Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64509

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Streszczenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą generować złożone organoidy tkankowe, które są przydatne do badań nad modelowaniem chorób in vitro i do opracowywania terapii regeneracyjnych. Protokół ten opisuje prostszą, solidniejszą i krokową metodę generowania organoidów siatkówki w hybrydowym systemie hodowli składającym się z przylegających kultur jednowarstwowych w ciągu pierwszych 4 tygodni różnicowania siatkówki do momentu pojawienia się odrębnych, samoorganizujących się pierwotnych klastrów pola ocznego (EFP). Ponadto okrągłe i półprzezroczyste wyspy nerwowo-siatkówkowe w kształcie pączka w każdym EFP są ręcznie wybierane i hodowane pod zawiesiną przy użyciu nieprzylegających szalek hodowlanych w pożywce różnicującej siatkówkę przez 1-2 tygodnie w celu wytworzenia wielowarstwowych miseczek nerwu wzrokowego 3D (OC-1M). Te niedojrzałe organoidy siatkówki zawierają proliferujące PAX6 + i ChX10 +, multipotencjalne prekursory siatkówki. Komórki prekursorowe są liniowo samoorganizujące się w organoidach i pojawiają się jako wyraźne promieniste prążki. Po 4 tygodniach od posiewu zawiesinowego komórki progenitorowe siatkówki ulegają postmitotycznemu zatrzymaniu i różnicowaniu linii, tworząc dojrzałe organoidy siatkówki (OC-2M). Prekursory zaangażowane w linię fotoreceptorów rozwijają się w najbardziej zewnętrznych warstwach organoidów siatkówki. Te komórki fotoreceptorów CRX+ i RCVRN+ dojrzewają morfologicznie, aby wyświetlać wewnętrzne rozszerzenia podobne do segmentów. Metoda ta może być stosowana do generowania organoidów siatkówki przy użyciu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wszystkie kroki i procedury są jasno wyjaśnione i zademonstrowane, aby zapewnić powtarzalność i szersze zastosowania w naukach podstawowych i badaniach translacyjnych.

Wprowadzenie

Siatkówka to wrażliwa na światło tkanka znajdująca się w tylnej części oka kręgowców, która przekształca sygnały świetlne w impulsy nerwowe za pomocą zjawiska biochemicznego znanego jako szlak fototransdukcji. Początkowe impulsy nerwowe generowane w komórkach fotoreceptorów siatkówki są przekazywane do innych interneuronów siatkówki i komórek zwojowych siatkówki (RGC) i docierają do kory wzrokowej mózgu, co pomaga w percepcji obrazu i reakcji wzrokowej.

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), około 1,5 miliona dzieci jest niewidomych, z czego 1 milion mieszka w Azji. Dziedziczna dystrofia siatkówki (IRD) jest poważną chorobą powodującą ślepotę, która dotyka 1 na 4 000 osób na całym świecie1,2,3, podczas gdy częstość występowania ślepoty związanej ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) waha się od 0,6%-1,1% w krajach rozwijających się4. IRD są spowodowane dziedzicznymi wadami genetycznymi w ponad 300 różnych genach zaangażowanych w rozwój i funkcję siatkówki5. Takie zmiany genetyczne skutkują zaburzeniem prawidłowych funkcji siatkówki i stopniową degeneracją komórek siatkówki, a mianowicie komórek fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), prowadząc w ten sposób do poważnej utraty wzroku i ślepoty. Ogromny postęp poczyniono w innych stanach oślepiających obejmujących rogówkę, soczewkę itp. Jednak dystrofie siatkówki i zaniki nerwu wzrokowego nie mają do tej pory żadnej sprawdzonej terapii. Ponieważ siatkówka dorosłego człowieka nie posiada komórek macierzystych6, alternatywne źródła, takie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta (iPSC) mogą zapewnić nieograniczoną podaż pożądanych typów komórek i są bardzo obiecujące dla rozwoju złożonych organoidów tkankowych wymaganych do badań modelowania chorób in vitro oraz do opracowywania terapii regeneracyjnych7, 8,9,10.

Kilka lat badań nad siatkówką doprowadziło do lepszego zrozumienia zdarzeń molekularnych, które kierują wczesnym rozwojem siatkówki. Większość protokołów generowania komórek siatkówki i organoidów 3D z PSC ma na celu podsumowanie tych zdarzeń rozwojowych in vitro, poprzez hodowlę komórek w złożonym koktajlu czynników wzrostu i małych cząsteczek w celu stopniowego modulowania znanych procesów biologicznych. Wygenerowane w ten sposób organoidy siatkówki składają się z głównych komórek siatkówki: komórek zwojowych siatkówki (RGC), interneuronów, fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Pomimo udanych prób modelowania IRD za pomocą organoidów siatkówki, wymóg złożonego koktajlu czynników wzrostu i małych cząsteczek podczas różnicowania oraz stosunkowo niska wydajność generowania organoidów siatkówki stanowi poważne wyzwanie w przypadku większości protokołów. Obejmują one głównie tworzenie ciał embrionalnych, a następnie ich stopniowe różnicowanie w linie siatkówki przy użyciu złożonych warunków hodowli na różnych etapach rozwoju in vitro20,21,22.

