Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64505

⸱

2 grudnia 2022

 ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Streszczenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) reprezentują największą nadrodzinę receptorów i są celem wielu leków stosowanych u ludzi. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) losowych bibliotek małych cząsteczek pod kątem GPCR są wykorzystywane przez przemysł farmaceutyczny do odkrywania leków specyficznych dla celu. W tym badaniu HTS wykorzystano do identyfikacji nowych małocząsteczkowych ligandów gpcr specyficznych dla bezkręgowców neuropeptydów jako sond do badań fizjologicznych wektorów śmiertelnych patogenów ludzkich i weterynaryjnych.

Specyficzny dla bezkręgowców receptor kininowy został wybrany jako cel, ponieważ reguluje wiele ważnych procesów fizjologicznych u bezkręgowców, w tym diurezę, karmienie i trawienie. Co więcej, farmakologia wielu GPCR bezkręgowców jest słabo scharakteryzowana lub w ogóle nie jest scharakteryzowana; w związku z tym farmakologia różnicowa tych grup receptorów w odniesieniu do pokrewnych GPCR u innych metazoanów, zwłaszcza u ludzi, dodaje wiedzy do relacji struktura-aktywność GPCR jako nadrodziny. Opracowano test HTS dla komórek na płytkach 384-dołkowych w celu wykrycia ligandów receptora kininy z kleszcza pomoru bydła lub południowego kleszcza bydła, Rhipicephalus microplus. Receptor kininy kleszcza ulegał stabilnej ekspresji w komórkach CHO-K1.

Receptor kininowy, gdy jest aktywowany przez endogenne neuropeptydy kininowe lub innych małocząsteczkowych agonistów, wyzwala uwalnianie Ca2+ z magazynów wapnia do cytoplazmy. Ten test fluorescencji wapnia w połączeniu z podejściem "podwójnej addycji" może wykryć funkcjonalne cząsteczki agonistów i antagonistów "trafionych" na tej samej płytce testowej. Każdy test przeprowadzono przy użyciu płytek z lekami zawierającymi 320 losowych małych cząsteczek. Uzyskano wiarygodny współczynnik Z' wynoszący 0,7 i zidentyfikowano trzy cząsteczki uderzenia agonisty i dwie antagonisty, gdy HTS osiągnął końcowe stężenie 2 μM. Opisany tutaj test fluorescencji wapnia można dostosować do badań przesiewowych innych GPCR, które aktywują kaskadę sygnalizacyjną Ca2 +.

Wprowadzenie

Receptory sprzężone z białkami G (GPCR), występujące od drożdży po ludzi, stanowią największą superrodzinę receptorów u wielu organizmów1. Odgrywają one kluczową rolę w regulacji niemal wszystkich procesów biologicznych u zwierząt. W genomie stawonogów znajduje się od 50 do 200 GPCR, co oznacza, że stanowią one największą superrodzinę receptorów błonowych2. Są one klasyfikowane w sześciu głównych klasach, A-F, na podstawie podobieństwa sekwencji oraz funkcji3. GPCR przekazują różnorodne sygnały zewnątrzkomórkowe, takie jak sygnały hormonów, neuropeptydów, amin biogennych, glutaminianu, protonów, lipoglikoprotein oraz fotonów4. GPCR sprzęgają się z heterotrymerycznymi białkami G (Gα, Gβ i Gγ), aby przekazywać sygnały w dół kaskady. GPCR sprzężone z białkami Gαs lub Gαi/o odpowiednio zwiększają lub zmniejszają wewnątrzkomórkowe poziomy 3', 5'-cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP) poprzez aktywację lub hamowanie cyklazy adenylowej. GPCR sprzężone z Gαq/11 indukują uwalnianie wapnia z zapasów wapniowych retikulum endoplazmatycznego poprzez aktywację szlaku fosfolipazy C (PLC)-inozytoletriofosforanu-1,4,5 (IP3). GPCR sprzężone z Gα12/13 aktywują czynniki wymiany nukleotydów RhoGTPazy5,6. GPCR są celem działania ponad 50% leków stosowanych u ludzi oraz akarycydu, amitrazu4. Ponieważ GPCR przekazują tak różnorodne sygnały, stanowią one obiecujące cele w opracowywaniu nowych pestycydów zaburzających specyficzne dla bezkręgowców funkcje fizjologiczne.

