Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64526

⸱

16 grudnia 2022

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Streszczenie

Napływ wapnia w odpowiedzi na stymulację receptora limfocytów T jest powszechną miarą sygnalizacji komórek T. Opracowano kilka barwników wskaźnikowych wapnia do oceny sygnalizacji wapniowej za pomocą cytometrii przepływowej pasmowo-przepustowej. Protokół ten ma na celu pomiar odpowiedzi wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T przy użyciu cytometrii przepływowej o pełnym spektrum. Całkowite splenocyty są znakowane ratiometrycznym barwnikiem wskaźnikowym wapnia Indo-1 wraz z panelem przeciwciał sprzężonych z fluorochromem do cząsteczek na powierzchni komórki. Wykorzystanie możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum stanowi platformę do wykorzystania szerokiej gamy barwień powierzchni komórek w połączeniu z Indo-1. Komórki są następnie analizowane w czasie rzeczywistym w temperaturze 37 °C przed i po dodaniu przeciwciała anty-CD3 w celu stymulacji receptora limfocytów T. Po rozmieszaniu sygnałów spektralnych oblicza się stosunek Indo-1 związanego z wapniem do bezwapniowego i można go wizualizować w czasie dla każdej bramkowanej populacji splenocytów. Technika ta może pozwolić na jednoczesną analizę odpowiedzi wapnia w wielu populacjach komórek.

Wprowadzenie

Napływ wapnia wywołany receptorem limfocytów T (TCR) jest użytecznym miernikiem aktywacji limfocytów T i jest często używany do określenia, czy populacja limfocytów T ma upośledzone odpowiedzi w proksymalnych krokach szlaku sygnałowego TCR1. Pomiary napływu wapnia są zazwyczaj wykonywane przez wstępne znakowanie limfocytów T jednym lub parą fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych wapnia, a następnie badanie sygnałów fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym po usieciowaniu TCR2,3,4. Indo-1, barwnik wapniowy o stosunku metrycznym, jest wzbudzany przez laser UV z pikowymi emisjami na dwóch różnych długościach fal w zależności od wiązania wapnia5, i jest powszechnie stosowanym barwnikiem wskaźnikowym do analizy cytometrii przepływowej odpowiedzi wapnia w żywych limfocytach. Ponieważ profil emisji Indo-1 jest dość szeroki, połączenie oceny Indo-1 z jednoczesną analizą wielu markerów powierzchniowych komórek za pomocą cytometrii przepływowej pasmowo-przepustowej może być trudne. Ograniczenie to ogranicza wykorzystanie analizy cytometrii przepływowej odpowiedzi wapnia na wstępnie oczyszczone populacje limfocytów T lub do populacji zidentyfikowanych przez ograniczony zestaw cząsteczek na powierzchni komórki.

