Method Article

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

DOI:

10.3791/64522

⸱

November 4th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Immunology Research Department of Biochemical Sciences Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, 2Department of Molecular Biomedicine, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, 3CONACYT- Medicine and Surgery Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, 4Molecular Immunology Research Department of Medicine and Surgery Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile funkcjonują jako pierwsza linia obrony komórkowej we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, wykorzystując różne mechanizmy, takie jak tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). W badaniu przeanalizowano zmiany morfologiczne i składowe w NET wywołane bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi przy użyciu standaryzowanych metodologii in vitro do indukcji i charakterystyki NET w komórkach ludzkich. Opisane tutaj procedury pozwalają na analizę morfologii NET (litycznej lub nielitycznej) i składu (struktury DNA-białkowe i aktywność enzymatyczna) oraz wpływu czynników rozpuszczalnych lub kontaktu komórkowego na takie cechy. Ponadto opisane tutaj techniki mogą być modyfikowane w celu oceny wpływu egzogennych czynników rozpuszczalnych lub kontaktu komórkowego na skład NET.

Stosowane techniki obejmują oczyszczanie komórek wielojądrzastych z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu gradientu podwójnej gęstości (1,079-1,098 g/ml), gwarantując optymalną czystość i żywotność (≥ 95%), jak wykazano za pomocą barwienia Wrighta, wykluczenia błękitu trypanowego i cytometrii przepływowej, w tym analizy FSC kontra SSC i barwienia 7AAD. Tworzenie NET jest indukowane bodźcami mikrobiologicznymi (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans) i chemicznymi (octan mirystynianu forbolu, HOCl), a NET charakteryzują się barwieniem DNA-DAPI, barwieniem immunologicznym peptydu przeciwdrobnoustrojowego katelicydyny (LL37) i oznaczaniem ilościowym aktywności enzymatycznej (elastaza neutrofilowa, katepsyna G i mieloperoksydaza). Obrazy są pozyskiwane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizowane za pomocą ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami w krwiobiegu, odgrywając istotną rolę podczas usuwania czynników chorobotwórczych przez kilka mechanizmów, w tym uwalnianie dużych struktur chromatyny złożonych z DNA i kilku jądrowych, cytoplazmatycznych i ziarnistych białek przeciwbakteryjnych1,2. Bezpośredni poprzednik opisujący tę przeciwdrobnoustrojową rolę neutrofili został stworzony przez Takei et al.3 w 1996 roku. Autorzy ci opisali nową formę śmierci różniącą się od apoptozy i nekroptozy u neutrofili, wykazali zmiany morfologiczne wykazujące pęknięcie jądra, a następnie rozlanie się nukleoplazmy do cytoplazmy oraz wzrost przepuszczalności błony od 3 godzin inkubacji octanem mirystynianu forbolu (PMA)2,3. Jednak dopiero w 2004 roku zaczęto używać terminu "pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET)"4.

NET zaobserwowano w różnych warunkach, takich jak bakteryjne, grzybowe5, wirusowe6, oraz infekcje pasożytnicze, do neutralizacji, zabijania i zapobiegania rozprzestrzenianiu się drobnoustrojów7. Inne badania pokazują, że może również wystąpić w warunkach niepatogennych przez sterylne bodźce, takie jak cytokiny, kwas monosodowy moczowy lub kryształy cholesterolu, autoprzeciwciała, kompleksy immunologiczne i aktywowane płytki krwi7. Lipopolisacharyd (LPS), interleukina-8 (IL-8) i PMA były jednymi z pierwszych bodźców in vitro opisanych jako induktory NET, a udział NET in vivo w procesach patogennych wykazano w dwóch modelach ostrego zapalenia: eksperymentalnej czerwonki i spontanicznego ludzkiego zapalenia wyrostka robaczkowego4. DNA jest istotnym składnikiem NET. Jego odpowiednia struktura i skład są niezbędne do sekwestracji i zabijania mikroorganizmów poprzez dostarczanie wysokiego lokalnego stężenia cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych w kierunku wychwyconych drobnoustrojów, jak wykazano za pomocą krótkiej obróbki dezoksyrybonukleazą (DNazy), która dezintegruje NET i ich właściwości bakteriobójcze4. Oprócz DNA, NET zawierają przyłączone białka, takie jak między innymi histony, elastaza neutrofilowa (NE), katepsyna G (CG), proteinaza 3, laktoferyna, żelatynaza, mieloperoksydaza (MPO) i peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP), takie jak kationowy prozapalny peptyd katelicydyna LL-37 między innymi8,9. Agregaty takie mogą tworzyć większe gwinty o średnicach do 50 nm. Czynniki te mogą zakłócać mikrobiologiczne czynniki wirulencji lub integralność błony komórkowej patogenu; dodatkowo AMP mogą stabilizować DNA pochodzące z NET przed degradacją przez nukleazy bakteryjne10.