Tutaj przedstawiono uproszczoną i solidną metodę tworzenia złożonych 3D organoidów neuro-siatkówkowych ze zdrowej kontroli i specyficznych dla choroby siatkówki hiPSC. Opisany tutaj protokół wykorzystuje bezpośrednie różnicowanie prawie zlewających się kultur hiPSC bez konieczności tworzenia ciała zarodkowego. Ponadto złożoność pożywki hodowlanej jest uproszczona, dzięki czemu jest to opłacalna i powtarzalna technika, która może być łatwo zaadoptowana przez nowych badaczy. Obejmuje hybrydowy system hodowli składający się z przylegających kultur jednowarstwowych w ciągu pierwszych 4 tygodni różnicowania siatkówki, aż do pojawienia się odrębnych, samoorganizujących się pierwotnych klastrów pola ocznego (EFP). Co więcej, okrągłe wyspy nerwowo-siatkówkowe w każdym EFP są ręcznie wybierane i hodowane w kulturach zawiesinowych przez 1-2 tygodnie w celu przygotowania wielowarstwowych miseczek 3D siatkówki lub organoidów składających się z proliferujących PAX6 + i CHX10 + prekursorów neurosiatkówkowych. Rozszerzona hodowla organoidów siatkówki w pożywce zawierającej 100 μM taurynę przez kolejne 4 tygodnie spowodowała pojawienie się prekursorów fotoreceptorów RCVRN+ i CRX+ oraz dojrzałych komórek z podstawowymi wewnętrznymi rozszerzeniami przypominającymi segmenty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem hiPSC zostały przeprowadzone aseptycznie, zgodnie ze standardowymi praktykami laboratoryjnymi, wytycznymi etycznymi i bezpieczeństwa biologicznego, oraz za zgodą organów regulacyjnych, takich jak Instytucjonalny Komitet Etyki (IEC), Instytucjonalny Komitet ds. Badań nad Komórkami Macierzystymi (IC-SCR) i Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego (IBSC).

