywki zasadowej RPMI-1640. Mieszaj przez delikatne odwrócenie, aż dodatki całkowicie się rozpuszczą.
  4. Wcześniej zwilż sitka do komórek o wielkości 70 μm i 0,22 μm 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  5. Umieść sterylne naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm na pojemniku na lód, aby pomieścić tkanki wątroby po rozmrożeniu.
  6. W ciągu 15 minut po wyizolowaniu tkanki raka wątrobowokomórkowego spłukać krew z powierzchni bloku tkankowego za pomocą PBS, przenieść tkankę do sterylnej zamrożonej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu eksperymentu nie dłużej niż 2 tygodnie.

2. Dysocjacja tkanek

  1. Wyjąć próbkę tkanki z zamrażarki o temperaturze −80 °C i umieścić około 400 mg tkanki pokrojonej na fragmenty o wymiarach 2 mm x 2 mm x 2 mm w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm umieszczonym w pojemniku na lód.
  2. Przenieść tkankę do 6-dołkowej płytki z 1,5 ml roztworu trawiennego; następnie umieścić płytkę na wytrząsarce odbarwiającej przeniesienie (20 obr./min) w celu inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu całkowitej dysocjacji tkanki raka wątroby i uwolnienia sEV.
  3. Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora i umieścić ją w zamrażalniku. Dodać 80 μl inhibitora fosfatazy i 200 μl kompletnego roztworu inhibitora proteazy, aby zatrzymać trawienie.
  4. Przenieś roztwór trawienny do sitka komórkowego o wielkości 70 μm i powoli je przefiltruj, aby usunąć wszelkie duże resztki tkanek. Zebrać filtrat i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.

3. Ultrawirowanie różnicowe

UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy wirowania w temperaturze 4 °C.

  1. Odwirować filtrat o stężeniu 500 × g przez 10 minut i zebrać supernatant w nowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Większość drobnych resztek tkanek można następnie usunąć.
  2. Odwirować supernatant o stężeniu 3 000 × g przez 20 minut w celu usunięcia resztek komórek. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej, aż końcówka pipety dotknie białej substancji na powierzchni.
  3. Odwirować pozostałą ciecz o stężeniu 3 000 × g przez 3 minuty, a następnie odessać supernatant w celu ułatwienia zebrania pęcherzyków. Aby zapewnić czystość sEVs, upewnij się, że biała substancja nie jest zasysana.
  4. Odwirować zebrany supernatant o masie 12 000 × g przez 20 minut i przenieść 900 μl supernatantu do probówki ultrawirówkowej o pojemności 4,7 ml. Pozostałą ciecz odwirować o sile 12 000 × g przez 3 minuty, a następnie zebrać i wymieszać oba supernatanty w tej samej probówce do ultrawirówki. Całkowicie napełnij probówkę PBS.
  5. Odwirować supernatanty w stężeniu 100 000 × g przez 60 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, napełniając probówkę ultrawirówki PBS i ponownie odwirowując przy 100 000 × g przez 60 minut. Ponownie zawiesić osad z 50 μl PBS.
  6. Odessać zawiesinę sEV za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm. Zebrać filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 600 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.