Konkretne mechanizmy regulujące powstawanie NET nie zostały jeszcze całkowicie wyjaśnione. Najlepiej scharakteryzowanym szlakiem prowadzącym do uwolnienia NET jest sygnalizacja ERK, która prowadzi do aktywacji oksydazy NADPH i produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), a także zwiększonego wewnątrzkomórkowego wapnia, który wyzwala aktywację szlaku MPO. To z kolei przekształca nadtlenek wodoru w kwas podchlorawy, aktywując NE przez utlenianie11,12. NE jest odpowiedzialny za degradację włókien aktynowych cytoszkieletu w celu zablokowania fagocytozy i translokacji ich do jądra w celu przetworzenia przez rozszczepienie proteolityczne i deaminację przez PAD4, które napędzają odczulanie włókien chromatyny, które wiążą się z ziarnistościami i białkami cytoplazmatycznymi, a następnie są uwalniane zewnątrzkomórkowo7. Proteazy te obejmują te uwalniane z kompleksu azurosomu granulek azurofilowych i innych proteaz, takich jak katepsyna G13.

W zależności od zmian morfologicznych w neutrofilach, NET dzielą się na dwa typy: samobójcze lub lityczne tworzenie NET prowadzące do śmierci komórki4, oraz żywotne lub nielityczne tworzenie NET wytwarzane przez żywotne komórki, w których pośredniczy pęcherzykowe uwalnianie jądrowego lub mitochondrialnego DNA, z pozostałością bezjądrzastego cytoplastu o zdolności fagocytarnej14,15. Ogólnie rzecz biorąc, NET złożone z mitochondrialnego DNA mają wydłużoną morfologię włókna14, podczas gdy te zbudowane z jądrowego DNA mają wygląd podobny do chmury3. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób neutrofile wybierają pochodzenie DNA. W przeciwieństwie do poprzednich badań, które opisywały kanoniczne ścieżki NET jako wymagające kilku godzin, szlak życiowy jest szybko aktywowany w ciągu zaledwie 5-60 minut15.

Pomimo tych postępów, skład NET różni się w zależności od bodźca; na przykład, różne śluzowate i nieśluzowate szczepy P. aeruginosa indukują powstawanie NET zawierających 33 powszechne białka i do 50 zmiennych białek7. W związku z tym konieczne jest ujednolicenie technik pozwalających na generowanie obiektywnych wniosków w grupach badawczych. W artykule opisano protokół z różnymi technikami, które umożliwiają porównanie i ocenę składu, struktury i morfologii NET indukowanych różnymi mikroorganizmami: Staphylococcus aureus (bakteria Gram-dodatnia), Pseudomonas aeruginosa (bakteria Gram-ujemna) i Candida albicans (grzyb), a także bodźcami chemicznymi (PMA, HOCl) u ludzkich neutrofili od zdrowych osób. Reprezentatywne wyniki wskazują na niejednorodność NET w zależności od ich bodźca indukującego w porównywalnych warunkach in vitro, charakteryzujących się barwieniem DNA-DAPI, barwieniem immunologicznym LL37 i kwantyfikacją aktywności enzymatycznej (NE, CG i MPO).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki krwi zostały pobrane jako darowizny od klinicznie zdrowych uczestników po świadomej zgodzie. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etycznej ds. Badań Naukowych na Ludziach Wydziału Nauk Biochemicznych Universidad Autónoma "Benito Juárez" z Oaxaca.