Celem HTS jest identyfikacja cząsteczek-hitów, które mogą modulować funkcje receptorów. HTS obejmuje opracowanie testów, miniaturyzację oraz automatyzację7. GPCR neuropeptydowe stawonogów biorą udział w większości funkcji fizjologicznych, takich jak rozwój, linienie i ecdysis, wydalanie, mobilizacja energii oraz rozród4. Większość GPCR neuropeptydowych stawonogów i metazoa sygnalizuje poprzez kaskadę sygnałową wapnia2,6,8,9,10, na przykład w receptorach dla peptydu mioinhibitoryjnego i SIFamide kleszcza Ixodes scapularis; ich ligandy wykazują działanie antagonistyczne w testach motoryki jelita tylnego, gdzie SIF wywołuje skurcz, a MIP go hamuje11,12. Receptor podobny do NPY u komara żółtego, Aedes aegypti, reguluje poszukiwanie gospodarza przez samice13. W porównaniu do innych alternatywnych testów mobilizacji wapnia, takich jak test bioluminescencyjny wapnia z użyciem aequoriny14, test fluorescencji wapnia jest łatwy do przeprowadzenia, nie wymaga transfekcji innych rekombinowanych białek wykrywających wapń i jest kosztowo efektywny. Test fluorescencji wapnia generuje sygnał o przedłużonym czasie trwania w porównaniu do szybkiego sygnału kinetycznego uzyskiwanego w teście bioluminescencyjnym wapnia z użyciem aequoriny14,15.

W poniższym przykładzie receptor kininowy kleszcza bydlęcego, Rhipicephalus microplus, został wyekspresowany rekombinacyjnie w linii komórkowej CHO-K1 i wykorzystany w teście fluorescencji wapnia. W genomie R. microplus znajduje się tylko jeden gen receptora kininowego; receptor ten sygnalizuje poprzez zależną od białka Gq ścieżkę sygnalizacyjną i wyzwala odpływ Ca2+ z magazynów wapnia do przestrzeni wewnątrzkomórkowej16. Proces ten może być wykrywany i ilościowo określany za pomocą fluoroforu, który generuje sygnał fluorescencyjny po związaniu jonów wapnia (Rycyna 1).

Receptor kinin jest specyficznym dla bezkręgowców białkiem GPCR, które należy do klasy A receptorów typu rhodopsyny. Kinin jest starożytnym neuropeptydem sygnałowym występującym u Mollusca, Crustacea, Insecta oraz Acari4,17,18. Chrząszcze (Coleoptera) nie posiadają systemu sygnalizacji kinin; u komara Aedes aegypti występuje tylko jeden receptor kinin, który wiąże trzy aedeskininy, podczas gdy Drosophila melanogaster posiada jeden receptor kinin z drosokininą jako jedynym ligandem19,20,21. U kręgowców nie występują homologiczne kininy ani receptory kinin. Choć dokładna funkcja kininy u kleszczy nie jest znana, samice R. microplus z wyciszonym za pomocą RNAi receptorem kinin wykazują znacznie obniżoną sprawność rozrodczą22. Kininy są peptydami pleiotropowymi u owadów. U Drosophila melanogaster uczestniczą one zarówno w centralnych, jak i obwodowych układach regulacji nerwowej23, w fazie przed-ecdysis24, w żerowaniu25, metabolizmie26 i wzorcach aktywności snu26,27, a także w lokomocji larw28. Kininy regulują skurcze jelita tylnego, diurezę i żerowanie u komara A. aegypti29,30,31. Peptydy kininy posiadają konserwatywny pentapeptyd C-końcowy Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, który jest minimalną sekwencją wymaganą do aktywności biologicznej32. Specyficzność dla stawonogów, niewielki rozmiar endogennego ligandu, co czyni go podatnym na interferencję za pomocą małych cząsteczek, oraz pleiotropowe funkcje u owadów sprawiają, że receptor kinin jest obiecującym celem w zwalczaniu szkodników4.

Analiza „podwójnego dodawania” (Rysunek 2) umożliwia identyfikację agonistów lub antagonistów w ramach tego samego testu HTS15. Została ona zaadaptowana z analizy „podwójnego dodawania”, powszechnie stosowanej w przemyśle farmaceutycznym w procesie poszukiwania nowych leków33. W skrócie, pierwsze dodanie leków do płytki z komórkami pozwala na identyfikację potencjalnych agonistów w bibliotece chemicznej w przypadku wykrycia silniejszego sygnału fluorescencji w porównaniu do zastosowania kontroli rozpuszczalnika. Po 5 min inkubacji z tymi małymi cząsteczkami, do wszystkich studzienek dodaje się znany agonista (peptyd kininowy). Te studzienki, do których losowo trafił antagonista z płytki z lekami, wykazują słabszy sygnał fluorescencji po dodaniu agonisty w porównaniu do studzienek kontrolnych, do których w pierwszym kroku dodano rozpuszczalnik. Analiza ta pozwala zatem na identyfikację potencjalnych agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek. W standardowym projekcie HTS cząsteczki te (tzw. hity) byłyby następnie walidowane poprzez analizy zależności dawka-odpowiedź oraz dodatkowe testy aktywności biologicznej, których tutaj nie przedstawiono.