4. Ocena jakości wzbogacenia

  1. Obserwuj morfologię sEV pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.
    1. Następnie upuść 10 μl próbki sEV na miedzianą siatkę, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wyczyść sterylną wodą destylowaną, używając papieru chłonnego w celu usunięcia nadmiaru płynu.
    2. Upuść 10 μl 2% octanu uranylu na siatkę miedzianą w celu barwienia ujemnego przez 1 minutę. Użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć ciecz na powierzchni siatki miedzianej i suszyć ją przez 2 minuty pod żarówką.
    3. Obserwuj miedzianą siatkę pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym i obraz przy napięciu 80 kV.
  2. Użyj cytometru przepływowego nanocząstek, aby określić rozkład wielkości i czystość sEV.
    1. Przed uruchomieniem maszyny należy przygotować probówki zawierające 200 μl kontroli jakości, 200 μl nanosfer krzemionkowych, 2 x 200 μl wody ultraczystej, 2 x 200 μl roztworu czyszczącego i 200 μl PBS.
      UWAGA: Przed badaniem próbek sEV konieczne jest przeprowadzenie kontroli jakości przyrządu i przetestowanie wzorca wielkości cząstek (rozkład wielkości należy obliczyć przy użyciu standardowych krzywych wygenerowanych dla kilku nanomikrosfer o różnych średnicach [68-155 nm] w tych samych warunkach wykrywania). Kulki QC i nanosfery krzemionkowe rozcieńczono 100-krotnie ultraczystą wodą w łącznej objętości 200 μL.
    2. Sprawdź objętość roztworu czyszczącego (>10 ml) i zwróć uwagę na różnicę między poziomem płynu osłonowego a płynu odpadowego (20-30 cm).
    3. Wyłącz główne zasilanie instrumentu; po 20 sekundach włącz komputer i poczekaj na sygnały dźwiękowe wskazujące, że instrument jest prawidłowo podłączony, aby uruchomić oprogramowanie.
    4. Kliknij przycisk Uruchom, aby włączyć kamerę, laser i pompę powietrza.
    5. Kliknij Sheath Flow-Start Up i umieść ultraczystą wodę na platformie załadowczej. Po 4 minutach (odliczanie instrumentu) kliknij na Sample-Boosting | Rozładunek próbki.
    6. Po 30 sekundach umieść pustą probówkę na platformie załadowczej i kliknij Sample-Boosting | Rozładunek próbki. Następnie umieść rurkę z ultraczystą wodą na platformie załadowczej i jednocześnie kliknij Sample-Boosting | Oczyszczanie przepływu pochwy.
    7. Kliknij opcję Manual Operation (Obsługa ręczna) i umieść rurkę z koncentracją cząstek na platformie załadowczej. Następnie kliknij na Sample-Boosting na 1 minutę i jednocześnie wybierz kontrolę jakości 250 nm Std FL SiNPs w "SAMP. Inf."
    8. Kliknij Sample-Sampling i włącz detektor, klikając SPCM.
      UWAGA: W tym momencie można zobaczyć przebieg sygnału w czasie rzeczywistym.
    9. Kliknij Auto Sampling i wprowadź 1.0 do Sampling SET, aby ustawić ciśnienie na 1 KPa. Kliknij na pasku narzędzi i wybierz Duży sygnał.
    10. Dostosuj poziome położenie lasera i ustaw laser na 2 μm, a następnie kliknij L lub R, aby upewnić się, że sygnał jest silny i jednolity.
    11. Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskoczą do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Naf i kliknij Sample-Unload.
    12. Umieść rurkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej, kliknij Sample-Boosting, a po 1 minutach kliknij Sample-Unload. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.
    13. Umieść rurkę o rozmiarze cząstek na platformie załadowczej i kliknij przycisk Sample-Boosting na 1 minutę.
    14. Wybierz kontrolę jakości 68-155 nm Std FL SiNPs w "SAMP. Inf" i kliknij Sample-Sampling. Następnie kliknij pasek narzędzi i wybierz Mały sygnał.
    15. Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskoczą do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Naf i kliknij Sample-Unload.
    16. Umieść probówkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej, kliknij Sample-Boosting, a po 1 minucie kliknij Sample-Unload. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.
    17. Umieść probówkę PBS na platformie załadowczej; kliknij na Sample-Boosting (Zwiększanie próbki) na 1 minutę.
    18. Wybierz kontrolę jakości 68-155 nm Std FL SiNPs w "SAMP. Inf" i kliknij Sample-Sampling. Następnie kliknij pasek narzędzi i wybierz Mały sygnał.
    19. Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskoczą do bufora. Zapisz dane w pliku Naf i kliknij Sample-Unload.
    20. Umieść probówkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej, kliknij Sample-Boosting i Sample-Unload po 1 minutach. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.
    21. Sprawdź informacje o próbce zgodnie z opisem w krokach 4.2.17-4.2.20; zmień PBS (krok 4.2.17) na próbkę sEV i przeanalizuj dane.
  3. Dalej identyfikuj sEV za pomocą western blot.
    1. Określ stężenia białek w sEV i tkankach za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Oblicz objętość ładunku sEV (np. dla 5 μg białka na studzienkę) na podstawie tych wyników ilościowych. Dodaj bufor ładujący w stosunku 1:4 i zwiruj mieszaninę.
    3. Po denaturacji w kąpieli metalowej o temperaturze 100 °C (suchy termostat) przez 10 minut, oddzielić białko na 12% żelu poliakrylamidowym pod napięciem 60 V przez 80 minut.