1. Przygotowanie hodowli iPSC i pożywki do różnicowania siatkówki oraz odczynników

  1. Pożywka do hodowli i konserwacji iPSC
    1. Hodowla i utrzymanie normalnej linii hiPSC 23 (hiPSC-F2-3F1) i edytowanej przez CRISPR, linii RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, z bialleliiczną, delecją z przesunięciem ramki odczytu 10 pz w eksonie 18 ludzkiego genu RB1) w pożywce Essential 8 na płytkach hodowlanych pokrytych matrycą (pokrytych matrycą błony podstawnej; patrz tabela materiałów) w warunkach hodowli bez karmienia.
      UWAGA: Protokół ten można całkowicie uwolnić od ksenokształtu, zastępując matrycę błony podstawnej powłoką z rekombinowanej witronektyny (VTN-N). Przygotuj kompletną pożywkę Essential 8, dodając 50 razy suplement Essential 8 (dostarczany z zestawem pożywki Essential 8; patrz tabela materiałów) i 100 j/ml roztworów penicyliny i streptomycyny. Alternatywnie, hiPSC mogą być również hodowane przy użyciu kompletnej pożywki mTeSR1.
  2. Roztwór dysocjacji komórek (1x CDS)
    1. W celu dysocjacji i pasażowania ludzkich iPSC bez enzymów, należy przygotować CDS zawierający 0,5 mM EDTA, pH 8,0 i 30 mM NaCl w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) (patrz Tabela materiałów).
    2. Aby przygotować 100 ml 1x CDS, dodaj 100 μl 0,5 M EDTA i 1 ml 3 M roztworów podstawowych NaCl do 99 ml 1x DPBS, dobrze wymieszaj i przefiltruj sterylizację za pomocą filtra 0,22 μm.
  3. Medium indukcyjne różnicowania (DIM)
    1. Przygotuj DIM za pomocą DMEM-F12 Podłoże podstawowe uzupełnione 10% zamiennikiem surowicy nokautującej (KOSR), 1x aminokwasem endogennym (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 200 μM kwasu L-askorbinowego i 1% suplementem N2 (patrz tabela materiałów).
  4. Podłoże różnicujące siatkówkę (RDM)
    1. Przygotuj RDM za pomocą DMEM-F12 Basal Medium uzupełnionego 10% Knockout Serum (KOSR), 1x Aminokwas Endogenny (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml Penicyliny-Streptomycyny, 200 μM kwasu L-askorbinowego i 2% suplementu B27 (z witaminą A) (patrz Tabela Materiałów).
  5. Powierzchnie hodowli komórkowych pokryte macierzą zewnątrzkomórkową
    1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej z zawartym w hESC przez noc w pojemniku na lód, najlepiej w lodówce w temperaturze 4-8 °C. Rozcieńczyć rozmrożony 100-krotny bulion (5 ml) w stosunku 1:5, dodając 20 ml lodowatego podłoża podstawowego DMEM-F12 i delikatnie mieszając, aby uzyskać 20-krotny roztwór podstawowy.
      1. Przygotować 0,5 ml porcji na lodzie, używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet i sterylnych probówek do mikrowirówek. Oznacz fiolki jako zapasy 20x i przechowuj je zamrożone w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
    2. W celu pokrycia powierzchni kultur komórkowych (szalki hodowlane lub płytki 6-dołkowe), należy rozmrozić podwielokrotność 20x matrycy na lodzie i rozcieńczyć ją w stosunku 1:20 przy użyciu lodowatego podłoża podstawowego DMEM-F12 w celu przygotowania 10 ml 1x roztworu do powlekania matrycy, który jest wystarczający do pokrycia 100 mm szalki lub płytki 6-dołkowej (1,5 ml/basenik).
      UWAGA: Przed użyciem roztworu matrycowego należy wstępnie schłodzić pipety/mikrokońcówki, zasysając lodowato zimny i sterylny DPBS. Rozmrażanie i wszelkie obchodzenie się z matrycą musi odbywać się na lodzie, przy użyciu wstępnie schłodzonych pipet/mikrokońcówek, aby uniknąć polimeryzacji i żelowania w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać 1,5 ml 1x roztworu do powlekania matrycy do każdego dołka na 6-dołkowej płytce, delikatnie zawirować płytkę, aby zapewnić równomierne pokrycie, i inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Pozostawić płytki w nienaruszonym stanie przez co najmniej 1 godzinę, aby zapewnić równomierne pokrycie matrycy na powierzchniach hodowli.