Aby rozwiązać problemy z pomiarem odpowiedzi wapnia w heterogenicznych populacjach pierwotnych limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej pasmowo-przepustowej, opracowano protokół pomiaru fluorescencji Indo-1 za pomocą cytometrii przepływowej o pełnym spektrum. Metoda ta pozwala na multipleksowanie Indo-1 panelami przeciwciał skierowanych na cząsteczki powierzchniowe komórki, wykorzystując wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej o pełnym spektrum. Zaletą stosowania cytometrii przepływowej o pełnym spektrum w porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową jest jej zdolność do odróżniania sygnałów fluorescencyjnych od silnie nakładających się barwników, zwiększając w ten sposób liczbę markerów powierzchniowych, które można jednocześnie ocenić w każdej próbce. Konwencjonalna cytometria przepływowa wykorzystuje filtry pasmowoprzepustowe i jest ograniczona do jednego fluorochromu na system detektorów6. Cytometria przepływowa o pełnym spektrum zbiera sygnały w całym spektrum fluorochromu za pomocą 64 detektorów w systemie pięciolaserowej spektralnej cytometrii przepływowej7,8. Ponadto cytometria przepływowa o pełnym spektrum wykorzystuje detektory APD (Avalanche Photo Diode), które mają zwiększoną czułość w stosunku do detektorów fotopowielaczy obecnych w konwencjonalnych cytometrach przepływowych8. W związku z tym podejście to jest idealne dla heterogenicznych populacji komórek, takich jak komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub zawiesiny mysich wtórnych komórek narządów limfatycznych, ponieważ eliminuje potrzebę izolacji określonych populacji komórek T przed znakowaniem barwnikiem wapniowym. Zamiast tego profile ekspresji markerów powierzchniowych komórek i bramkowanie cytometrii przepływowej po zebraniu danych mogą być wykorzystane do oceny odpowiedzi wapnia w każdej populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Jak wykazano w tym raporcie, Indo-1 można łatwo połączyć z ośmioma przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem, co daje w sumie 10 unikalnych sygnatur spektralnych. Co więcej, metoda ta może być łatwo zastosowana do mieszanin komórek z genetycznie odmiennych linii myszy, co pozwala na jednoczesną analizę odpowiedzi wapnia w limfocytach T typu dzikiego w porównaniu z komórkami z linii myszy ukierunkowanej na gen.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy były utrzymywane na kampusie medycznym Anschutz Uniwersytetu Kolorado zgodnie z protokołami IACUC. Wszystkie myszy zostały poddane eutanazji zgodnie ze standardami AAALAC.

1. Przygotowanie komórek odpornościowych ze śledziony myszy

UWAGA: Eutanazja naiwnych myszy za pomocą eutanazji CO2. Myszy C57BL/6 zakupione w Jackson Laboratories i wyhodowane we własnym zakresie są używane do eksperymentów w wieku 6-12 tygodni. Do eksperymentów wykorzystuje się zarówno samce, jak i samice myszy.

