Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64515

⸱

6 października 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Plant Resilience Institute, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji kropelek lipidów plastoglobul związanych z różnymi organizmami fotosyntetycznymi. Pomyślne przygotowanie wyizolowanych plastoglobul jest kluczowym pierwszym krokiem, który poprzedza szczegółowe badania molekularne, takie jak analizy proteomiczne i lipidomiczne.

Streszczenie

Kropelki lipidowe plastoglobuli są dynamicznym podkompartmentem chloroplastów roślinnych i cyjanobakterii. Uważa się, że występują powszechnie wśród gatunków fotosyntetyzujących i odgrywają kluczową rolę w adaptacji i przebudowie błony tylakoidów w szybko zmieniających się warunkach środowiskowych. Zdolność do izolowania plastoglobulek o wysokiej czystości znacznie ułatwiła ich badanie dzięki metodom proteomicznym, lipidomicznym i innym. Dzięki plastoglobulom o wysokiej czystości i wydajności możliwe jest zbadanie ich składu lipidowego i białkowego, aktywności enzymatycznej i topologii białek, a także innych możliwych cech molekularnych. W artykule przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji plastoglobul z chloroplastów tkanki liści roślin oraz przedstawiono warianty metodologiczne izolacji plastoglobul i powiązanych struktur kropelek lipidowych z liści kukurydzy, wysuszonej tkanki liścia rośliny zmartwychwstania, Eragrostis nindensis, oraz cyjanobakterii, Synechocystis Sp. z o.o. PCC 6803. Izolacja opiera się na niskiej gęstości tych bogatych w lipidy cząstek, co ułatwia ich oczyszczanie przez flotację o gęstości sacharozy. Metodologia ta okaże się cenna w badaniach plastoglobul z różnych gatunków.

Wprowadzenie

Obecne zrozumienie składu i funkcji plastoglobul wynika ze szczegółowych badań proteomicznych i lipidomicznych1,2,3,4,5. Takie badania zostały znacznie wsparte szybką i skuteczną metodą izolacji, która opiera się na ich bardzo niskiej gęstości w celu efektywnej separacji za pomocą gradientów sacharozy. Początkowe metody izolacji plastoglobul uzyskano z takich gatunków jak: buk zwyczajny (Fagus sylvatica), miotła zwyczajna (Sarothamnus scoparius), cebula (Allium), szpinak (Spinacia oleracea), bratek (Viola tricolor), papryka (Capsicum annuum) i groch (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11,12,13. Zaktualizowana metoda izolowania plastoglobul chloroplastowych w bardziej wydajny i bardziej wydajny sposób została później przedstawiona przez Ytterberg et al.3,14. Chociaż początkowo stosowaliśmy tę zaktualizowaną metodę do badania plaglobulek chloroplastów liści rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana), z powodzeniem zastosowaliśmy tę zaktualizowaną metodę do zdrowej tkanki liści innych gatunków roślin, zarówno jednoliściennych, jak i dwuliściennych, w tym kukurydzy (Zea mays), pomidora (Solanum lycopersicum), miłosicy (Eragrostis nindensis), fałszywego bromu purpurowego (Brachypodium distachyon) i dzikiego tytoniu (Nicotiana benthamiana; wyniki niepublikowane). Ponadto metoda izolacji została z powodzeniem zaadaptowana do plastoglobulek sinic, w tym Synechocystis sp. PCC 6803 i Anabaena sp. PCC 712015, oraz wysuszonej tkanki liściowej rośliny zmartwychwstania, E. nindensis.