Schemat sygnalizacji receptora kinin; GPCR, wiązanie liganda, uwalnianie Ca2+, ścieżka PLC, odpowiedź komórkowa.
Rysunek 1: Ilustracja mechanizmu testu fluorescencji wapniowej. Białko Gq uruchamia wewnątrzkomórkową ścieżkę sygnalizacji wapniowej. Receptor kinin (receptor sprzężony z białkiem G) został wyekspresowany rekombinacyjnie w komórkach CHO-K1. Po związaniu liganda-agonisty z receptorem, białko Gq powiązane z receptorem kinin aktywuje PLC, która katalizuje przekształcenie cząsteczki PIP2 w IP3 i DAG. IP3 wiąże się następnie z IP3R na powierzchni retikulum endoplazmatycznego, co prowadzi do uwolnienia Ca2+ do cytoplazmy, gdzie jony Ca2+ wiążą się z fluoroforami i wywołują sygnał fluorescencyjny. Sygnał fluorescencyjny można uzyskać poprzez wzbudzenie przy 490 nm i detekcję przy 514 nm. Skróty: GPCR = receptor sprzężony z białkiem G; PLC = fosfolipaza C; PIP2 = fosfatydyloinozyto-4,5-bisfosforan; IP3 = inozytofolifosforan; DAG = diacyloglicerol; IP3R = receptor IP3. Utworzone przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat przepływu pracy testu komórkowego; komórki CHO-K1, fluorofor, pomiar RFU, test z podwójnym dodaniem.
Rysunek 2: Przepływ pracy w wysokoprzepustowym przesiewaniu małych cząsteczek w odniesieniu do receptora sprzężonego z białkiem G ekspresowanego w komórkach CHO-K1. (A) Rekombinowane komórki CHO-K1 stabilnie ekspresujące receptor kininowy zostały dodane do płytki 384-dołkowej (10 000 komórek/dołek) przy użyciu systemu manipulacji cieczami (25 µL/dołek) i inkubowane w nawilżonym inkubatorze CO2 przez 12-16 h. (B) Bufor do testu zawierający barwnik fluorescencyjny (25 µL/dołek) został dodany do płytki z komórkami za pomocą systemu manipulacji cieczami. Płytkę inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C, a następnie wyrównywano temperaturę w RT przez kolejne 30 min. (C) Sygnał fluorescencji tła komórek w każdym dołku zmierzono za pomocą czytnika płytek. (D) Roztwory leków z biblioteki w płytce 384-dołkowej oraz pusty rozpuszczalnik (wszystkie po 0,5 µL/dołek) dodano do płytki testowej z komórkami za pomocą systemu manipulacji cieczami. (E) Odpowiedzi fluorescencyjne wapnia komórkowego zmierzono czytnikiem płytek natychmiast po dodaniu roztworów leków; związki wywołujące sygnały fluorescencyjne wyższe od średniej wybrano jako trafienia agonistyczne. Trafienia antagonistyczne blokujące GPCR (ikona poniżej) ujawniono po dodaniu peptydowego agonisty w kroku G. (F) W tej samej płytce testowej, po 5 min inkubacji komórek ze związkami przesiewowymi, do każdego dołka dodano endogenny peptyd agonistyczny Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) receptora kininowego kleszcza (1 µM). (G) Odpowiedzi fluorescencyjne komórek po dodaniu peptydu agonistycznego zmierzono natychmiast za pomocą czytnika płytek. Związki hamujące sygnał fluorescencji wybrano jako trafienia antagonistyczne. Skróty: GPCR = receptor sprzężony z białkiem G; RT = temperatura pokojowa; RFU = względne jednostki fluorescencji. Stworzono za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek

UWAGA: Linia komórkowa CHO-K1 stabilnie wykazująca ekspresję receptora kininowego z R. microplus, nazwana BMLK3, została opracowana przez Holmesa i wsp.16. Szczegóły opracowania tej linii komórkowej przedstawiono w innej publikacji14. Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.

