Ten protokół opisuje solidną metodę szczepienia sadzonek, która nie wymaga wcześniejszego doświadczenia ani szkolenia i może być wykonana bardzo niskim kosztem przy użyciu materiałów łatwo dostępnych w większości laboratoriów biologii molekularnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skalowalne, elastyczne i ekonomiczne szczepienie sadzonek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szczepienie sadzonek na wczesnym etapie stało się popularnym narzędziem w genetyce molekularnej do badania relacji między korzeniami a pędami roślin. Szczepienie sadzonek we wczesnej fazie rozwoju małej rośliny modelowej, Arabidopsis thaliana, jest technicznie trudne i czasochłonne ze względu na rozmiar i kruchość jej siewek. Rosnąca liczba opublikowanych metod opisuje tę technikę z różnymi wskaźnikami sukcesu, trudnością i powiązanymi kosztami. W tym artykule opisano prostą procedurę wytwarzania własnego urządzenia do szczepienia wielokrotnego użytku przy użyciu mieszanki elastomerów silikonowych oraz sposób użycia tego urządzenia do szczepienia sadzonek. W momencie tej publikacji produkcja każdego urządzenia do szczepienia wielokrotnego użytku kosztuje tylko 0,47 USD w materiałach eksploatacyjnych. Korzystając z tej metody, początkujący mogą mieć swoje pierwsze pomyślnie zaszczepione sadzonki w mniej niż 3 tygodnie od początku do końca. Ta wysoce dostępna procedura pozwoli laboratoriom genetyki molekularnej roślin na wprowadzenie szczepienia sadzonek jako normalnej części procesu eksperymentalnego. Ze względu na pełną kontrolę, jaką użytkownicy mają nad tworzeniem i projektowaniem tych urządzeń do szczepienia, technikę tę można łatwo dostosować do stosowania w większych roślinach, takich jak pomidory lub tytoń, jeśli jest to pożądane.
Wprowadzenie
Szczepienie to starożytna technika ogrodnicza, która stała się utrwaloną praktyką rolniczą około 500 roku p.n.e.1. Szczepienie różnych odmian roślin uprawnych w celu poprawy plonów było pierwszym zastosowaniem tej techniki i jest nadal wykorzystywane do tego celu. W ciągu ostatniej dekady szczepienie przyciąga coraz większą uwagę jako narzędzie dla biologów molekularnych do badania sygnalizacji długodystansowej u roślin2,3,4,5. Podczas gdy szczepienie dorosłych roślin jest stosunkowo łatwe, szczepienie roślin wkrótce po wykiełkowaniu jest trudne. Mimo to czasami wymagana jest ocena wpływu sygnalizacji długodystansowej na procesy takie jak rozwój roślin, reakcje środowiskowe i kwitnienie6,7,8.
Arabidopsis thaliana został uznany za organizm modelowy w biologii roślin z wielu powodów, w tym ze względu na stosunkowo mały rozmiar, co ułatwia uprawę w laboratorium. Jednak niewielki rozmiar i kruchość sadzonek rzodkiewnika sprawia, że szczepienie młodych sadzonek jest bardzo trudne. W wielu przypadkach konieczne jest obszerne szkolenie praktyczne, aby pomyślnie uzyskać przeszczepy sadzonek. Na przestrzeni lat wprowadzono wiele ulepszeń metodologicznych, które zidentyfikowały idealne warunki wzrostu i nowe techniki zwiększające wskaźnik powodzenia szczepienia sadzonek9,10,11. Najnowszym wprowadzonym narzędziem był chip do szczepienia sadzonek rzodkiewnika, który pozwala nawet niedoświadczonym użytkownikom osiągnąć akceptowalny poziom sukcesu szczepienia12. Chociaż ten postęp znacznie obniżył barierę techniczną szczepienia sadzonek, urządzenie chipowe jest drogie, a liczba przeszczepów, które można przeprowadzić równolegle, szybko staje się zbyt kosztowna.