Chloroplastowe globule zdrowej tkanki liścia są fizycznie połączone z błonami tylakoidów16. Pomimo tej fizycznej ciągłości, dwa podprzedziały chloroplastów utrzymują odrębny skład lipidów i białek, chociaż zaproponowano regulowaną wymianę lipidów i białek między tymi dwoma przedziałami2,4,17,18,19. W rzeczywistości niedawno zaproponowano interesujący model hemifuzji dla transportu neutralnych lipidów między chloroplastami a cytozol19. Ze względu na fizyczną ciągłość plastoglobul i tylakoidów, metoda izolacji ze zdrową tkanką liścia rozpoczyna się od pobrania granulowanego surowego preparatu tylakoidów, który jest następnie sonikowany w celu oddzielenia plastoglobul od tylakoidów, co jest przeciwieństwem metod stosowanych do izolowania kropelek lipidów cytozolowych20. Ultrawirowanie na poduszce sacharozowej następnie unosi plastoglobule o niskiej gęstości w górę przez sacharozę, skutecznie oddzielając je od tylakoidów, jąder i innych materiałów o dużej gęstości. W przeciwieństwie do tego, plastoglobule w sinicach, jak również te z wysuszonej tkanki liści, ewidentnie występują in vivo w postaci swobodnie pływającej. W związku z tym ich izolacja polega na bezpośrednim unoszeniu się na gradiencie sacharozy. W artykule przedstawiono metodę izolacji ze zdrowej tkanki liścia, a następnie zademonstrowano dwie odmiany, które można wykorzystać do wyizolowania plastoglobul z wysuszonej tkanki liścia lub kultur sinic, znacznie rozszerzając zakres fizjologiczny i kontekst ewolucyjny, w którym można badać plastoglobule.

Izolowane plastoglobule mogą być następnie używane do dowolnej liczby dalszych analiz w celu zbadania cech molekularnych. Wykorzystaliśmy izolowane plastoglobule z tkanki liścia A. thaliana do obszernej analizy proteomicznej i lipidomicznej w różnych warunkach środowiskowych lub genotypach, wykazując selektywną modyfikację składu białek i lipidów w adaptacji do stresu2,4,21,22. Ponadto przeprowadzono testy kinaz in vitro, które wykazują aktywność transfosforylacji związaną z izolowanymi plastoglobulami22, zbadano stany oligomeryczne składników białkowych za pomocą natywnej elektroforezy żelowej 21, a także przeprowadzono testy golenia proteazy23.

Główną zaletą tej metody jest względna szybkość procedury. Z naszego doświadczenia wynika, że opisane poniżej protokoły można w pełni wykonać w ciągu około 4 godzin. Opisano alternatywną metodę izolowania plastoglobul z tkanki liścia, która pozwala na jednoczesną izolację innych podkompartmentów chloroplastowych24. Ta alternatywna metoda oferuje pewne wyraźne korzyści, gdy konieczne lub pożądane jest porównanie ilościowe z innymi podkompartmentami chloroplastów. Jednak ta alternatywna metoda jest również bardziej żmudna i zapewni znacznie niższą wydajność izolowanych plastoglobul z porównywalnych ilości tkanki liścia. Gdy celem jest ukierunkowane badanie plastoglobulek, przedstawiona tutaj metodologia jest optymalnym wyborem. Niemniej jednak podczas przygotowywania próbki można pobrać całkowitą ilość porcji tylakoidów i surowych liści i zdecydowanie zaleca się to zrobić, aby mieć próbki referencyjne do późniejszego porównania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Surowa izolacja plastoglobul