  1. Hodować rekombinowaną linię komórkową w pożywce selektywnej (pożywka F-12K zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 800 µg/mL siarczanu G418), aby zapewnić ekspresję docelowego receptora. Komórki stabilnie eksponujące receptor przechowywać w 1 mL pożywki do mrożenia (90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) w 2 mL krio-probetce w zamrażarce o temperaturze −80 °C.
    UWAGA: W celu długoterminowego przechowywania zamrożonych komórek należy przechowywać je w ciekłym azocie.
  2. Podgrzać wszystkie pożywki przed hodowlą komórkową. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść 13 mL podgrzanej pożywki selektywnej (pożywka F-12K zawierająca 10% FBS i 800 µg/mL siarczanu G418) do kolby T-75 i pozostawić ją w komorze. Rozmrozić jedną probetkę zamrożonych komórek BMLK3 (~1,5 × 106 komórek) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 min. Przenieść rozmrożone komórki do kolby T-75. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2, chyba że określono inaczej.
  3. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji (po 1-2 dniach), podgrzać wszystkie pożywki do 37 °C z wyjątkiem soli fosforanowej w buforze Dulbecco (DPBS), którą należy przechowywać w temperaturze pokojowej. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usunąć zużytą pożywkę z kolby T-75, przemyć komórki przez 5 s 10 mL DPBS, delikatnie kołysząc kolbą, a następnie usunąć DPBS za pomocą pipety serologicznej.
    UWAGA: Obraz komórek CHO-K1 przy 90% konfluencji przedstawiono w pracy Lu et al.14.
  4. Oddzielić komórki od ścianek kolby T-75, dodając 2 mL 0,25% trypsyny-EDTA, i inkubować przez 3-5 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Następnie dodać 8 mL pożywki selektywnej i dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując i wypuszczając ciecz 2-3 razy tą samą pipetą serologiczną.
  5. Przenieść 2 mL zawiesiny komórkowej (~1 × 106 komórek) z kroku 1.4 do nowej kolby T-75 zawierającej 10 mL ciepłej pożywki selektywnej. Hodować komórki przez 1-2 dni w inkubatorze, aż osiągną 90% konfluencji.
  6. Wykorzystać komórki do analizy zgodnie z następnymi krokami lub powtórzyć kroki 1.4-1.5 jeden lub dwa razy przed użyciem komórek w analizie.
    UWAGA: Nie przekraczać trzech do czterech pasażów, ponieważ w przypadku niektórych linii komórkowych sygnał analizy może osłabnąć przy kolejnych pasażach.