    4. Przed wysiewem komórek odessać roztwór powlekający za pomocą sterylnej pipety o pojemności 5 ml i wyrzucić płynne odpady. Natychmiast dodać świeżą pożywkę hodowlaną (2 ml / dołek z płytki 6-dołkowej) i zasiać komórki o gęstości 150 000-200 000 komórek / basenik. Nie dopuścić do wyschnięcia płytek podczas przenoszenia.
      UWAGA: Alternatywnie, rekombinowana powłoka witronektyny (VTN-N) o końcowym stężeniu 0,5 μg/ml może być stosowana do protokołu hodowli wolnej od kseno.

2. Ustanawianie kultur iPSC u ludzi

  1. Rozmrażanie i ożywienie hiPSC
    1. Pokryj jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej 1x roztworem matrycy membranowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację i równomierne pokrycie powierzchni hodowli.
    2. Po 1 godzinie inkubacji usunąć roztwór powlekający i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki Essential 8 zawierającej 10 μM inhibitora kinazy Rho, Y-27632 (1 μL/ml z 10 mM zapasu; patrz Tabela Materiałów), przed ożywieniem komórek.
    3. Wyjąć wywar kriowialny hiPSC (1 x 106 komórek/fiolkę) z pojemnika z ciekłym azotem. Szybko rozmrozić kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Nie rozmrażać fiolki całkowicie; Zanotuj numer przejścia, wysterylizuj powierzchnię fiolki i wytrzyj ją do sucha za pomocą niestrzępiącego się wacika zawierającego 70% alkoholu izopropylowego.
    4. Używając sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1 ml, odessać zawartość kriowialną do świeżej probówki o pojemności 15 ml składającej się z 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki Essential 8 bez Y-27632. Odwirować probówkę o masie 1 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 1,0 ml kompletnego podłoża Essential 8 zawierającego 10 μM Y-27632.
    6. Dodaj tę zawiesinę komórek na powierzchnie pokryte matrycą, nie naruszając matrycy poprzez dozowanie jej wzdłuż ścianek. Delikatnie kołysz płytką w poprzek, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek.
    7. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 , aby komórki mogły przylegać i rozpocząć namnażanie.
    8. Po 12-24 godzinach wymień zużytą pożywkę i utrzymuj kultury w podgrzanym, kompletnym pożywce Essential 8 bez Y-27632.
    9. Zmieniaj pożywkę co 24 godziny i przechodź przez kultury, gdy osiągną 70%-80% konfluencji.
      UWAGA: W przypadku kultur hiPSC rutynowo stosuje się stosunek podziału 1:6 i jest on pasażowany w regularnych odstępach czasu 3-4 dni.
  2. Pasażowanie i powlekanie hiPSC w celu zainicjowania różnicowania linii siatkówki
    1. Odessać zużytą pożywkę z 70%-80% zlewających się ludzkich kultur iPSC na płytkach 6-dołkowych.
    2. Dodać 1 ml CDS (krok 1.2) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut, aż komórki się zaokrąglą. Ostrożnie wyjmij CDS, uważając, aby nie oderwać komórek, dodaj 2 ml świeżej pożywki Essential 8 i delikatnie rozetrzyj za pomocą pipety.
    3. Zawiesinę komórkową zebrać z jednego dołka płytki 6-komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,2 ml pożywki Essential 8 i dozować 200 μl komórki 200 μl zawiesiny komórkowej (stosunek podziału 1:6) do każdego dołka pokrytej matrycą 6-dołkowej płytki zawierającej 1,5 ml pożywki hodowlanej iPSC zawierającej 10 μM Y-27632, jak opisano w kroku 1.5.
    5. Po 12-24 godzinach wymień zużytą pożywkę i utrzymuj kultury w podgrzanym, kompletnym pożywce Essential 8 bez Y-27632.
    6. Zmieniaj pożywkę co 24 godziny, aż kultury osiągną zbieżność 70%-80%.