  1. Surowa ekstrakcja plastoglobuli z nieobciążonej tkanki liści kukurydzy
    1. Zdobądź sześć zdrowych siewek kukurydzy w wieku około 3 tygodni i prawie w fazie wzrostu V5, o wadze około 120 g.
    2. Odetnij wszystkie liście u podstawy łodygi, szybko zanurz je w kąpieli lodowej i przetransportuj do chłodni
      3. .
    3. Pracując pod zieloną lampą bezpieczeństwa, usuń liście kukurydzy z łaźni lodowej i pokrój je na mniejsze kawałki (około 5 cm x 5 cm) za pomocą nożyczek.
    4. Delikatnie, ale dokładnie zmiel połowę przyciętej tkanki liściowej w komercyjnym blenderze w 350 ml buforu do mielenia (Tabela 1). Uruchom blender 5x-6x, aby upewnić się, że wszystkie liście są pocięte. Nie używaj poziomu wyższego niż 7 w blenderze.
    5. Przefiltrować homogenat przez jedną warstwę nylonowej tkaniny o grubości 25 μm na dużym lejku do czterech butelek wirówkowych o pojemności 250 ml. Następnie powtórz krok 1.1.4 z drugą połową przyciętej tkanki liścia.
    6. Równomiernie podzielić filtrat między cztery butelki i odwirować przez 6 minut przy 1,840 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć podwielokrotność filtratu z liści i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem w celu przechowywania jako reprezentatywna próbka liści ogółem.
    7. Odlewać powstały supernatant i delikatnie zawiesić osad w 12 ml pożywki R 0,2 zawierającej 0,2 M sacharozy (Tabela 1), obracając i ponownie zawieszając delikatnymi ruchami szczotki. Po ponownym wymieszaniu każdej granulki, przenieść zawiesinę do następnej butelki i powtórzyć mieszanie. Zawiesiny zebrać w jednej butelce.
    8. Rozprowadzić zbiorczą zawiesinę między sześcioma probówkami ultrawirówek o pojemności 3 ml, osiągając maksymalną objętość 2,5 ml w każdej probówce.
    9. Sonizuj każdą probówkę 4x, za każdym razem przez 10 s, używając sonografu końcówkowego o amplitudzie 100%. Uważaj, aby róg sonitora był zanurzony i z dala od powierzchni cieczy, aby zapobiec pienieniu się.
    10. Powoli przesuwaj klakson sonitora w górę i w dół w zawieszeniu podczas każdej rundy. Stosować naprzemiennie cztery probówki, po każdej sonikacji wkładając każdą probówkę z powrotem do wiadra z lodem, aby próbka ostygła.
    11. Odwirować sonikowaną surową zawiesinę tylakoidów o stężeniu 150 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą strzykawki i igły 22 G zebrać powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul z powierzchni poduszki sacharozy (łatwo widocznej jako żółta, oleista podkładka), przesuwając powierzchnię poduszki otworem igły, odzyskując około 500 μl z każdej probówki. Umieść w probówce o pojemności 2,0 ml.
    12. Zebrać porcje surowego tylakoidu przed i po sonikacji i uwolnieniu plastoglobul. Przejdź do kroku 2.1. Alternatywnie, surowe plastoglobule należy przechowywać w temperaturze -80 °C i oczyścić w późniejszym czasie.
  2. Surowa ekstrakcja plastoglobuli z wysuszonej tkanki liścia E. nindensis
    1. Zaopatrz się w doniczkę (składającą się z trzech pojedynczych roślin w doniczce) z całkowicie wysuszonym, 8-9-tygodniowym E. nindensis (prawie 40 g tkanki).
    2. Odetnij całą tkankę liścia od podstawy rośliny, tuż nad glebą, za pomocą nożyczek i natychmiast zanurz tkankę w kąpieli lodowej. Przetransportuj tkankę do chłodni.
    3. Pracując pod zieloną lampą bezpieczeństwa, odetnij E. Nindensis pozostawia liście na mniejsze kawałki (około 5 cm x 5 cm) za pomocą nożyczek.
    4. Delikatnie, ale dokładnie zmiel liście ze 100 ml buforu do mielenia (Tabela 1) w komercyjnym blenderze. Kilkakrotnie uruchom i zatrzymaj blender, aby upewnić się, że wszystkie liście są pokrojone. Nie używaj poziomu wyższego niż 7 w blenderze.