  1. Zdezynfekuj skórę myszy 70% etanolem, aby zmniejszyć możliwość przedostania się zanieczyszczeń zewnętrznych do próbki.
  2. Wypreparuj śledzionę myszy za pomocą narzędzi preparacyjnych, nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Zbierz śledzionę i umieść oderwaną śledzionę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z ~5 ml kompletnej pożywki RPMI (cRPMI) na lodzie.
    UWAGA: Complete RPMI składa się z 10% FBS, 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny.
    1. Aby zebrać śledzionę myszy, wykonaj nożyczkami 5-centymetrowe nacięcie w futrze i skórze wzdłuż lewej strony myszy w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami. Otwórz jamę ciała ~5 cm i usuń śledzionę za pomocą kleszczy. Śledziona ma kolor fasoli i jest dłuższa i bardziej płaska niż sąsiednia nerka.
  3. Wlać zawartość kroku 1.2 na sterylny filtr 70 μm podłączony do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Mechanicznie oddzielić śledzionę do zawiesiny jednokomórkowej, przepychając śledzionę przez filtr za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml, aż na powierzchni filtra nie pozostanie miazga
    4. śledziony.
  4. Osadzanie splenocytów za pomocą wirówki nablatowej z odchylanym wirnikiem o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie zdekantować supernatant. Granulowane splenocyty pozostają na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Aby usunąć czerwone krwinki, ponownie zawiesić granulowane splenocyty w 1 ml buforu do lizy ACK na 3 minuty zgodnie z instrukcjami producenta. Dobrze wymieszaj.
  7. Ugasić bufor do lizy ACK za pomocą 15 ml cRPMI.
  8. Osadzać limfocyty zgodnie z zaleceniami w kroku 1.4.
  9. Ponownie zawiesić zawiesinę komórek w 5 ml cRPMI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umieścić próbki na lodzie.
    1. Aby policzyć komórki, przenieś 10 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml i rozcieńcz w stosunku 1:1 roztworem błękitu trypanowego. Następnie przenieś do hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek.
  10. Po zliczeniu, w zależności od stężenia komórek w zawiesinie komórek, jak w kroku 1.9, zagnieździć komórki w wirówce stołowej o sile 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby przygotować się do dodania pożywki cRMPI zawierającej barwnik estrowy Indo-1 AM.
  11. Obliczyć objętość do ponownego zawieszenia komórek, aby uzyskać 10-12 x 106 komórek/ml. Jest to stężenie 2x całkowitej wymaganej liczby komórek.
  12. Ponownie zawieś komórki w objętości cRPMI obliczonej w kroku 1.11. Umieścić komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z odpowietrzoną pokrywką lub na płytce do hodowli tkankowej.