3. Różnicowanie hiPSC na pola oka i linię siatkówki

UWAGA: Schematyczny zarys procesu różnicowania jest pokazany w Rysunek 1.

  1. Procedurę różnicowania należy rozpocząć, gdy kultury hiPSC osiągną zbieżność 70%-80%.
  2. W dniu 0 należy zmienić pożywkę podtrzymującą hiPSC na DIM (krok 1.3) zawierającą 1 ng/ml bFGF i 1 ng/ml Noggin. Dodać 2,0 ml pożywki na dołek 6-dołkowej płytki i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
    UWAGA: Stopniowe wycofywanie bFGF indukuje różnicowanie PSC, a dodanie rosnących stężeń Noggin (inhibitora kilku BMP) w początkowych stadiach indukuje różnicowanie linii ektodermalnej i neuralizację11,12 i blokuje zaangażowanie mezodermy i endodermy. Alternatywnie Noggin może zostać zastąpiony przez LDN193189. W przeciwieństwie do opisanej wcześniej strategii podwójnego hamowania SMAD20,21, ten protokół nie wymaga dodawania Activin ani SB-431542.
  3. W dniu 1 zmień zużytą pożywkę i dodaj DIM zawierający 1 ng/ml bFGF i 10 ng/ml Noggin. Dodać 2,0 ml na dołek płytki 6-dołkowej. Inkubować i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  4. W dniach 2-3 usuń zużytą pożywkę i dodaj DIM zawierający tylko 10 ng/ml Noggin. Dodać 2,0 ml na dołek płytki 6-dołkowej i zmieniać podłoże co 24 godziny. Inkubować i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
    UWAGA: Przed użyciem należy zawsze wstępnie podgrzać pożywkę hodowlaną do 30-37 °C. Nadmiar i martwych komórek można zaobserwować we wczesnych kulturach różnicujących. W takich warunkach należy raz przemyć kultury 1x DPBS i dodać pożywkę różnicującą siatkówkę. Testy sterylności zużytej pożywki mogą być wykonywane co tydzień lub w zależności od potrzeb.
  5. W dniu 4 usuń zużyte podłoże i dodaj RDM (krok 1.4). Dodać 2,0 ml na dołek z płytki 6-dołkowej i kontynuować utrzymywanie kultur w RDM w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , codziennie zmieniając świeżą pożywkę.
    UWAGA: Alternatywnie, PSC mogą być hodowane jako kultury zawiesinowe od 1 do 3 dnia, na nieprzylegających i okrągłodennych 96-dołkowych płytkach, przy gęstości komórek 5 x 103 komórek/100 μl/basenik, tworząc ciała zarodkowe (EB) w identycznych warunkach hodowli w DIM. Dobrze uformowane EB w dniu 4 można posiać na płytkach pokrytych matrycą zawierających RDM i pozostawić do przylegania, rozprzestrzeniać się i różnicować w sposób opisany poniżej.
  6. Około 14-18 dnia obserwuj kultury pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu pod kątem pojawienia się neuronalnych domen przypominających rozety składających się z wczesnych progenitorów pola oka (Ryc. 2B).
  7. Około 21-28 dnia (3-4 tygodnie) obserwuj kultury pod mikroskopem przy 4-krotnym i 10-krotnym powiększeniu, aby zaobserwować pojawienie się samoorganizujących się, odrębnych EFP, z centralną wyspą okrągłych struktur neuro-siatkówkowych 3D otoczonych ciągłymi wyrostkami nabłonka nerwowego i nabłonka powierzchni oka (Rysunek 2C,D).
    UWAGA: Można zaobserwować około 20-30 EFP na studzienkę 6-dołkowej płytki normalnej kultury różnicowania siatkówki hiPSC. Liczba ta może się różnić w przypadku innych linii hiPSC specyficznych dla choroby, w zależności od ich tła genetycznego i potencjału różnicowania linii siatkówki.