    5. Przefiltrować homogenat przez jedną warstwę nylonowej tkaniny o grubości 25 μm na dużym lejku do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Usunąć podwielokrotność filtratu z liści i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem w celu przechowywania jako reprezentatywna próbka ogółem liści.
    6. Dodać odpowiednią ilość sacharozy, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 M i rozprowadzić roztwór w probówkach wirówkowych o pojemności 250 ml.
      UWAGA: Wyższe stężenie sacharozy w porównaniu z preparatem Z. mays stosuje się w celu zapewnienia flotacji kropelek lipidów cytozolowych przed późniejszą sonikacją/uwolnieniem plastoglobul związanych z tylakoidami.
    7. Odwirować probówki o masie 45 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Mieszanina plastoglobulek i cytozolowych kropelek lipidów będzie łatwo widoczna jako żółta, oleista podkładka na powierzchni sacharozy lub w jej pobliżu (Rysunek 1B). Zebrać pływający materiał za pomocą strzykawki z igłą 22 G, przesuwając powierzchnię poduszki z otworem igły, a następnie umieścić w tubce.
    8. Odrzucić pozostały supernatant po zebraniu swobodnie unoszącej się mieszaniny plastoglobulek i kropelek lipidów.
    9. Aby wyizolować plastoglobulki połączone z resztkowym tylakoidem, należy ponownie zawiesić osad w 12 ml pożywki R 0,2, obracając i ponownie zawieszając delikatnymi ruchami szczotki. Zawiesiny zebrać w jednej butelce. Przejdź do kroku 1.1.8.
  3. Surowa ekstrakcja plastoglobul z sinic
    1. Wyhoduj 50 ml kultury Synechocystis sp. PCC 6803 do fazy stacjonarnej (około 7-10 dni) i dostosuj gęstość komórek do OD750 2,0 za pomocą spektrofotometru. W warunkach hodowli należy użyć pożywki BG-11 i hodować w inkubatorze przy natężeniu światła 150 μmol fotonów/m2/s, 2% CO2 , 32 °C i przy ciągłym wytrząsaniu przy 150 obr./min.
    2. W celu usunięcia polisacharydów należy przepłukać komórki, odwirowując 50 ml kultury o stężeniu 6 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant. Kontynuuj, przemując komórki dwukrotnie w 50 ml buforu A (Tabela 1). Usunąć podwielokrotność homogenatu komórkowego i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem, aby była przechowywana jako reprezentatywna próbka komórkowa ogółem
    3. Ponownie zawiesić przemyty osad w 25 ml buforu A i rozbić komórki za pomocą francuskiej celi ciśnieniowej przy 1,100 psi, powtarzając proces 3x (umieść próbkę na lodzie między każdym cyklem, aby uniknąć denaturacji białka), aż zlizowany kolor zmieni się z zielonego na czerwono-niebiesko-zielony w białym świetle. Użyj wstępnie schłodzonego ogniwa i wykonaj ten krok w chłodni.
    4. Powstały homogenat rozprowadzić między ośmioma probówkami ultrawirówkowymi o pojemności 3 ml wypełnionymi maksymalnie do 2,5 ml w każdej probówce, a następnie ostrożnie nałożyć na 400 μl pożywki R, tworząc gradient krokowy.
      UWAGA: Szczegółowe opisy przygotowania gradientu sacharozy można znaleźć w Yang, et al. i Kelekar, et al. 25,26.
    5. Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając w razie potrzeby dodatkowe medium R i odwirować przez 30 minut przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C. Tyrakooidy i inne cięższe organelle (w tym wszelkie ciała polihydroksyalkanianowe) będą się osadzać, podczas gdy plastoglobule będą łatwo widoczne jako żółta, oleista podkładka na lub w pobliżu szczytu gradientu sacharozy (Rysunek 1C).
    6. Za pomocą strzykawki i igły 22G zbierz powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul i umieść ją w probówce o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z boku ścianki probówki ultrawirówki za pomocą końcówki igły.
    7. Przejdź do kroku 2.2. Alternatywnie, surowe plastoglobulki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i oczyścić później.