2. Znakowanie barwnikiem ratiometrycznym Indo-1 i przeciwciałami fluorescencyjnymi

  1. Zgodnie z instrukcjami producenta, dodać 50 μL DMSO do fiolki zawierającej 50 μg Indo-1 AM. Stężenie roztworu podstawowego wynosi 1 μg/μL.
    UWAGA: DMSO jest dostarczany w mikrofiolkach z zestawem, aby zapobiec utlenianiu DMSO.
  2. Rozcieńczyć podwielokrotność podstawową (1 μg/μl) do odpowiedniej objętości doświadczalnej (ustalonej w ppkt 1.11) cRPMI w stężeniu 6 μg/ml, co daje stężenie 2x. Nie przechowywać Indo-1 w roztworze wodnym.
    UWAGA: Inne z dodatkiem wapnia mogą być stosowane w zależności od potrzeb komórki.
  3. Odstawić całe podłoża z Indo-1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Użyj minimalnego stężenia estru Indo-1 AM niezbędnego do uzyskania odpowiedniego sygnału. Musi to być miareczkowane dla różnych typów komórek. Zazwyczaj wystarczające jest stężenie między 3-5 μM. W przypadku pierwotnych limfocytów T obciążenie komórek Indo-1 w stężeniu >5 μg/ml zwiększa średnią intensywność fluorescencji (MFI) powyżej logarytmu 6 na spektralnych cytometrach przepływowych. W takim przypadku należy zmniejszyć intensywność lasera UV i miareczkować Indo-1 do niższego stężenia.
  4. Rozcieńczyć wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek (w kroku 1.12) w stosunku 1:1 w cRPMI, w tym 2x pożywki Indo-1 wykonane w kroku 2.2. Upewnij się, że komórki mają stężenie 5-6 x 106/ml.
    UWAGA: Nie należy farbować niezabarwionych pojedynczych plam kontrolnych lub znaczników powierzchniowych pojedynczych komórek barwienia Indo-1. Dodanie Indo-1 do kontroli przeciwciał z pojedynczym barwnikiem spowoduje utworzenie wielokolorowej próbki ze względu na Indo-1 dodany do pojedynczych barwionych komórek. Dołączyć kontrolę z dodatkiem INDO-1 (bezwapniowego) EGTA do płytki próbki utworzonej w kroku 2.6.
  5. Dodać 1 ml komórek/dołka/warunków eksperymentalnych do 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  6. Utworzyć pojedynczą barwioną kontrolę dla próbki Indo-1 (bezwapniowej) przy użyciu wcześniej komórek obciążonych barwnikiem Indo-1 i dodać EGTA do końcowego stężenia 2 mM. EGTA chelatuje wapń w zawiesinie komórkowej, dając czystszą próbkę kontrolną.
    1. Utworzyć kontrolę pozytywną Indo-1 (Indo-1 związaną z wapniem), dodając 50 μM jonomycyny do zawiesiny komórek obciążonej barwnikiem na cytometrze przepływowym. Jonomycyna to przepuszczalny przez błonę jonofor wapnia, który wiąże jony wapnia i ułatwia przenoszenie jonów wapnia do komórek.
  7. Stwórz studnię do biologicznej kontroli negatywnej bez fluoroforów i barwnika Indo-1.
  8. Utwórz studzienkę do kontroli pojedynczego barwienia dla wszelkich dodatkowych populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania (przeciwciała zdefiniowane przez użytkownika) przy użyciu fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami w projekcie panelu cytometrii przepływowej. Nie będą one zawierały barwnika ratiometrycznego Indo-1.
  9. Dodaj przeciwciało blokujące receptor Fc (~2 μg/1 x 106 komórek), zgodnie z instrukcjami producenta, przed dodaniem dodatkowych przeciwciał sprzężonych z fluorochromem do barwienia powierzchniowego.
  10. Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  11. Ponownie zawiesić komórki na płytce 12-dołkowej, delikatnie stukając w płytkę co 15 minut.
  12. Wymieszać i usunąć całą objętość komórek zawieszonych w pożywce z płytki 12-dołkowej. Następnie dodać zawiesinę komórkową do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