Dodatkowo, to urządzenie może być używane tylko dla sadzonek Arabidopsis, które mają wymiary hipokotylu podobne do sadzonek typu dzikiego. Podczas gdy rzodkiewnik jest kluczowym gatunkiem w świecie genetyki molekularnej roślin, ostatnie prace przeprowadzono na innych gatunkach przy użyciu szczepienia sadzonek. Przykłady obejmują szczepienie soi i fasoli zwyczajnej, tytoniu pomidora i rzepaku Arabidopsis, a następnie pobieranie próbek z obu tkanek pod kątem małych RNA13,14. Dlatego metoda szczepienia, która jest dostępna dla większości laboratoriów i może być łatwo dostosowana do szerokiej gamy gatunków roślin bez większych zmian technicznych, jest wysoce pożądana.
Ten protokół szczegółowo opisuje metodę, która wykorzystuje wewnętrzną produkcję prostego urządzenia do szczepienia, które pozwala na pełne dostosowanie średnicy i długości kanału szczepienia, aby dostosować się do dowolnej morfologii siewek u większości gatunków roślin. Produkcja tych urządzeń jest bardzo przystępna cenowo i wysoce skalowalna, ponieważ jedynymi potrzebnymi komponentami są elastomer silikonowy, okablowanie lub rurki o odpowiednim rozmiarze, precyzyjne ostrze i pojemnik służący jako forma. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem szczepienia, użytkownicy mogą osiągnąć wskaźnik udanego szczepienia wynoszący 45% (n = 105), porównywalny z poprzednio zgłaszanymi wynikami szczepienia10,12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie urządzenia
- Wykonaj urządzenie do szczepienia silikonu, odlewając roztwór elastomeru silikonowego na kwadratowej szalce Petriego (100 mm x 100 mm). Przygotować 15 ml roztworu elastomeru, postępując zgodnie z wytycznymi producenta.
UWAGA: Zestawy elastomerów silikonowych zazwyczaj zawierają płyn na bazie silikonu i utwardzacz, które po zmieszaniu ze sobą umożliwiają zestalenie się silikonu. - Przygotować kwadratową szalkę Petriego, układając cztery proste kawałki drutu o wadze 29 G na kwadratowej szalce Petriego, w równej odległości od siebie (rysunek 1A). Upewnij się, że drut leży równo z dnem formy. Aby całkowicie wyprostować drut, zwiń go na twardą, jednolitą powierzchnię ciężkim i płaskim przedmiotem (np. metalowym stojakiem na rury).
UWAGA: Opaski zaciskowe często zawierają drut o gramaturze 29 G i mogą być używane po usunięciu zewnętrznej powłoki papierowej za pomocą acetonu. - Wlej zmieszany roztwór elastomeru silikonowego na druty i przykryj górną częścią szalki Petriego. Pozostaw silikon do utwardzenia przez 24-48 godzin w temperaturze pokojowej.
- Usuń silikonowy arkusz z szalki Petriego za pomocą czystych kleszczyków i przenieś na czystą, płaską powierzchnię.
- Usuń przewody z arkusza silikonowego. Usuń cienką warstwę silikonu pozostałą na zewnątrz kanału za pomocą cienkich kleszczyków punktowych, aby umożliwić otwarcie kanału z jednej strony (Rysunek 1A).
- Przytnij arkusz silikonu prostopadle do kanałów na paski 3 mm za pomocą czystych nożyczek. Przenieś każdy pasek do koperty z folii aluminiowej i zaklej taśmą autoklawową.
- Paski należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut i przechowywać do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
2. Przygotowanie sadzonek
- Sterylizuj i wernalizuj nasiona.
- Zawiesić do 100 nasion Arabidopsis w 1 ml 50% roztworu wybielacza zawierającego 0,1% Tween 20 w 1,5 ml probówce do mikrowirówki i inkubować przez 5-10 minut. Usunąć roztwór wybielacza przez pipetowanie lub aspirację w sterylnych warunkach. Opłucz nasiona 1 ml wysterylizowanego dH2O. Pamiętaj, aby odwrócić probówki, aby odpowiednio wypłukać nasiona i usunąć roztwór wybielacza pozostawiony na górze tubki. Powtórzyć płukanie 4x.