2. Analiza fluorescencji wapnia

  1. Pokryj płytkę z komórkami.
    1. Do wszystkich etapów pipetowania w płytkach 384-dołkowych należy używać systemu do obsługi cieczy umieszczonego w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy stworzyć dedykowane programy do pipetowania do płytek 384-dołkowych.31 (Tabela uzupełniająca S1). Sterylne płytki 384-dołkowe należy pokryć warstwą białka z wyprzedzeniem. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy załadować 10 µL/well roztworu wodnego poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 0,05 mg/ml do każdej płytki, a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Opróżnij płytkę, szybko ją odwracając i delikatnie osuszając sterylnymi ręcznikami papierowymi. Następnie przepłucz każdą studzienkę za pomocą 10 µL wody, opróżnić płytkę i pozostawić ją do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez noc bez przykrywki. Zamknąć płytkę przykrywką i przechowywać w 4 °C w lodówce.
      UWAGA: Płytki powlekane można przechowywać w 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Dzień 1
    1. Wyjmij płytkę z lekiem (100 µM w 90% DPBS + 10% DMSO, stężenie końcowe w studzience dla HTS wyniesie 2 µM) przechowywano w temperaturze −20 °C zamrażarkę i pozostawić w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Układ płytki z lekami: Każda płytka 384-dołkowa (24 kolumny x 16 rzędów) zawiera 320 dołków z różnymi związkami z biblioteki oraz 64 dołki z samym rozpuszczalnikiem (DPBS zawierający 10% DMSO), rozmieszczone w czterech kolumnach, po dwie kolumny na brzegach każdej strony. Patrz Tabela uzupełniająca S2 dla układu płytek.
    2. Gdy komórki osiągną ok. 70%–90% konfluencji w kolbie T-75, należy odłączyć je od ścianek kolby zgodnie z poniższym opisem. Wszystkie pożywki należy uprzednio ogrzać do 37 °C z wyjątkiem DPBS (temperatura pokojowa).
      1. Usunąć zużyte pożywkę, przemyć komórki 10 ml DPBS, a następnie usunąć DPBS. Odłączyć komórki od ścianek kolby T-75, używając 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 3–5 min w temperaturze 37 °C do inkubatora, dodaj 8 ml pożywki selekcyjnej, a zawiesinę komórkową przenieś do 15 ml probówki stożkowej i wiruj przy 1000 × g przez 3 min.
      2. Odrzuć nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 ml pożywki F-12K zawierającej 1% FBS oraz 400 µg/mL Siarczan G418. Przechowywać zawiesinę w komorze z laminarnym przepływem powietrza podczas oznaczania liczby komórek.
    3. Wyznacz gęstość komórek w zawiesinie w celu dalszego rozcieńczenia: Wymieszaj 20 µL zawiesiny komórkowej do 20 µL 0,4% błękitu trypanowego, a następnie nałożyć 20 µL mieszaniny do komory licznikowej w celu odczytu gęstości komórek za pomocą licznika komórek.
    4. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w tym samym medium (medium F-12K zawierającym 1% FBS i 400 µg/mL siarczan G418) do objętości końcowej co najmniej 15 ml przy gęstości 4 × 105 komórek/ml
    5. Wysiej komórki na płytkę 384-dołkową pokrytą PDL. Przenieś 15 µL powyższej zawiesiny komórkowej (4 × 105 komórek/ml) do 150 ml auto-friendly zbiornika na odczynniki. Wydzielić 25 µL zawiesiny komórkowej (~10 000 komórek/studzienkę) do każdej z 384 studzienek płytki, wykorzystując system do obsługi cieczy w dwóch etapach. Napełnić 384/12.5 µL zamontuj końcówki o niskiej retencji na głowicy robota do obsługi cieczy, aspiruj 12.5 µL ze zbiornika (prędkość 5.2 µL/s), a następnie dozować do każdej studzienki (prędkość: 3.1 µL/s).
    6. Powtórz pipetowanie zgodnie z poprzednim krokiem 2.2.5, aby osiągnąć 25 µL na dołek. Następnie inkubować płytkę przez noc (14–16 h) w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 w inkubatorze z nawilżaczem.
      UWAGA: Ponieważ maksymalna objętość pipetowania wynosi 12.5 µL dla tej konkretnej głowicy, pipetowanie dla 25 µL przeprowadza się w dwóch etapach.
  3. Dzień 2
    1. Następnego dnia rano sprawdzić pod mikroskopem przykrytą płytkę z komórkami; jeśli nie są one konfluencyjne, należy odczekać, aż osiągną 90% konfluencji.
    2. Przygotowanie roztworu zapasu barwnika fluorescencyjnego: Resuspender liofilizowany barwnik fluorescencyjny w 100 µL DMSO oraz unikaj bezpośredniego naświetlania roztworu treściwego. Owiń probówkę folią aluminiową, aby zapobiec fotobleachingowi.
      UWAGA: Roztwór zapasowy można podzielić na aalikwoty do 15 µL alikwoty do każdego testu na płytce, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania; alikwoty można przechowywać w temperaturze −80 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.
    3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przy wyłączonym oświetleniu, w 15 ml probówce stożkowej owiniętej folią aluminiową, przygotować barwnik do ładowania (1x), łącząc 15 µL roztworu zapasowego barwnika fluorescencyjnego (z kroku 2.3.2) oraz pozostałych wstępnie ogrzanych komponentów zestawu (37 °C): 13,5 ml 1x HHBS (bufor Hanksa z 20 mM HEPES) oraz 1,5 ml odczynnika B (inhibitor odpływu barwnika).