  13. Granulować komórki w mikrowirówce o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant i przemyć komórki, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego cRPMI. Ponownie zagnieździć osad i zdekantować supernatant.
    UWAGA: Mycie komórek usuwa wszelkie pozostałe przeciwciała blokujące FC.
  14. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml cRPMI w 1,7 ml probówkach mikrowirówek i inkubować każdą probówkę w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 30 minut przy 5% CO2 , pozostawiając górną część probówki lekko otwartą, aby umożliwić wymianę gazową. Pozwala to na całkowitą deestryfikację wewnątrzkomórkowych estrów AM.
  15. W razie potrzeby przenieś komórki z powrotem na 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej. W fazie spoczynku można dodać dodatkowe, zdefiniowane przez użytkownika miareczkowane przeciwciała sprzężone z fluorochromem.
    UWAGA: Markery używane w panelu metod to: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 i tetramer CD1d/α-galcer. Markery są wybierane do analizy podzbiorów limfocytów T.
    1. Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml należy utworzyć główną mieszaninę wszystkich zdefiniowanych przez użytkownika przeciwciał sprzężonych z fluorochromem zgodnie z interesującymi typami komórek przy uprzednio miareczkowanej objętości.
    2. Dodać obliczoną mieszaninę wzorcową na 1 ml objętości komórki, w zależności od miareczkowanych przeciwciał skierowanych do komórek w stanie spoczynku.
      UWAGA: Zaletą barwienia w kroku 2.15 zamiast późniejszego kroku 2.18 jest to, że barwienie w kroku 2.15 skróci całkowity czas inkubacji w eksperymencie. Jednak barwienie w całkowitej objętości 1 ml na kroku 2.15 zwiększa użycie przeciwciał.
  16. Po odpoczynku granulować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Komórki na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej można granulować na płytce za pomocą wirówki płytkowej. W przeciwnym razie umieść komórki w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
  17. Umyć ogniwa poprzez ponowne zawieszenie osadu w 1 ml zimnego cRPMI o temperaturze 4 °C i ponownie zagnieździć ogniwa, jak w kroku 2.16. Umieść komórki na lodzie.
    UWAGA: W przypadku oddzielnego barwienia powierzchni komórek, po deestryfikacji w kroku 2.18, potrzebna jest mniejsza objętość przeciwciała. Barwienie powierzchni na tym etapie można przeprowadzić po fazie spoczynku w buforze zimnego przepływu (1x DPBS z dodatkiem 1% FBS), przy użyciu przeciwciał zdefiniowanych przez użytkownika, na lodzie przez 30 min. Umyj ogniwa po barwieniu w cRPMI, jak w kroku 2.17.
    1. Dodać do próbek barwnik żywotności Ghost540 rozcieńczony w stosunku 1:7,500 w DPBS zgodnie z instrukcjami producenta. Ciepło zabija komórki w temperaturze 55 °C na bloku grzewczym w celu pojedynczej barwionej kontroli żywej/martwej.
      UWAGA: Funkcjonalne barwienie barwnikiem w celu wyeliminowania martwych komórek w analizie cytometrii przepływowej wykonuje się bez FBS. FBS może wchodzić w interakcje z barwnikami aminowymi zgodnie z instrukcjami producenta.
  18. Ponownie zawiesić poszczególne próbki w 500 μl cRPMI (bez czerwieni fenolowej) za pomocą rurki przepływowej z polistyrenu o pojemności 5 ml z nakrętką.
    UWAGA: Ogniwa można pozostawić w temperaturze 4 °C na okres do godziny.
  19. Ogrzać każdą probówkę o pojemności 5 ml zawierającą komórki, indywidualnie, do temperatury 37 °C, używając kąpieli perełkowej przez 7 minut przed analizą na cytometrze przepływowym, zachowując spójny czas między próbkami. Użyj timera.