- Pozostaw około 0,25 ml wody w probówkach z nasionami i przechowuj w temperaturze 4 °C przez 3 dni w ciemności.
- Talerzuj nasiona w ramach przygotowań do szczepienia.
- Przygotuj 1% agarową płytkę MS w następujący sposób: na 1 l MS (0,5% sacharozy) stałego podłoża wymieszaj 4,4 g soli MS, 5 g sacharozy i 10 g agaru w 800 ml wody, dostosuj pH do 5,7 za pomocą KOH, a następnie dodaj całkowitą objętość do 1 l za pomocą dodatkowej wody. Autoklaw przez co najmniej 20 minut, przed wlaniem ~25 ml do kwadratowych szalek Petriego.
- W sterylnych warunkach przenieś odpowiednią liczbę przygotowanych nasion na płytkę, używając końcówki pipety o pojemności 20 μl do zassania i przeniesienia nasion.
- Umieść sterylny pasek na powierzchni płytki, aby poprowadzić pozycjonowanie nasion, tak aby nasiona były wyrównane z kanałami na pasku. Usuń pasek, gdy nasiona są już pokryte.
UWAGA: Jedna kwadratowa płytka o wymiarach 100 mm x 100 mm może pomieścić dwa rzędy sadzonek (Rysunek 1B). - Gdy płytki staną, pozwól cieczy odparować z podłoża stałego i zebrać się na dnie płytki. Po umieszczeniu nasion na płytce, załóż pokrywę płytki i uszczelnij jedną stronę płytki, która jest równoległa do dwóch rzędów nasion (oznaczonych niebieskim obszarem podświetlonym w Rysunek 1B) za pomocą parafilmu. Owiń oddychającą taśmę na wierzchu parafilmu i wokół wszystkich pozostałych krawędzi płytki.
- Ostrożnie postaw dwie płytki stroną uszczelnioną parafolią skierowaną w dół. Oddziel dwie płytki na dole, umieszczając między nimi poziomą probówkę wirówkową o pojemności 15 ml i zabezpiecz gumową opaską. Upewnij się, że powierzchnie płyty tworzą kąt 100°-110° z powierzchnią blatu (Rysunek 1C).
- Przechowywać płytki w tej orientacji przez 72 godziny w całkowitej ciemności w temperaturze 21 °C, aby umożliwić hipokotylom siewek wzrost długości ~5 mm. Po 72 godzinach wyjmij płytki z ciemności i hoduj pod 16 godzinami światła (intensywność 100 μE m-2 sec-1) i 8 godzinami ciemności przez kolejne 2-4 dni w tej samej temperaturze przed szczepieniem.
- Sadzonki należy szczepić między 5 a 7 dniami po platerowaniu. Umieść pasek do szczepienia na sadzonkach, dopasowując ich hipokotyle do kanałów. Delikatnie ustaw sadzonkę tak, aby połączenie korzeń-hipokotyl znajdowało się na dole silikonowego paska, aby przygotować sadzonkę do cięcia (Rysunek 1D).
3. Procedura szczepienia
- Przygotuj sterylne środowisko pracy, odkażając lunetę sekcyjną 70% etanolem i sterylizując w autoklawie dwie pary kleszczyków z cienką końcówką i uchwyt skalpela. Wszystkie procedury szczepienia należy wykonywać w sterylnym kapturze i w razie potrzeby za pomocą lunety preparcyjnej. Większość przeszczepów należy wykonać przy użyciu powiększenia 10,5x.
- Przygotuj zrazy. Użyj świeżego ostrza skalpela, aby przeciąć hipokotyl prostopadle, aby uzyskać proste, czyste cięcie. Popchnij ostrze do przodu, zamiast wciskać się w roślinę, aby zapobiec wepchnięciu sadzonki do agaru (Wideo 1).
- Usuń pęd. Zadbaj o to, aby wycięta część pędu była nawilżona, zapewniając kontakt z powierzchnią podłoża. Alternatywnie, przenieś pęd do wyznaczonego miejsca trzymania, takiego jak górna część szalki Petriego wypełnionej sterylnym dH2O, aż będzie gotowy do użycia.