      UWAGA: Podczas tego etapu światło w pomieszczeniu jest włączone.
    4. Zamknąć probówkę i dokładnie wymieszać zawartość, delikatnie odwracając probówkę kilka razy (zazwyczaj 3–5 razy).
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć mieszaninę barwnika do ładowania w ciągu 30 min.
    5. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, usunąć zużyte medium z płytki analitycznej z 384 dołkami poprzez szybkie odwrócenie płytki i delikatne osuszenie sterylnymi ręcznikami papierowymi; powtórzyć ten zabieg 2–3 razy, aby usunąć całą ciecz z płytki. Mokre ręczniki należy wyrzucić.
    6. Wyłączyć większość sztucznego oświetlenia bezpośredniego w pomieszczeniu (pozostawiając włączoną miękką, słabą lampkę biurkową lub podobne źródło światła, aby zapewnić widoczność podczas pracy) oraz w komorze bezpieczeństwa biologicznego na wszystkich etapach aż do zakończenia analizy (przez około 1,5 h).
    7. Do 150 ml zbiornika kompatybilnego z autopipetą należy wlać 15 ml barwnika do załadunku (1x) z kroku 2.3.3.
      1. Transfer 25 µL barwnika do ładowania (1x) z rezerwuaru do każdej studzienki przy użyciu systemu do manipulacji cieczami z 384/12.5 µL dozowanie za pomocą końcówek o niskiej retencji 12.5 µL do każdego dołka płytki (prędkość aspiracji i dozowania: 3.8 µL/s).
    8. Powtórz etap pipetowania zgodnie z opisem w punkcie 2.3.7.1, aby uzyskać objętość końcową wynoszącą 25 µL w każdej studni płytki. Przykryć i owinąć płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem zewnętrznym.
    9. Inkubować przykrytą płytkę z komórkami w temperaturze 37 °C w CO2 do inkubatora z nawilżaczem na 30 min, wyjąć z inkubatora i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 min w czytniku płytek lub na blacie laboratoryjnym, utrzymując płytkę przykrytą i owiniętą folią. Następnie komórki są gotowe do wysokoprzepustowego przesiewania (HTS).
    10. Przygotowanie chemiczne: Odwiruj płytkę z lekiem z kroku 2.2.1 przy 1 200 × g wirować w wirówce do płytek przez 1 min w temperaturze pokojowej.
      1. Przygotuj 10-krotny roztwór roboczy peptydu agonistycznego Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 µM) poprzez resuspensję 100 nmol liofilizowanego peptydu w 10 ml 1x HHBS zawierającego 0,1% DMSO, a następnie przeniesienie roztworu do 150 ml dozownika kompatybilnego z systemem automatycznym.
    11. Pomiar sygnału tła: Dla całego testu HTS w czytniku płytek, w ramach Protokoływybrać tryb pomiaru fluorescencji końcowej.
      UWAGA: Sygnał fluorescencyjny odczytuje się z dna płytki przy długościach fal wzbudzenia/emisji 495 nm/525 nm.
      1. Włóż płytkę z komórkami do czytnika płytek. W panel instrumentówwybierz wyreguluj wzmocnienie, wybierz a losowa studzienka na płytce, przypisać go/ją w stężeniu 5%–10% z/zby/ze maksymalna mierzalna wartość fluorescencjioraz wybierz wyreguluj wysokość (odczytu).
      2. Kliknij rozpocznij pomiar w celu odczytania całej płytki pod kątem sygnału fluorescencji tła w względnych jednostkach fluorescencji (RFU).
    12. Analiza „podwójnego dodawania”
      1. Korzystanie z systemu do obsługi cieczy z płytkami 384-dołkowymi/12.5 µL końcówki, aby wymieszać roztwór leku w każdym dołku płytki z lekiem, pipetować 3 razy w górę i w dół 10 µL roztworu leku (w DPBS zawierającym 10% DMSO) (prędkość pipetowania: 5.2 µL/s), oraz „odessać” 1.5 µL z każdej studzienki płytki z lekiem (prędkość aspiracji: 1.0 µL/s).
      2. Odmierzyć 0.5 µL związków do płytki z testem komórkowym (prędkość pipetowania: 1 µL/s) do uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 2 µM w 0,2% DMSO.
      3. Bezzwłocznie umieść płytkę testową w czytniku po dodaniu związków przesiewowych. Odczytaj tę samą płytkę w kierunku prostym i odwrotnym. Aby uzyskać te odczyty, zdefiniuj program odczytu od „dołka 1–384”, a następnie bezpośrednio od „384–1”.
        UWAGA: Odczyt w obu kierunkach trwa łącznie 2 min. Taki sposób odczytu ma na celu zrekompensowanie spadku siły sygnału, który występuje podczas odczytu płytki w każdym z kierunków. Analizę odczytów przedstawiono w punkcie 3.1.
      4. pozostałą ilość należy zutylizować 1 µL roztworu leku w końcówkach poprzez zanurzenie końcówek w 150-mililitrowym zbiorniku na odpady zawierającym ok. 50 mL DPBS (prędkość dozowania: 1.0 µL/s).
      5. Inkubować związki przesiewowe z komórkami przez łącznie 5 min (wliczając 2 min odczytu płytek) w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy wyłączonym świetle. Dodać 3 µL peptydu agonisty Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) z rezerwuaru (prędkość aspiracji: 3.1 µL/s) do płytki analitycznej za pomocą systemu dozowania cieczy (prędkość dozowania: 3.1 µL/s) z 384/12.5 µL Wskazówki.
      6. Umieść płytkę w czytniku płytek natychmiast po dodaniu peptydu agonistycznego. Odczytaj płytkę w kierunku prostym i odwrotnym, korzystając z tego samego programu, co w kroku 2.3.12.3.