3. Rurka do kąpieli z koralikami: utrzymywanie temperatury podczas analizy strumienia wapnia

  1. Dodać koraliki do kąpieli do małej łaźni wodnej, bez dodawania wody; podgrzać do temperatury 37 °C.
  2. Ostrożnie przeciąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml na pół, w miejscu oznaczenia 25 ml, żyletką; wyrzuć górną część probówki.
  3. Napełnij przepołowioną rurkę w 3/4 wysokości koralikami do kąpieli.
  4. Umieść rurkę utworzoną w kroku 3.2 w wannie perełkowej utworzonej w kroku 3.1. Doprowadzić rurkę i koraliki do temperatury 37 °C.
  5. Podłączyć kąpiel perełkową do gniazdka elektrycznego obok cytometru przepływowego, aby utrzymać temperaturę w ramach przygotowań do analizy próbki.
  6. Dodaj stożkowy stojak styropianowy o pojemności 50 ml, aby przytrzymać jedną probówkę, aby ustawić probówkę na miejscu podczas pracy na cytometrze przepływowym. Wyeliminuje to konieczność ręcznego przytrzymywania rury przez cały czas trwania analizy krzywej.

4. Pozyskiwanie napływu wapnia za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej

  1. Zaloguj się do oprogramowania cytometru przepływowego w analizatorze przepływu.
  2. Kliknij zakładkę Biblioteka, aby dodać znaczniki fluorescencyjne Indo-1 (związane z wapniem) i Indo-1 (bezwapniowe). Wybierz Fluorescencyjne tagi w menu oprogramowania po lewej stronie. Wybierz Laser UV w grupach znaczników fluorescencyjnych i kliknij +dodaj, aby dodać nazwę znacznika fluorescencyjnego (Indo-1 (związany z wapniem)/Indo-1 (bez wapnia)) do biblioteki. Wybierz długość fali wzbudzenia laserowego i długość fali emisji, a następnie kliknij Zapisz. Przejdź do konfiguracji eksperymentalnej.
    UWAGA: Indo-1 jest wzbudzany przez laser UV o długości fali 355 nm. Długość fali emisji Indo-1 (związanej z wapniem) wynosi 372 nm. Długość fali emisji Indo-1 (bez wapnia) wynosi 514 nm.
  3. Kliknij zakładkę Akwizycja. Otwórz/utwórz nowy eksperyment i dodaj do niego żądane znaczniki fluorescencyjne.
  4. Utwórz grupę odniesienia i nowe grupy próbek dla eksperymentu. W razie potrzeby należy oznaczyć zarówno próbki, jak i grupy odniesienia.
  5. Na karcie Pozyskania ustaw zdarzenia do zarejestrowania na maksimum: 10 000 000.
  6. Ustaw objętość zatrzymania na maksymalną objętość: 3 000 μL.
  7. Ustaw czas zatrzymania na maksymalny czas: 36 000 s.
  8. Uzyskaj pojedynczo barwione kontrolki dla zdefiniowanych sprzężonych przeciwciał zawartych w panelu wielokolorowym.
  9. Zdobądź pojedyncze barwione kontrole dla barwnika funkcjonalnego Indo-1.
    1. Dodać 50 μM jonomycyny do kontroli dodatniej Indo-1 związanej z wapniem. Wirować do mieszania. Dodaj rurkę przepływową do portu iniekcji próbki i kliknij przycisk Nagraj.
    2. Dodaj kontrolę ujemną Indo-1 bez wapnia do cytometru przepływowego i kliknij Nagraj. EGTA została dodana w kroku 2.6.
    3. Rozmieszaj pojedyncze poplamione kontrolki, klikając przycisk Rozmieszaj.
      UWAGA: Wszystkie pojedyncze barwione kontrole ze wszystkich sprzężonych przeciwciał i barwników funkcjonalnych muszą być zarejestrowane przed wymieszaniem próbek. Aby przycisk Unmix działał, wszystkie kontrolki referencyjne muszą zostać najpierw nagrane. Odmieszanie można wykonać przed lub po pobraniu próbki.
  10. Po zakończeniu rozmieszania utwórz wykresy sekwencyjne za pomocą niezmieszanego arkusza roboczego. SSC-A kontra FSC-A usuwanie zanieczyszczeń z próbki, SSC-A kontra SSC-H w celu usunięcia dubletów. Po tym następuje brama oczyszczania żywotności wraz z dalszym bramkowaniem na populacjach będących przedmiotem zainteresowania. Aby utworzyć bramy, kliknij Działka. Dodaj wykres do arkusza roboczego i kliknij dwukrotnie wewnątrz bramy, aby utworzyć podrzędną populację bramkowaną. Kontynuuj, aż wszystkie populacje będące przedmiotem zainteresowania zostaną uwzględnione.