4. Pobieranie organoidów siatkówki

  1. Wyciąganie płomienia szklanych pipet Pasteura do ręcznego pobierania kubków siatkówki.
    UWAGA: Do pobierania danych z pola widzenia należy używać autoklawowanych i sterylnych szklanych pipet Pasteura.
    1. Włącz palnik Bunsena. Weź sterylną pipetę Pasteura i przytrzymaj podstawę w jednej ręce, a końcówkę kapilary w drugiej. Wysterylizuj płomieniem i podgrzej obszar w pobliżu środka końcówki kapilarnej, wykonując ruchy obrotowe, aż szkło stanie się giętkie. Następnie odsuń się od płomienia i szybko pociągnij na zewnątrz, aby utworzyć cienką końcówkę kapilarną z zamkniętym światłem.
    2. Trzymaj cienką końcówkę poziomo przed płomieniem i szybko przepuść ją przez płomień ruchem na zewnątrz, aby utworzyć gładki haczyk lub końcówkę kapilarną w kształcie litery L.
    3. Użyj gładkiej zewnętrznej strefy krzywizny haka kapilarnego jako cienkiej miarki, aby delikatnie podnieść i odłączyć nienaruszone miseczki neuro-siatkówkowe od klastrów EFP.
      UWAGA: Gładki kąt szklanego haka kapilarnego nie powoduje uszkodzeń komórek ani nie powoduje zadrapań na powierzchniach hodowli. To proste narzędzie może być również skutecznie wykorzystywane do rozdzielania pojedynczych kolonii hiPSC we wzorcach siatkowych oraz do przekazywania ich jako małych klastrów komórek podczas ekspansji klonalnej.
  2. Hodowla i utrzymanie miseczek siatkówki w celu wygenerowania organoidów siatkówki 3D.
    1. W dniach 25-30 dodaj 4,0 ml podgrzanej pożywki do różnicowania siatkówki w naczyniu o niskiej przyczepności o średnicy 60 mm przed przygotowaniem do zbioru miseczek nerwowo-siatkówkowych.
    2. Pracuj pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 0,63x-4,5x, aby obserwować i ręcznie wybierać dobrze uformowane miseczki nerwowo-siatkówkowe z poszczególnych EFP.
      UWAGA: Pojawienie się pigmentowanych wyrostków komórek RPE pomaga w łatwej identyfikacji EFP i centralnie umieszczonych miseczek nerwowo-siatkówkowych. Miseczki siatkówki wyglądają jak okrągłe i półprzezroczyste struktury 3D w kształcie pączka, z wyraźnymi promieniowymi prążkami, utworzone przez liniowo ułożone i samoorganizujące się komórki macierzyste siatkówki, w przeciwieństwie do ciasno upakowanych i kulistych lub nieregularnych skupisk utworzonych przez neurony OUN lub komórki grzebienia nerwowego23.
    3. Użyj ciągniętych za pomocą płomienia haczyków do pipet Pasture, aby delikatnie popchnąć i zgarnąć centralną wyspę nerwowo-siatkówkową w obrębie poszczególnych EFP.
    4. Ustawić mikropipetę o pojemności 1 ml do zasysania 100 μl i użyć mikrokońcówek o pojemności 1 ml z szerokimi otworami, aby zassać i przenieść pływające kubki siatkówki do świeżych, mało przylegających naczyń hodowlanych przygotowanych w kroku 4.2.1.
      UWAGA: Używanie końcówek o mniejszym rozmiarze otworu i wyższym ciśnieniu ssania może powodować ścinanie i wpływać na integralność miseczek siatkówki. Przybliżone wymiary miseczek siatkówki to około 1-2 mm średnicy.
    5. Utrzymuj bańki siatkówki w RDM jako nieprzylegające kultury zawiesinowe i inkubuj je w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    6. Dzień 30-45: Zmieniaj pożywkę codziennie, delikatnie przechylając naczynie i pozwalając miseczkom siatkówki osiąść na około 30 sekund. Postępuj zgodnie z metodą częściowego karmienia, usuwając połowę objętości zużytej pożywki i zastępując równą objętością świeżej pożywki.
      UWAGA: Unikaj wielokrotnego zasysania i przenoszenia, aby zapobiec uszkodzeniu miseczek siatkówki. Po 1-2 tygodniach hodowli zawiesinowej miseczki siatkówki nieznacznie powiększają się (1-3 mm) i przekształcają się w samoorganizujące się organoidy siatkówki 3D (OC-1M) składające się z liniowo ułożonych, wczesnych progenitorów neuro-siatkówkowych wykazujących ekspresję PAX6 i CHX10 (Ryc. 3Bi).
    7. Dzień 45-60: Hodowla organoidów siatkówki przez kolejne 4 tygodnie w RDM zawierającym 100 μM tauryny (patrz tabela materiałów) w celu wsparcia lepszego przeżycia i różnicowania linii progenitorów neuro-siatkówki oraz rozwoju dojrzałego typu komórek siatkówki (OC-2M).
      UWAGA: Około 70%-80% miseczek siatkówkowych lub wzrokowych pobranych z EFP pozostaje nienaruszonych, zachowuje laminację i przekształca się w dojrzałe organoidy siatkówki po 4 tygodniach hodowli zawiesinowej (OC-2M).
    8. Sprawdź, czy dojrzałe organoidy siatkówki po 4 tygodniach hodowli zawiesinowej wykazują pojawienie się prekursorów fotoreceptorów RCVRN+ i CRX+ oraz dojrzałych komórek z podstawowym wewnętrznym rozszerzeniem przypominającym segment w najbardziej zewnętrznych warstwach komórkowych, podsumowując w ten sposób normalny proces rozwoju i dojrzewania siatkówki in vitro (Rysunek 3Bii).
      UWAGA: Po usunięciu bańek nerwowo-siatkówkowych kultury różnicowania mogą być w sposób ciągły utrzymywane w RDM. Proksymalne wyrostki nabłonkowe otaczające siatkówkę nerwową zawierają prekursory komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), które dalej rozszerzają się i dojrzewają, tworząc pigmentowane monowarstwy RPE o typowej morfologii brukowej (Ryc. 4). Dystalne wyrostki składają się głównie z nabłonka powierzchni oka, który przyczynia się do powstania soczewki inabłonka rogówki.Pożądane typy komórek mogą być zbierane z różnych stref wyrostków EFP i dalej wzbogacane w celu uzyskania czystych kultur.