UWAGA: Kryteriami włączenia do badania były niewyraźna płeć i wiek, a klinicznie zdrowe, zgodnie z odpowiedziami uczestników na kwestionariusz przed pobraniem próbki krwi. Przeprowadzono analizę hematologiczną w celu określenia liczby komórek i wykluczenia infekcji lub niedokrwistości, a także test białka C-reaktywnego w celu wykluczenia stanu zapalnego u dawcy.

1. Pobieranie krwi obwodowej i pobieranie pakietu erytrocytów i leukocytów

  1. Pobrać 10 ml krwi obwodowej przez nakłucie dożylne w probówkach z 1,8 mg/ml K2·EDTA jako antykoagulantem (patrz tabela materiałów) od klinicznie zdrowych osób po uzyskaniu świadomej zgody. Następnie wykonaj standardową biometrię krwi i test białka C-reaktywnego, aby wykluczyć infekcję lub stan zapalny, zapewniając jakość próbki.
  2. Odwirować próbkę krwi obwodowej o masie 82 x g przez 15 minut w celu usunięcia osocza bogatopłytkowego, a następnie odwirować drugą próbkę przy 630 x g przez 5 minut. Odrzucić pozostałe osocze w celu uzyskania pakietu erytrocytów i leukocytów.
  3. Rozcieńczyć go w stosunku 1:1 (v/v) z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.

2. Oczyszczanie wielojądrzastych neutrofili (PMN) przy użyciu gradientu o podwójnej gęstości

UWAGA: Wykonaj oczyszczanie neutrofili natychmiast po pobraniu krwi, ponieważ mają one ograniczony czas życia in vitro wynoszący około 8 godzin.

  1. Umieść następujące elementy w sterylnej szklanej probówce o pojemności 10 ml (patrz tabela materiałów) w kolejności: 1 ml roztworu o gęstości 1,098 g/mL, 1 ml roztworu o gęstości 1,079 g/ml (patrz Tabela materiałów), a następnie 4 ml rozcieńczonego pakietu erytrocytów i leukocytów. Wylej na ścianki bez naruszania napięcia powierzchniowego między warstwami, aby zapobiec ich mieszaniu.
  2. Wirować przy 320 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, unikając przyspieszania/zwalniania, tak aby duże siły działające na wirówkę nie zakłócały gradientu.
  3. Odessać fazę odpowiadającą granulocytom (Rysunek 1A) przez pipetowanie i przenieść do innej sterylnej szklanej probówki o pojemności 10 ml. Płukać 4 ml 1x DPBS o stężeniu 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzuć supernatant i potraktuj komórki wstrząsem osmotycznym w celu usunięcia pozostałych erytrocytów. Dodać 4 ml 0,2% roztworu soli fizjologicznej przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Następnie dodać 4 ml roztworu izotonicznego (0,65% soli fizjologicznej) przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu przywrócenia integralności membrany i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: 0,2% roztwór soli fizjologicznej jest podłożem hipotonicznym, o niższym stężeniu substancji rozpuszczonej w stosunku do pożywki wewnątrzkomórkowej RBC. Kontakt z podłożem hipotonicznym umożliwia dyfuzję wody do erytrocytów, co prowadzi do ich obrzęku i hemolizy. To usunięcie erytrocytów czerwonych z supernatantu zostało potwierdzone obserwacją mikroskopową.
  5. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml 1x DPBS w celu usunięcia resztek komórkowych, a następnie odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec ponownie zawieś osad komórkowy w 2 ml zimnego buforu zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).