  11. Ciepłe, pojedynczo barwione próbki kontrolne (od etapów 2.6-2.9 w sekcji Indo-1 proporcjonalne znakowanie barwnikiem i przeciwciałami fluorescencyjnymi) do temperatury 37 °C w celu analizy sekwencyjnej. Zainstaluj oprogramowanie do cytometrii przepływowej.
  12. Uruchom wodę DI na cytometrze przez 2-3 minuty, aby zapewnić stabilność płynną cytometru przepływowego.
  13. Skonfiguruj wykresy sekwencyjne w niemieszanym arkuszu, tworząc bramki za pomocą przycisków Bramka wielokątna, Prostokąt lub Elipsa. Bramka uwzględniająca populację będącą przedmiotem zainteresowania (tj. limfocyty wykorzystujące SSC-A vs. FSC-A [dyskryminacja rozmiaru/limfocytów]). Populacje ujemne wydają się skupione wokół zera, podczas gdy populacje pozytywne można zwizualizować poprzez zwiększenie MFI. Populacje będące przedmiotem zainteresowania zostaną zdefiniowane przez użytkownika na podstawie pytania biologicznego.
  14. Kliknij dwukrotnie wewnątrz utworzonej bramki i zmień parametry osi Y i osi X na SSC-A kontra SSC-H (dyskryminacja singletowa). Zakończ definiowanie parametrów osi, klikając lewym przyciskiem myszy słowa na osi.
  15. Utwórz wykres z SSC-A w funkcji sygnału barwnika żywotności (parametry bramki żywotności). Bramka na żywych komórkach, które są ujemne pod względem barwienia barwnikiem aminowym. Żywe komórki, ujemne dla barwienia żywych zmarłych, będą grupować się na znaku 0 zarówno na osi Y, jak i X.
  16. Kliknij dwukrotnie wykres wewnętrzny, aby utworzyć nowy wykres zawierający tylko żywe limfocyty jednokomórkowe. Zmień oś Y na Indo-1 (związany wapń) (V1) i/lub Indo-1 (wolny wapń) (V7) w funkcji czasu na osi X w celu wizualizacji napływu wapnia.
  17. Umieścić podgrzaną próbkę biologiczną na maszynie SIT i uruchomić próbki z prędkością 2,500-3,000 zdarzeń/s na pożywce, aby umożliwić wizualizację napływu wapnia w populacjach o ograniczonej liczbie komórek (np. iNKT).
    UWAGA: Poprzez ponowne zawieszenie komórek w stężeniu 1 x 106/ml, zdarzenia komórkowe zebrane przy średnim natężeniu przepływu powinny wynosić 2,500-3,000 zdarzeń/s. Zmniejsz natężenie przepływu pod kontrolą akwizycji, klikając menu rozwijane lub rozcieńcz próbkę, jeśli zawiesina komórek ma zwiększone stężenie. Prowadzenie próbek z dużym natężeniem przepływu może zwiększyć rozprzestrzenianie się sygnału z jednego fluoroforu do innych fluoroforów w panelu.
  18. Dodać następną probówkę do kąpieli perełkowej, aby ogrzać się do temperatury 37 °C.
  19. W Acquisition Control naciśnij Record, aby rejestrować początkowe dane przez 30 s w celu uzyskania podstawowego poziomu sygnalizacji wapniowej w próbce.
  20. W Kontroli pobierania kliknij Zatrzymaj i wyjmij probówkę z portu iniekcji próbki (SIP).
  21. Dodać 30 μg niesprzężonego anty-CD3 bezpośrednio do probówki z próbką, aby zainicjować napływ wapnia. Końcowe stężenie w probówce wynosi 60 μg/ml.
    UWAGA: Po dodaniu anty-CD3 nie ma etapu mycia.
  22. Umieść rurkę z powrotem na SIP maszyny tak szybko, jak to możliwe i naciśnij Record w oprogramowaniu.
  23. Rejestruj dane przez 7 minut, obserwując czas, jaki upłynął pod kontrolą akwizycji w oprogramowaniu, aby obserwować przebieg czasowy napływu wapnia w populacjach próbek.
  24. Po 7 minutach naciśnij Stop w oprogramowaniu i dodaj 1 μg/ml jonomycyny. Nagrywaj przez 30 sekund, aby uzyskać maksymalny sygnał wapnia w interesujących komórkach. Aby ograniczyć przenoszenie jonomycyny do następnej próbki, wykonaj dwa płukania SIT na urządzeniu między próbkami.
  25. Przejdź do następnej próbki i powtarzaj proces pracy, aż wszystkie próbki zostaną zebrane.
  26. Zapisz eksperyment i kliknij plik zip eksportu. Niezmieszane pliki (.fsc) są przesyłane do zewnętrznego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