5. Charakterystyka organoidów siatkówki

  1. Charakterystyka morfologiczna i molekularna
    1. Obserwuj przylegające EFP i pływające organoidy siatkówki pod mikroskopem z kontrastem fazowym przy powiększeniu 4x i 10x oraz udokumentuj ich morfologię i wymiary.
    2. Zebrać około 20 organoidów siatkówki na różnych etapach dojrzewania (kroki 4.2.3-4.2.6) do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówek o szerokim otworze 1 000 μl. Pozwól organoidom osiąść na dnie i odessać pożywkę. Umyj kubki 1x PBS.
    3. Usunąć nadmiar PBS i dodać 1,0 ml odczynnika TRIzol (patrz Tabela Materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Homogenizować tkankę za pomocą tłuczka do probówki i rozcierać za pomocą pipety o pojemności 1,0 ml.
    4. Przygotować całkowite RNA, postępując zgodnie ze standardową metodą odczynnika do izolacji i oczyszczania RNA, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    5. Sprawdź jakość RNA na żelu agarozowym i oznacz go ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop (patrz tabela materiałów).
    6. Przekształć 1-2 μg całkowitego RNA w cDNA za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Tabela 1 zawiera listę starterów specyficznych dla genu.
    7. Pokrótce przygotować główną mieszaninę RNA i startera w 10 μl całkowitej objętości, jak podano w tabeli 2 i inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut w termocyklerze. Przenieś probówkę z termocyklera do lodu na 2 minuty.
    8. W międzyczasie należy przygotować mieszankę wzorcową 2 z odczynnikami wymienionymi w tabeli 3. Dodać tę mieszankę wzorcową do probówki z mieszanką RNA-starter przygotowanej w kroku 5.1.7. Delikatnie wymieszaj.
    9. Inkubować próbkę w temperaturze 50 °C przez 50 minut, następnie w temperaturze 85 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C w celu zatrzymania reakcji.
    10. Użyj zsyntetyzowanego cDNA jako matrycy w reakcjach PCR, aby sprawdzić ekspresję markerów progenitorowych i dojrzałych komórek siatkówki neuro-siatkówki.
    11. Normalizuj całkowite matryce cDNA każdej próbki, a mianowicie F2-UD (hiPSC-F2-3F1; niezróżnicowane komórki), OC-1M (1-tygodniowy kubek wzrokowy w hodowli zawiesiny) i OC-2M (4-tygodniowy kubek wzrokowy w hodowli zawiesinowej) przez półilościowy PCR przy użyciu genów porządkowych, takich jak hE1fα lub GAPDH.
    12. Przygotować mieszaninę wzorcową do półilościowej reakcji PCR, jak podano w tabeli 4, i umieścić probówki z próbką do amplifikacji w termocyklerze. Warunki amplifikacji PCR przedstawiono w tabeli 5.
  2. Histologia i immunohistochemia
    1. Zebrać miseczki optyczne w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml i odessać nadmiar pożywki (kroki 4.2.3-4.2.6). Opłucz organoidy 1x PBS, a następnie umyj je i zawieś w 500 μl 4% paraformaldehydu, aby utrwalić je przez noc w temperaturze pokojowej.
    2. Następnego dnia umyj kubki w wodzie dejonizowanej. Pozostaw kubki do odstawienia w 95% alkoholu (trzy zmiany, 15-20 min każda), a następnie 100% alkoholu (trzy zmiany po 15-20 min każda), mieszankę alkoholu bezwodnego i ksylenu w stosunku 1:1 przez 15 minut, ksylenu (dwie zmiany po 15 min każda) i parafiny (trzy zmiany po 15 min każda). Osadź tę tkankę, aby przygotować blok parafinowy zgodnie ze standardowymi procedurami. Pozwól mu ostygnąć i stężać.
    3. Przygotować cienkie skrawki (o grubości ~4-5 μm) za pomocą mikrotomu i umieścić je na szkiełkach mikroskopowych pokrytych silanem (patrz tabela materiałów) zgodnie ze standardowymi procedurami histologicznymi.
    4. W celu odparafinowania podgrzewać szkiełka w temperaturze 70 °C na bloku grzewczym przez 15-20 minut. Gdy wosk się rozpuści, umyj szkiełka ksylenem (trzy zmiany po 3-4 minuty), który całkowicie usunie parafinę.
      UWAGA: Niepełne usunięcie parafiny powoduje słabe/niejednolite zabarwienie skrawków z dużą ilością szumów tła.
    5. Ponownie nawodnij szkiełka, używając różnych procentów etanolu (100%, 90% i 80%) przez 3 minuty każda. Przepłukać szkiełka wodą destylowaną i przystąpić do pobierania antygenu.
    6. Przed rozpoczęciem pobierania antygenu należy podgrzać bufor cytrynianowy (pH 6,0) w słoiku z kopliny (patrz tabela materiałów) za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż osiągnie temperaturę 95-100 °C.
    7. Zanurz szkiełka w podgrzanym buforze cytrynianowym i podgrzewaj słoik przez 15 minut w kuchence mikrofalowej. Wyjmij słoik Coplin z piekarnika i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej.
    8. Zablokuj skrawki dla endogennej peroksydazy, dodając mieszaninę metanolu i nadtlenku wodoru w stosunku 1:1 na 5 minut, a następnie trzykrotnie przemyj sekcje 1x PBS.
    9. Przepuszczalność skrawków za pomocą 0,5% Triton-X 100 przez 15 minut. Umyj szkiełka trzykrotnie 1x PBS.
    10. Zablokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciała pierwszorzędowego, inkubując skrawki z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w 1x PBS przez 1 godzinę.
    11. Inkubować skrawki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć szkiełka trzykrotnie 1x PBS przez 3-5 minut każda, aby usunąć niezwiązane przeciwciało.
    12. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym i inkubować przez 45 minut. Przemyć szkiełka trzykrotnie 1x PBS przez 3-5 minut każde.
      UWAGA: Przeciwciała i ich odpowiednie rozcieńczenia są wymienione w Tabeli materiałów. Skrawki organoidów siatkówki znakowano immunologicznie za pomocą PAX6 i CHX10 w celu wykrycia wczesnych komórek prekursorowych neurosiatkówki oraz przy użyciu Recoverin i CRX w celu wykrycia zaangażowanych komórek prekursorowych siatkówki i fotoreceptorów. Podobnie, anty-PAX6 i anty-MITF zastosowano do wykrywania prekursorów RPE, a anty-CRALBP i anty-RPE65 użyto do wykrycia pigmentowanych dojrzałych komórek RPE za pomocą immunocytochemii kultur jednowarstwowych 2D.
    13. Przeciwbejcuj sekcje za pomocą DAPI lub PI i zamontuj je na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu (patrz Tabela materiałów).