3. Morfologia i żywotność neutrofili (Rysunek 1B)

  1. Test wykluczenia błękitu trypanowego
    1. Rozcieńczyć 5 μl zawiesiny komórek w 20 μl 0,4% błękitu trypanowego (stosunek 1:5). Policz komórki w komorze Neubauera i określ żywotność komórek za pomocą testu wykluczającego. Rozważ komórki, które utrzymują integralność swojej błony bez przepuszczalności barwnika, jako żywotne.
    2. Umieścić 5 μl zawiesiny komórek na szkiełku; wysuszyć i zabarwić barwnikiem Wrighta przez 15 s. Natychmiast utrwalić próbkę buforem fosforanowym o pH 6,4 przez 30 s. Przemyć wystarczającą ilością wody destylowanej i obserwować morfologię pod mikroskopem optycznym (100x).
  2. Barwienie 7AAD i analiza cytometrii przepływowej
    1. Dodać 1 x 105 komórek do probówek cytometrii przepływowej i zabarwić 1 μl 7AAD w 100 μl buforu FACS (1x DPBS, 0,1% azydek sodu i 10% autologiczne osocze zdekomplementowane) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    2. Przemyć 500 μl buforu FACS o stężeniu 300 x g przez 10 min. Utrwalić komórki 500 μl 2% paraformaldehydu i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich analizy w cytometrze przepływowym.
    3. W celu kontroli martwych komórek należy przymocować 1 x 105 komórek 200 μl 4% paraformaldehydu przez 30 minut i przemyć 500 μl 1x PBS przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odciągnąć sklarowany osad i wyrzucić. Następnie dodać 200 μL 0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przemyć 500 μL 1x PBS i zabarwić 7AAD jak w kroku 3.2.1.
    4. Za pomocą cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów) wykonaj analizę FSC w porównaniu z SSC, aby przeanalizować czystość komórek oraz barwienie SSC w porównaniu z 7AAD, aby przeanalizować żywotność komórek. Odczyt 3 x 104 zdarzeń w 100 μl objętości wychwytu przy średnim przepływie (1,000 komórek/s) w ustawieniach wielojądrowych (FSC, 400-490 i SSC, 300-320).
    5. Przeanalizuj przechwycone dane w oprogramowaniu cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów) i określ procent czystości i dodatnich komórek dla 7AAD w populacji wielojądrzastych, przedstawionych za pomocą wykresów kropkowych i histogramów.

4. Barwienie mikroorganizmów metodą CFSE

  1. Dodaj 1 x 108 bakterii lub 1 x 106 pseudostrzępek grzybów w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml i zabarwić 200 μl 5 μM estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) rozpuszczonego w 1x PBS. Mieszać przez kilka sekund i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut w ciemności.
  2. Zatrzymać reakcję, dodając 500 μl odkomplementowanego osocza i odwirować przy 620 x g przez 10 minut w przypadku pseudostrzępek lub przy 1 800 x g przez 10 minut w przypadku bakterii.
  3. Odrzucić sklarowane osady i przemyć ich granulki 1 ml 1x PBS z odwirowaniem, jak w kroku 4.2. Na koniec ponownie zawieś mikroorganizmy w 250 μl 1x PBS.
  4. Przygotować 50 μl podwielokrotności w mikroprobówkach po 1,5 ml z 2 x 107 bakteriami (MOI: 100) lub 2 x 105 pseudostrzępkami (MOI: 1) do indukcji NET.