- Przygotuj podkładki. Delikatnie pociągnij korzeń, chwytając korzeń w przestrzeni pozostawionej między zamkniętymi kleszczami i obracając je, pozostawiając odcięty fragment podkładek na środku paska (Wideo 2).
UWAGA: Delikatny korzeń zostanie uszkodzony, jeśli zostanie zmiażdżony bezpośrednio między zamkniętymi kleszczami, co wymaga zaklinowania korzenia pod ostrym kątem końców pęsety w celu manipulowania tkanką. - Delikatnie podnieś żądany pęd za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i włóż do górnej części kanału.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wizualnie potwierdzić kontakt między zrazami a podkładkami, aby uzyskać udany przeszczep (Wideo 3). - Po wykonaniu wszystkich przeszczepów owiń płytki folią parafilmową i oddychającą taśmą i ułóż płytki w taki sam sposób jak poprzednio, nie naruszając sadzonek ani pasków silikonowych. Ostrożnie przenieść płytki do komory wzrostowej ustawionej w temperaturze 26 °C z cyklami 16 godzin światła/8 godzin ciemności.
- Oceń szczepione sadzonki w sterylnych warunkach po 7-10 dniach. Ostrożnie usuń silikonowy pasek za pomocą kleszczy, obierając jedną stronę, pozwalając kanałom uwolnić sadzonki. Usuń wszelkie korzenie przybyszowe wyrastające ze zrazu, odcinając je od zrazu świeżym ostrzem skalpela lub miażdżąc je za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Oceń wzrokowo, czy podkładka mocno przylgnęła do zrazu, tworząc udany przeszczep (Rysunek 2).
- Przenieś udane przeszczepy do gleby do rozmnażania sadzonek, aby rosły tak długo, jak to konieczne. Przykryj glebę przezroczystym plastikiem na kilka dni, gdy sadzonki się ustabilizują. Po przeniesieniu roślin do gleby rosną w wyżej wymienionych cyklach światła i ciemności w temperaturze 21 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przetestowano różne aspekty konstrukcji paska szczepionkowego, aby zidentyfikować optymalne warunki szczepienia, które wymagały najmniejszych umiejętności technicznych (Tabela 1). Wszystkie próby szczepienia przeprowadzono na pożywce MS z 0,5% sacharozą, która w poprzednich doniesieniach została uznana za idealną pożywkę do szczepienia11,12.
Optymalny wzrost siewek nie może zostać osiągnięty podczas kiełkowania...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podsumowanie i znaczenie
Utworzenie zrostu przeszczepu ma kluczowe znaczenie dla udanego szczepienia, które wymaga bezpośredniego i niezakłóconego kontaktu między podkładką a zrazem. Miniaturowy rozmiar i kruchość sadzonek małych roślin, takich jak Arabidopsis, sprawia, że spełnienie tego wymogu jest technicznie trudne. Jedną z technik opracowanych we wczesnych metodach szczepienia sadzonek rzodkiewnika było włożenie zarówno zrazu, jak i podkładki do krótkiego silikonowego kołnierz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Podziękowania dla Javiera Brumosa za wstępne szkolenie i wskazówki dotyczące szczepienia sadzonek rzodkiewnika.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki stożkowe 15 ml | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & Rozpuszczalnik z certyfikatem ACS) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silikonowa kapsułka bezbarwna 0,5 kg Zestaw | Dow | 2646340 | |
| D-Sacharoza (biologia molekularna), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Probówki z elastyczną probówką do mikrowirówek zatrzaskowych (1,5 ml), opakowanie 500 sztuk | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Uchwyt skalpela | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Bezołowiowa taśma autoklawu | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Kwadratowe szalki Petriego Fisherbrand | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Mikroskop stereoskopowy Leica Zoom 2000 | Central | L-Z2000 | |
| Taśma Micropore 3M | B0082A9FEM | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| wodorotlenek potasu | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Ostrze skalpela węglowego | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | ||
| DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
Bibliografia
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161(2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14(2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