    14. Zobrazuj i udokumentuj znakowane immunologicznie skrawki organoidów siatkówki i kultur RPE za pomocą fluorescencyjnego lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w celu zbadania różnych warstw komórek wyrażających różne markery siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Różnicowanie hiPSC w kierunku linii komórkowych oka osiąga się poprzez hodowlę komórek w różnych mieszaninach pożywek zawierających suplementy i czynniki wzrostu w kolejnych etapach w określonych punktach czasowych, jak opisano na Rysunku 1. Hodowle hiPSC utrzymuje się w pożywce Essential 8, która jest pożywką do utrzymania pluripotencji komórek macierzystych. Po osiągnięciu 70%-80% konfluencji (Rysunek 2A), pożywkę wymienia się w dniu 0 (patrz krok 3.2) na poży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki hiPS są potężnym narzędziem do badania rozwoju narządów i tkanek in vitro. Rekapitulacja fenotypu choroby poprzez różnicowanie zdrowych i specyficznych dla choroby hiPSC w kierunku linii siatkówki może pomóc w uzyskaniu nowszego wglądu w patofizjologię różnych form dziedzicznych dystrofii siatkówki. Opisano i przyjęto kilka protokołów różnicowania in vitro PSC w typy komórek siatkówki. Większość z nich polega na użyciu pożywki hodowlanej zawierającej złożone koktajle rekombinowanych czynników wz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie pozostają w konflikcie interesów ani nie ujawniają informacji finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują za naukowe i techniczne wsparcie ze strony dr Chitry Kannabiran, genetyka; dr Subhadra Jalali, konsultanta ds. siatkówki; dr Milind Naik, chirurga okuloplastycznego; oraz dr Swathi Kaliki, onkologa okulistycznego w Instytucie Okulistycznym LV Prasad w Hajdarabadzie, w kierunku generowania normalnych i specyficznych dla pacjenta linii iPSC. Autorzy dziękują o grantach badawczo-rozwojowych z Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych, Departamentu Nauki i Technologii (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Departamentu Biotechnologii (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) oraz stypendiów badawczych dla seniorów z ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) i CSIR (V.K.P.), rządu Indii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m Filtry strzykawkoweTPP99722 
Probówka wirówkowa 15 mlTPP91015
Probówka wirówkowa 50 mlTPP91050
Płytki 6-dołkoweTPP92006
Przeciwciało anty-Chx10; Mysie przeciwciało monoklonalneSanta CruzSC365519rozcieńczeniem 1:50
Anty-CRX; Monoklonalne przeciwciało przeciw MiTF królikaAbcamab140603rozcieńczenie 1:300
, mysie przeciwciało monoklonalneAbcamab32011:250 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-Recoverin; Królik poliklonalny         MilliporeAB5585Rozcieńczenie 1:300
Suplement B-27 (50x), bez surowicyThermo Fisher17504044
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)Sigma AldrichF0291
5810REppendorf
Coplin Jar (50 mL)Tarson
Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESCCorning
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, suplement GlutaMAX (podłoże podstawowe)Thermo Fisher10565-018
Polimeraza DNA DreamTaqThermo FisherEP0709
Dulbeco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher14190144
Essential 8 średni zestawThermo FisherA1517001
Sól disodowa dwuwodzianu kwasu etylenodiaminowego tetraoctowego (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Szalka Petriego nie poddana obróbce TC, 60 mm Corning351007
Płodu  Bydło  Serum, kwalifikowane, Stany Zjednoczone Gibco26140079
GelDocXR+ z oprogramowaniem laboratorium obrazowegodokumentacji żelu agarozowegoBIO-RAD
GlutaMAX SuplementThermo Fisher35050061
Goat anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011:300 rozcieńczenie
Kozioł anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301:300 rozcieńczenie
Kozioł anty-Królik IgG (H+L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351:300 rozcieńczenie
Kozia anty-IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA11008Rozcieńczenie 1:300
HistoCore MULTICUTLeicaDo cięcia
KnockOut Zamiennik serumThermo Fisher10828028
Kwas L-AksorbowySigma AldrichA92902
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Thermo Fisher11140-050
N2 suplement (100x)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherDo ilościowego oznaczania RNA
ParaformaldehydQualigens23995
Pipipety Pasteura, 9 cali, niesterylne, bez załącznikaCorning7095D-9
Penicylina-Streptomycyna Thermo Fisher15140-122
Rekombinowane przeciwciało anty-Otx2, monoklonalne króliczeAbcamab183951rozcieńczenie 1:300
Rekombinowane przeciwciało anty-PAX6; Królik MonoklonalnyAbcamab1950451:300 rozcieńczenie
Rekombinowane przeciwciało anty-RPE65, Królik monoklonalnyAbcamab2317821:300 rozcieńczenie
Rekombinowane ludzkie białko Noggin R& D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Pipety serologiczne 10 mlTPP94010
Pipety serologiczne 5 mlTPP94005
Chlorek soduSigma AldrichS7653
Cytrynian sodu trójzasadowydwuwodny Sigma AldrichS4641
Starfrost ( pokryte silanem) szkiełka mikroskopoweKnittel
SuperScript III System syntezy pierwszej niciThermo Fisher18080051
SuperScript III System syntezy pierwszej nici do RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol  OdczynnikInvitrogen15596026
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI Laboratoria wektoroweH-1200 
Dichlorowodorek witronektynyThermo FisherA27940
Y-27632 (inhibitor kinazy Rho)Sigma AldrichY0503
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 880
Wirówka 354277 System  

Bibliografia

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361(2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882(2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047(2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766(2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R nicowanie siatk wkiludzkie kultury iPSChodowla zawiesinowakom rki progenitorowe siatk wkimodelowanie chor bprekursory fotoreceptor wimmunohistochemianab onek barwowy siatk wki
Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.