5. Indukcja NET

  1. Umieścić szkiełka nakrywkowe ze sterylnego szkła o wymiarach 10 mm x 10 mm na płytce 24-dołkowej i zalać 10 μl 0,001% poli-L-lizyny na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć dwukrotnie 100 μL 1x PBS, wysuszyć na powietrzu i naświetlić światłem UV przez 15 min.
  2. Zastąp roztwór HBSS zawiesiny neutrofili w kroku 2.5 pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% osoczem autologicznym. Do płytki 24-dołkowej (etap 5.1) dodać 350 μl zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 105 neutrofili/basenik.
  3. Pozostawić komórki do przylegania do dna studzienek poprzez inkubację przez 20 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  4. Dodaj bodźce do indukowania tworzenia NET w 50 μl: bodźce mikrobiologiczne - bakteria Gram-dodatnia S. aureus (ATCC 25923), bakteria Gram-ujemna P. aeruginosa (ATCC 10145) w MOI 100 i pseudostrzępki C. albicans (ATCC 10231) w MOI: 1; bodźce biochemiczne - PMA (200 nM) i HOCl (4,5 mM) oraz kontrola z brakiem bodźca (50 μL HBSS).
  5. Uzyskać końcową objętość 400 μl na studzienkę. Mieszać na wytrząsarce płytkowej z prędkością 140 obr./min przez 30 s i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5%CO2.

6. Wizualizacja NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Barwienie immunologiczne DNA i LL37
    1. Po indukcji NET usunąć supernatanty ze studzienek, ostrożnie pipetując, i utrwalić komórki 300 μl 4% paraformaldehydu przez 30 minut.
    2. Przemyć komórki 200 μl 1x PBS bez wirowania i dodać 200 μl buforu blokującego (10% zdekomplementowanego osocza w 1x PBS) przez 30 min.
    3. W przypadku barwienia LL-37 należy przeniknąć do komórek za pomocą 200 μl 0,2% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut, aby umożliwić przeciwciało wniknięcie do komórek. Umyj 2x dokładnie 1x PBS, aby usunąć nadmiar detergentu.
    4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych (cztery szkiełka nakrywkowe na każdym szkiełku). DNA wybarwić komórki 2 μl DAPI (patrz Tabela Materiałów), uszczelnić szkiełka nakrywkowe i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ich analizy za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Akwizycja i analiza obrazów fluorescencyjnych
    1. Wykonaj obrazy NET, aby określić ilościowo ich składniki, a następnie użyj odpowiednich filtrów w konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów), aby uzyskać obrazy za pomocą oprogramowania komputerowego.
      UWAGA: Weź pod uwagę, że DNA jest barwione DAPI (kolor niebieski), wykazując wzbudzenie przy 360 nm i emisję przy 460 nm. Mikroorganizmy są barwione CFSE (kolor zielony), który ma wzbudzenie 492 nm i emisję 521 nm. Peptyd LL37 jest znakowany przeciwciałem anty-LL37 Alexa Fluor 594 (kolor czerwony), które ma wzbudzenie 594 nm i emisję 614 nm.
    2. Skalibruj mikroskop. Umieść slajd i ustaw ostrość za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) przy włączonym normalnym świetle. Wybierz opcję Na żywo, aby wyświetlić obraz na monitorze.
    3. Wyłącz światło i wybierz odpowiedni kanał fluorochromowy. Na przykład wybierz filtr 365 nm/niebieski dla DAPI, 43 HE DsRed dla Alexa 594 lub 38 HE GFP dla CFSE.
    4. Dostosuj ustawienia za pomocą przeciwciała kontrolnego izotypu dla LL37 i niebarwionych komórek dla DAPI i CFSE. Ustaw ten sam czas ekspozycji, napięcie, kontrast i ustawienia obiektywu, aby uchwycić wszystkie obrazy w tych samych warunkach.
      UWAGA: W tym badaniu czas ekspozycji, napięcie i kontrast zostały ustawione odpowiednio na 1,0 ms, 4,0 V i 0,0 przy obiektywie 40x. Wartości te można dostosować, aby ułatwić jak najlepsze uchwycenie obrazu dla próbek.
    5. Wybierz opcję Przyciągaj, aby przechwycić obraz. Zapisz pięć obrazów (cztery skrajności i środek) na studzienkę oraz kolokalizacji (łączenia) DNA/LL37/CFSE.
    6. Zdefiniuj trzy klasy pikseli jako tło z niezależnymi obrazami każdego koloru i przeanalizuj wartość średniego sygnału szarości na obszar za pomocą oprogramowania Image J.