5. Analiza krzywej wapniowej

  1. Korzystając z oprogramowania analitycznego6 do cytometrii przepływowej, przekształć sygnały fluorescencyjne Indo-1 na stosunek do poklatkowych pomiarów wapnia. Wyprowadź parametry na karcie narzędzi, wstawiając odniesienia Indo-1 (związany z wapniem)/Indo-1 (wolny wapń) za pomocą skali liniowej. Ustaw minimum na zero i maksimum zgodnie ze stosunkiem napływu wapnia, zwykle około 10. Maksymalny stosunek różni się w zależności od typu komórki i MIF Indo-1.
  2. Podświetl wybrany parametr. W obszarze Narzędzia dodaj analizę kinetyczną, aby wybrać parametr, klikając kartę Kinetyka. Ustawić oś Y jako pochodną.
  3. Wybierz MFI (średnia intensywność fluorescencyjna) w zakładce Kinetyka.
  4. W razie potrzeby dodaj wygładzanie gaussowskie. Aby dodać wygładzanie gaussowskie, wybierz opcję z rozwijanego menu statystyk w oprogramowaniu do analizy przepływu. Wygładzanie gaussowskie można dodać, aby wygładzić wizualizację krzywej napływu wapnia w analizie.
  5. Utwórz wiele zakresów dla statystyk wzdłuż przebiegu przepływu wapnia w czasie dla porównań biologicznych w próbkach.
  6. Przeciągnij próbki do edytora układu i dodaj statystyki zgodnie z potrzebami. Analiza statystyczna różni się w zależności od pytania biologicznego. Na potrzeby publikacji wiele powtórzeń jest analizowanych przy użyciu testu t lub ANOVA.
  7. Dla chwili analizy czasu ustaw bramkę na określony moment w czasie wzdłuż strumienia wapnia. Zbadaj żądane znaczniki powierzchni i bramę na interesującej populacji; następnie oceń dwuwymiarowy wykres kropkowy Indo-1 (bez wapnia) w porównaniu z Indo-1 (związany z wapniem) dla komórek bramkowanych w tym momencie w regionie czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat doświadczalny oceny odpowiedzi wapniowej w pierwotnych limfocytach T myszy z wykorzystaniem ratiometrycznego barwnika Indo-1 oraz multipleksowego barwienia powierzchniowego przedstawiono na Rysunku 1. Po pobraniu i przetworzeniu splenocytów mysich do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, komórki barwi się estrem Indo-1 AM oraz przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami w celu barwienia powierzchniowego. Po zakończeniu ładowania barwnika i barwienia przeciwciałami, próbki limfocytó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje zoptymalizowany test przeznaczony do pomiaru odpowiedzi wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T obciążonych miareczkowanym barwnikiem wskaźnikowym Indo-1 przy użyciu cytometrii przepływowejo pełnym spektrum 7,8. Zaletą wykonywania testów strumienia wapnia przy użyciu cytometrii przepływowej w pełnym spektrum jest możliwość multipleksowania markerów komórek powierzchniowych w połączeniu z oceną fluorescencji Indo-1. Cytometria przepływowa o ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Wielkie podziękowania dla naszych kolegów z Cytek za ciągłe dyskusje na temat pełnej analizy cytometrii spektralnej w oprogramowaniu Aurora i SpectroFlo. Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-dołkowe płytki z powłoką TCCell Treat229111
50 ml stożkowyGreiner Bio141-12-17-0350 ml polipropylenowe probówki wirówkowe z nasadką
5 ml probówki przepływowe z poliodoruCorning352052
strzykawka5 ml Strzykawka BD309646tylko tłokiem jest używana
Filtr 70uMGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC Bufor do lizyGibcoA1049201
Aurora Przepływocytometr spektralnyhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Koraliki do kąpielicoleparmerPozycja # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetramer APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Inkubator komórekFormalne naukowe
narzędzia do preparacji KleszczeMcKesson#487593Kleszcze do tkanek McKesson Adson 4-3/4 cala długości Klasa biurowa Niesterylny nieblokujący uchwyt kciuka ze stali nierdzewnej 1 x 2 zęby
Narzędzia do preparowania NożyczkiMcKesson#970135Nożyczki operacyjne McKesson Argent™ 4-1/2-calowy chirurgiczny uchwyt pierścieniowy ze stali nierdzewnej Prosta ostra końcówka / Ostra końcówka
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
EGTAFisherNC1280093
FBS HyclondSH30071.03lot AE29165301
FlowJo Softwarehttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dyeebioscience65-085-39Barwnik ładujący wapń 
jonomycynaMillipore407951-1mg
Żywy/martwy duch 540Tonbo13-0879-T100
Probówki do mikrowirówek 1,7 mlLight LabsA-7001
Penicylina/Streptomycyna/L-GlutaminaGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
Oczyszczony anty-mysz CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC Block
RPMIGibco1875093 + czerwień fenolowa
RPMI bez fenoliGibco11835030 -czerwień fenolowa
Wirówka stołowaBeckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Pakiet odczynników Vi-Cell Blu Nrproduktu: C06019Zawiera suchą
Vi-Cell BluBeckman Coulter
kąpiel Tripan Waterbath marki Fisher

Bibliografia

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Napływ wapnia do limfocytów Tbarwnik wskaźnikowy wapniabarwienie Indo-1stymulacja anty-CD3analiza przepływu wapniamarkery powierzchniowe komórekwielobarwna cytometria przepływowasubpopulacje limfocytów T
Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.