3. Analiza danych

  1. Za pomocą oprogramowania analitycznego powiązanego z czytnikiem płytek zainstalowanym na komputerze, oblicz odpowiedzi fluorescencji komórkowej (w RFU) dla obu odczytów po pierwszym dodaniu związku (pierwszy odczyt; RFUago [Tabela uzupełniająca S2]) oraz po etapach dodania agonisty (drugi odczyt = RFUant [Tabela uzupełniająca S2]). Każdy odczyt uzyskuje się poprzez wyciągnięcie średniej z dwóch wartości otrzymanych (nie pokazano) z odczytów płytki w kierunku przód i tył odpowiednio w kroku 2.3.12.3 i kroku 2.3.12.6.
    UWAGA: RFUago i RFUant odnoszą się odpowiednio do jednostek względnej fluorescencji dla potencjalnych trafień agonistycznych (odczyt w kroku 2.3.12.3) i potencjalnych trafień antagonistycznych (odczyt w kroku 2.3.12.6).
  2. Wyeksportuj wszystkie trzy zestawy danych, RFUbg, RFUago i RFUant, z oprogramowania analitycznego do trzech oddzielnych arkuszy kalkulacyjnych. Każdy arkusz będzie zawierał tylko dwie kolumny: położenie studzienki i surowe RFU (pliki tutaj nie pokazane).
    UWAGA: RFUbg odnosi się do RFU odczytu tła w kroku 2.3.11.2.
  3. Sformatuj dane z trzech arkuszy i zorganizuj powyższe dane w jednym pliku csv (patrz przykład w Tabeli uzupełniającej S2). Odejmij odczytany sygnał tła odpowiednio od RFUago i RFUant (kolumny G i H w Tabeli uzupełniającej S2).
  4. Zaimportuj plik csv do komercyjnie dostępnej „internetowej platformy danych HTS” (patrz Tabela materiałów) w celu dalszej analizy danych (Tabela 1) i ich przechowywania.
  5. Oblicz ręcznie współczynnik Z' dla kontroli jakości każdego testu na płytce, korzystając z równania (1):
    równanie (1):
    Równanie współczynnika Z', ocena jakości testu, formuła w biostatystyce.    (1)
    UWAGA: µc- i µc+ reprezentują średnie RFU odczytów z tych samych studzienek, które służą odpowiednio jako kontrole negatywne w pierwszym dodaniu po dodaniu rozpuszczalnika (czysty rozpuszczalnik, n = 64; liczby na niebiesko w Tabeli uzupełniającej S2) i jako kontrole pozytywne po dodaniu agonisty (czysty rozpuszczalnik + agonista, n = 64; liczby na magenta). Dodatkowo σc- i σc+ reprezentują ich odpowiadające odchylenia standardowe (SD).
  6. Ręcznie wybierz cząsteczki trafienia z map ciepła na „internetowej platformie danych HTS” i oblicz znormalizowany procent aktywacji (NPA) oraz aktywność inhibicyjną (Io) dla trafień agonistycznych i antagonistycznych, korzystając z równania (2) i równania (3):
    Formuła statycznej równowagi, równanie NPA, schemat edukacyjny, naukowe obliczanie procentowe.    (2)
    Statyczna równowaga; równanie: Io=[1-(RFUant-RFUbg)/µC+]×100%; schemat; obliczenia badawcze.    (3)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu zademonstrowania tego testu HTS jako przykładu wykorzystano wewnętrzną płytkę z lekami (SAC2-34-6170) zawierającą 320 losowych małych cząsteczek. Test HTS wykazał doskonałą jakość, z czynnikiem Z' wynoszącym 0,7 (Tabela 1). Ten czynnik Z' odzwierciedla jakość testu niezależnie od badanych związków34. Czynnik Z' równy 0,5 lub wyższy wskazuje na dobry zakres dynamiki sygnału testu pomiędzy wartościami RFU kontroli pozytywnych a kontroli negatywnych. Test...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem HTS jest identyfikacja trafionych cząsteczek poprzez badanie przesiewowe ogromnej liczby małych cząsteczek. W związku z tym wyniki z tego przykładu reprezentują tylko niewielką część konwencjonalnego eksperymentu HTS. Ponadto zidentyfikowane cząsteczki trafienia muszą zostać poddane walidacji w dalszych testach, takich jak test zależny od dawki na tej samej rekombinowanej linii komórkowej i na linii komórkowej CHO-K1 przenoszącej tylko pusty wektor, które można przeprowadzić jednocześnie w celu uratowania małych cz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (numer nagrody 2022-67015-36336, PVP [Dyrektor Projektu]) oraz z konkurencyjnych funduszy z Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) dla P.V.P. Grupa wydziałowa A.W.E.S.O.M.E. z Kolegium Rolnictwa i Nauk Przyrodniczych, TAMU, jest wdzięczna za pomoc w edycji manuskryptu. Tabela uzupełniająca S2 zawiera dane z wewnętrznej, losowej biblioteki małych cząsteczek uzyskanych z laboratorium dr Jamesa Sacchettiniego na Texas A&M University i Texas A&M AgriLife Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibco Invitrogen15050-065z czerwienią fenolową