7. Kwantyfikacja aktywności enzymatycznej

  1. Na 96-dołkowej płytce dodać 90 μl zawiesiny komórek w HBSS zawierającej 1 x 105 neutrofili do indukcji NET i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Natychmiast dodać 10 μl odpowiednich bodźców (stężenie jak w kroku 5.4) i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Odrzucić supernatanty i przemyć komórki 100 μl HBSS. Traktować 1 U/ml DNazy przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby sprzyjać uwalnianiu struktur DNA-białka, i wirować przy 1,800 x g przez 10 minut.
  4. Odzyskaj supernatanty i oceń aktywność enzymatyczną w supernatancie za pomocą reakcji kolorymetrycznych, jak wcześniej opisano przez White et al.17.
  5. Określić maksymalną aktywność enzymatyczną NE, CG i MPO w neutrofilach w tych samych warunkach eksperymentalnych bez dodawania jakichkolwiek bodźców do indukcji NET. Następnie zamrozić próbkę komórek w temperaturze -70 °C i rozmrozić w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, generując szok temperaturowy, aby sprzyjać uwalnianiu białek wewnątrzkomórkowych w procesie lizy komórek. Wirować przy 1 800 x g przez 10 minut i odzyskać supernatanty.
  6. Dodać 50 μl supernatantu do każdej studzienki na płytkach 96-dołkowych, a następnie dodać 50 μl każdego substratu, jak wskazano w kroku 7.7.
  7. Dodać 0,5 M N-metoksysukcynylo-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroaniliny jako substrat dla NE, i 1 mM N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidu dla CG. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. W przypadku MPO dodać 1,6 mM 3,3', 5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Po inkubacji dodać 50 μl roztworu zatrzymającego (0,5 M H2SO4) dla MPO i zmierzyć absorbancję przy 405 nm dla NE i CG oraz 450 nm dla MPO, używając spektrofotometru.
  9. Porównaj uzyskane wartości z odpowiednimi krzywymi kalibracyjnymi i pokaż wyniki każdego warunku w odniesieniu do maksymalnej aktywności enzymu (100%).

8. Analiza statystyczna

  1. Przeanalizuj dane pomiarowe w trzech egzemplarzach dla każdego niezależnego eksperymentu (n = 10) i wykonaj ANOVA do analizy statystycznej, porównując grupy o poziomie ufności 95%.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Oczyszczanie PMN i protokół indukcji NET. (A) Osocze zostało usunięte z krwi obwodowej w celu uzyskania pakietu erytrocytów i leukocytów i rozcieńczone w stosunku 1:1 (v/v) 1x DPBS. Następnie 4 ml rozcieńczenia dodano wzdłuż ścianki do probówki gradientowej o podwójnej gęstości i odwirowano przy 320 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, uzyskując oddzielenie różnych warstw komórek i odzyskując jedną odpowiadającą PMN. (B) Oczyszczone komórki zostały policzone, a ich morfologia została przeanalizowana przez barwienie Wrighta. Żywotność określono przez wykluczenie błękitu trypanowego i barwienie 7AAD za pomocą cytometrii przepływowej. Po zweryfikowaniu optymalnej czystości i żywotności neutrofili, tworzenie NET indukowano przez dodanie drobnoustrojów (S. aureus, P. aeruginosa i C. albicans) lub chemikaliów (PMA, HOCl) do 24-dołkowych płytek do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z DAPI-DNA, anty-LL37 Alexa Fluor 594 i barwienia mikroorganizmami-CFSE. W celu ilościowego oznaczania enzymów NET indukowano na 96-dołkowych płytkach przez 3 godziny i traktowano DNazą, a następnie dodano substraty dla każdego enzymu: NE, CG i MPO; Zmiany koloru określono ilościowo za pomocą spektrofotometrii. DPBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco; PBMC = komórki jednojądrzaste krwi obwodowej; PMN = neutrofile wielojądrzaste; NE = elastaza neutrofilowa; CG = katepsyna G; MPO = mieloperoksydaza; PMA = octan mirystynianu forbolu; HOCl = Kwas podchlorawy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czystość i żywotność neutrofili
Dynamiczne fazy komórkowe są wizualizowane w probówce z oczyszczania gradientowego o podwójnej gęstości. W obrębie tych warstw warstwa odpowiadająca granulocytom znajduje się powyżej warstwy o gęstości 1,079 g / ml, w odróżnieniu od faz mononukleocytów krwi obwodowej (PBMC) i erytrocytów (Figura 1A). Morfologia oczyszczonych komórek została zweryfikowana za pomocą barwienia Wrighta, obserwując komórki z segmentowanymi jądrami połączonymi nitkowatymi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby indukować uwalnianie NET, należy uzyskać wysoce czystą populację żywotnych neutrofili, ponieważ komórki te mają ograniczony czas życia ex vivo , wynoszący średnio 8 godzin, w którym należy przeprowadzić wszystkie eksperymenty. W tym celu idealną metodologią jest gradient podwójnej gęstości w celu optymalizacji czasu oczyszczania poprzez izolację nieaktywowanych komórek bardziej wrażliwych na stymulację egzogenną, w przeciwieństwie do gradientu Ficoll-Histopaque lub technik sedymentacji dekstranu