2. Zbieranie czystych plastoglobul

  1. Przetwarzanie tkanek roślinnych
    1. Wytwarzać gradienty sacharozy w probówkach ultrawirówek o pojemności 2,5 ml, najpierw nakładając warstwy na 500 μl surowych plastoglobulek z kroku 1.1 lub kroku 1.2 zmieszanych z 500 μl pożywki R 0,7, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml, następnie nałożyć 400 μl pożywki R 0,2, a następnie nałożyć 400 μl pożywki R.
      UWAGA: Szczegółowe opisy przygotowania gradientu sacharozy można znaleźć w artykułach Yang et al. oraz Kelekar et al.25,26.
    2. Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając nadmiar pożywki R do górnej warstwy, jeśli to konieczne. Następnie odwirować przy 150 000 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
    3. Zbierz powstałą pływającą podkładkę z czystych plastoglobul (Rysunek 1A) za pomocą strzykawki i igły 22G i umieść w probówce o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z górnej części ścianki probówki wirówkowej za pomocą końcówki igły.
    4. Podwielokrotność czystych plastoglobul i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie. Przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub liofilizować do postaci suchego proszku.
  2. Przetwarzanie cyjanobakterii
    1. Wytworzyć gradient sacharozy w czterech probówkach ultrawirówek o pojemności 2,5 ml ułożonych najpierw warstwami z 500 μl surowych plastoglobul z kroku 1.3 zmieszanych z 750 μl pożywki R 0,7, a następnie nałożyć na 750 μl pożywki R 0,2,
      UWAGA: Szczegółowe opisy przygotowania gradientu sacharozy można znaleźć w artykułach Yang et al. oraz Kelekar et al.25,26.
    2. Odwirować gradient sacharozy przy 150 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać czyste plastoglobulki (Rysunek 1C) za pomocą strzykawki i igły 22 G z górnej fazy gradientu sacharozy i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Podaczuj czyste plastoglobule i błyskawicznie zamrażaj w ciekłym azocie. Przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub liofilizować do postaci suchego proszku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zakończeniu kroku 1 protokołu powinna być wyraźnie widoczna znaczna ilość materiału plastoglobul/kropelek lipidowych pływającego na (lub w pobliżu) górnej warstwie poduszki sacharozowej (Ryc. 1B-C). Na tym etapie można zebrać również inne frakcje. Na przykład tylakoidy zostaną osadzone w formie pelletu i mogą zostać zawieszone ponownie w medium R 0.2 do dalszych analiz. Po kolejnym wirowaniu oczyszczone plastoglobule zostaną otrzymane na powierzchni lub w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zminimalizować zmiany fizjologiczne/biochemiczne w materiale i chronić niektóre foto- i termolabilne pigmenty prenylowo-lipidowe, które są bogatym składnikiem plastoglobul, konieczne jest wykonanie izolacji w temperaturze 4 °C i ochrona przed światłem. Jak wskazano powyżej, początkowe kroki wykonuje się w chłodni pod lampą bezpieczeństwa przy użyciu żarówki emitującej zielone światło. Kolejne etapy wykonywane w laboratorium odbywają się przy przyciemnionym oświetleniu i wykorzystują wirowanie lodem lub chłodzeniem. Z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Podziękowania

Badania w grupie laboratoryjnej Lundquist są wspierane przez granty z NSF (MCB-2034631) i USDA (MICL08607) dla P.K.L. Autorzy dziękują dr Carrie Hiser (MSU) za wsparcie w opracowaniu metody izolacji plastoglobul sinicowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AEBSFMilipore SigmaP7626
Antipain.2HClBachemH-1765.0050BA
AprotininMilipore SigmaA6106
AskorbinianBDHBDH9242
BestatinSigma AldrichB8385
Beta-glicerofosforan. 2Na5H2OEMD Milipore35675
Surowica bydlęca AlbuminaProliant Biologiczna68700
ChymostatinSigma AldrichC7268
Eragrostis nindensisN/A N/A
E-64Milipore SigmaE3132
French Pressure cell (model FA-079)SLM/AmincoN/A
HEPESSigma AldrichH3375
LeupeptinSigma AldrichL2884
Chlorek magnezuSigma AldrichM8266
Inkubator z wytrząsaniem MultitronInfors HTN/A
Phospho-ramidon.2 NaSigma AldrichR7385
Wodorotlenek potasuFisher ChemicalsM16050
Zredukowana cysteinaMP Biochemikalia101444
Fluorek soduSigma AldrichS7920
Ortowanadan soduSigma Aldrich450243
Pirofosforan sodu · 10H2OSigma Aldrich3850
SorbitolSigma AldrichS3889
SacharozaSigma AldrichS9378
Sylvania 15 W świetlówka Gro-Lux żarówka, 18"WalmartN/A
Synechocystis sp. PCC 6803N/AN/A
Optima MAX-TL UltrawirówkaBeckman CoulterA95761
Waring Blender (1,2 l)VWR58977-227Blender komercyjny
Zea maysNie dotyczyNie
dotyczy

Bibliografia

  1. Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
  2. Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
  3. Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
  4. Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
  5. Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
  6. Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
  7. Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
  8. Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
  9. Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
  10. Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
  11. Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
  12. Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
  13. Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
  14. Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
  15. Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
  16. Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
  17. Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
  18. Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298(2014).
  19. Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069(2020).
  20. Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867(2020).
  21. Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
  22. Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762(2022).
  23. Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213(2021).
  24. Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
  25. Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014(2022).
  26. Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
  27. Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
  28. Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
  29. Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547(2012).
  30. Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
  31. Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
  32. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja plastoglobulizolacja cyjanobakteriiflotacja gradientowa sacharozyb ona tylakoiduanaliza proteomicznaanaliza lipidomicznaultrawirowaniesk ad bia kowy
Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.