0,4% błękit trypanowyMilliporeSigmaT8154płyn, sterylne
probówki mikrowirówkowe 1,5 mlThermo FisherAM12400Probówki do mikrofuge bez RNaz
5 ml pipeta serologicznaCorning29443-045Corning Costar Stripette pakowane pojedynczo 
Pipeta serologiczna 10 mlCorning29443-047Corning Costar Stripette pakowana pojedynczo 
Probówki stożkowe 15 mlFalcon352196sterylne
20 µ L końcówki filtrówUSA Scientifc Inc.P1121sterylna, barierowa
pipeta serologiczna 25 mlCorning29443-049Corning Costar Stripette pakowana pojedynczo 
Probówki stożkowe 50 mlCorning430828z podziałką, sterylne
150 ml automatycznie przyjazne rezerwariumIntegra Bioscience6317sterylne, pakowane pojedynczo do wysiewu komórek w dniu 1
150 ml automatycznie przyjazne rezerwariumIntegra Bioscience6318sterylne, ułożone w stos, do ładowania barwnika w dniu 2
384/ 12,5 i mikro; L końcówki o niskiej retencjiIntegra Bioscience6405długi, sterylny filtr
384/ 12,5 µ L końcówkiIntegra Bioscience6404długa, sterylna
płytka 384-dołkowaGreiner781091CELLSTAR, polistyren bezbarwny, &mikro; Przezroczyste, czarne/
płaskie uszczelki z płyty aluminiowejAxygen ScientificPCR-AS-200bazie poliestru
SzafkaWalmart
Biosafty IINuAireNU-540-300
Licznik komórekProwadnice doAutoT4
NexcelomSD-10020 i mikro; Komora L
Inkubator nawilżany CO2Lampa biurkowa Thermo FisherForma Series II
SunvaleeyTEKRS1000B
Milipore, MiliporeSigma276855bezhydrauliczna, >99.9%
Talerz lekuCorning3680
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoCorning21-031- CVDPBS, 1x bez wapnia i magnezu
EtanolKoptec2000
F-12K Mieszanka składników odżywczych Corning45000-354(mod. Kaighna) z L-glutaminą
Surowica bydlęcapłodu Equitech-BioSFBU30
Fluorescencyjny zestaw do oznaczania wapniaENZO LifescienceENZ-5101710x96
testy siarczan G418Gibco Invitrogen10131-027Selektywny antybiotyk Geneticin 50 mg / ml
Bufor HankaMilliporeSigma55037CHBSS modyfikowany, z wapniem, z magnezem, bez fenolu odczyt
Bufor HEPESGibco Invitrogen15630-0801
Molowa płyta do przechowywania danych HTSCDD vault https://www.collaborativedrug.com/
System transportu cieczyIntegra BioscienceViaflo384/12.5 µ L
Wirówka płytkowaThermo FisherSorvall ST8
Czytnik płytekTechnologia BMGClariostar
Poly-D-lizynaMiliporeSigmaP6407
Peptyd agonistyczny Rhimi-K-1zamówienie niestandardoweQFSPWGamide
T-75kolba Falcon353136
folia aluminiowa na liczenia komórek Nexcelom Na

Bibliografia

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993(2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260(2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167(2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151(2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486(2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732(2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008(2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800(2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940(2021).
  24. Kim, Y. -J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409(2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607(2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037(2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test podw jnego dodawaniama ocz steczkowe ligandyreceptor kinindetekcja agonist w i antagonist wp ytka 384 do kowawewn trzkom rkowe sygnalizowanie wapnioweczytnik p ytek
Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.