    4. Przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu o natężeniu 0,22 μm w temperaturze 220 mA przez 2 godziny za pomocą buforu transferowego (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu).
    5. Zablokować błonę 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD9, monoklonalne przeciwciało monoklonalne królika przeciwko ludzkiemu CD63, monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu TSG101, mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GM130) przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 5% mleku beztłuszczowym w stosunku 1:1 000.
    6. Po trzech przemyciach TBST inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    7. Wykryj przeciwciało sprzężone z HRP za pomocą substratu do bibuły ECL, a następnie zbierz i przeanalizuj obrazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sEVs z tkanek ludzkiego raka wątroby odegrały kluczową rolę w diagnozowaniu, leczeniu i rokowaniu pacjentów z rakiem wątroby. W tej metodzie wykorzystano powszechnie stosowane instrumenty laboratoryjne do izolowania i oczyszczania sEV pochodzących z tkanek raka wątroby; może to stanowić wsparcie metodologiczne dla badania sEV. Rysunek 2 ilustruje ogólny proces wzbogacania sEV z tkanek raka wątroby. sEV w przestrzeniach międzykomórkowych tkanek są w pełni uwalniane poprzez cięcie tkanek i hyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje powtarzalną metodę ekstrakcji sEV z tkanki raka wątroby. Wysokiej jakości sEV uzyskuje się poprzez izolację ostrych tkanek, traktowanie enzymami trawiennymi, ultrawirowanie różnicowe oraz filtrację i oczyszczanie membraną filtracyjną 0,22 μm. W przypadku dalszej analizy niezwykle ważne jest zapewnienie wysokiej czystości sEV. W procesie wirowania różnicowego na powierzchni supernatantu pojawi się warstwa białych substancji (nieznany skład). Ponieważ warstwa ta mogłaby zanieczyścić sEVs, usunęliśmy ją...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Pierwszemu Szpitalowi Stowarzyszonemu Uniwersytetu Medycznego Gannan za wsparcie tej pracy. Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (numery grantów 82260422).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m Filtr membranowyMillexSLGPR33RB
1 ml Sterylna strzykawkaHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% octan uranyluMikroskopia elektronowa Sciences22400-2
4,7 ml Probówka wirówkowaBeckman Coulter361621
6-dołkowa płytka do pomiaru komórekLABSELECT11110
50 ml ZlewkaTianjin Kangyiheng Firma zajmująca się sprzedażą instrumentów eksperymentalnychCF2100800
70 & mikro; m Sitko do komórekBiosharpBS-70-XBS
100 mm Naczynie do hodowli komórkowychCELL TERCS016-0128
600 µ L Probówka wirówkowaAxygenMCT060C
zestaw do oznaczania ilościowego białka BCAThermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini trans-blotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
Przeciwciało CD63Abcamab134045
Przeciwciało CD9Abcamab263019
Wirówka 5430REppendorf5428HQ527333
Roztwór czyszczącyNanoFCMC1801
Kolagenaza DRoche11088866001
Siatka miedzianaHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
Suchy termostatHangzhou Allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti Human CD9 PrzeciwciałoElabscienceE-AB-F1086C
GlicynaSolarbioG8200
Drugorzędowe przeciwciało przeciw myszy sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) ProteintechSA00001-1
Drugorzędowe przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową koziołka (HRP) ProteintechSA00001-2
MetanolShanghai Zhenxing Chemical Company
Cytometr przepływowy nanocząstek NanoFCMINCFNAN30E20112368
Inhibitory fosfatazy (PhosSTOP)Roche4906845001
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)ServicebioG4202
Membrana z polifluorku winylidenuKoraliki SolarbioISEQ00010
QCNanoFCMQS2502
RPMI-1640 podstawowe podłożePrzemysł biologiczny 
SkalpelGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
Nanosfery krzemionkoweNanoFCMS16M-Exo
Transfer odbarwiający wytrząsarka TS-8Kylin-BellE0018
Transmisyjny mikroskop elektronowyThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
Przeciwciało TSG101Proteintech28283-1-AP
PęsetaGuangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X
C11875500BT

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
  3. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  4. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  5. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  6. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  7. Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).
  8. Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
  9. Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
  10. Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
  11. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  12. Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
  13. Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
  14. Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).
  15. Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
  16. Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wzbogacanie p cherzyk wr nicowe ultracentryfugowaniefiltracja membranowatrawienie enzymatycznecytometria przep ywowatransmisyjna mikroskopia elektronowamarkery bia koweWestern blot

Powiązane artykuły