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z zakresu nauk podstawowych (#285480) od CONACyT oraz przez Wydział Klinicznych Badań Immunologicznych Wydziału Nauk Biochemicznych, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L i W.J.R.R. mają stypendia doktorskie o numerach CONACyT odpowiednio #799779, #660793 i #827788.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka 24-dołkowa do hodowli komórkowychCorning3526
7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)BD Pharmingen51-668981E
96 Płytka studzienkowa do hodowli komórkowychCostar3596Mieszadło z płaskim dnem
CRM GlobeCRM-OS1
Przeciwciało LL37Santa Cruz Biotechnologysc-166770
Krew probówki zbiorczeBD VACUTAINER368171K2 EDTA 7,2 mg
Karboksyfluoresceina ester sukcynimidylowy (CFSE)Sigma-Aldrich21878
WirówkaHettich1406-01
Szkiełko nakrywkoweMadesaM03-CUB-22X2222 mm x 22 mm
Dulbecco´ s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Keson1201022
probówki Falcon 50 mlProbówki
Miltenyi Biotec5 ml - bez nasadek
Oprogramowanie FlowJoBD BiosciencesAnaliza danych cytometrii
Mikroskop fluorescencyjnyDM 2000LEICA
Fluoroshield z DAPIInkubator Sigma-AldrichF6057
NUAIREUN-4750
MACSQuant AnalizatorMiltenyi BiotecCytometr przepływowy
Czytnik mikropłytek FotometrClarkson Laboratory - CL
Mikroprobówki 1,5 mlZhejiang Runlab Tech35200Nzatrzask drutowy
Minitab OprogramowanieMinitabanaliza statystyczna
IgłyBD VACUTAINER301746Średnica 1,34 mm
Mikroskop optycznyVELABVE-B50
PercollGE Healthcare17-0891-01Roztwór do gradientu gęstości
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)KesonPBL07-500ML
Probówki hodowlane PyrexCORNINGCLS982025N° 9820
RPMI 1640 1xCorning10-104-CVzawiera Glutagro
SlidesMadesaPDI25755022 mm x 75 mm
Trypan Blue roztwór 0,4%SIGMAT8154-100ML
do cytometrii przepływowej CORNING 430829 przepływowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).
  2. Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
  3. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437(2017).
  6. Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853(2022).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81(2017).
  9. Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946(2019).
  10. Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
  11. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  12. Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494(2021).
  13. Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
  14. Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
  15. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  16. Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
  17. White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
  18. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  19. Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
  20. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neutrophil Extracellular TrapsNET MorphologyNET CompositionMicrobial StimulationChemical StimulationDouble Density GradientFlow CytometryFluorescence MicroscopyDNA Protein StructuresNeutrophil Elastase

Related Articles