Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Technika chirurgiczna dla górnej ganglionektomii szyjki macicy w modelu mysim

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64527

⸱

2 grudnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, 3David M. Rubenstein Center for Pancreatic Cancer Research, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje mysi model ablacji unerwienia adrenergicznego poprzez identyfikację i resekcję górnego zwoju szyjnego.

Streszczenie

Coraz więcej dowodów sugeruje, że współczulny układ nerwowy odgrywa ważną rolę w rozwoju raka. Unerwienie adrenergiczne reguluje wydzielanie gruczołów ślinowych, rytm okołodobowy, zwyrodnienie plamki żółtej, funkcje odpornościowe i fizjologię serca. Sympatektomia chirurgiczna u myszy jest metodą badania skutków unerwienia adrenergicznego poprzez umożliwienie całkowitej, jednostronnej ablacji adrenergicznej przy jednoczesnym uniknięciu konieczności powtarzania interwencji farmakologicznej i związanych z nią skutków ubocznych. Jednak chirurgiczna sympatektomia u myszy jest technicznie trudna ze względu na mały rozmiar górnego zwoju szyjnego. W badaniu tym opisano technikę chirurgiczną służącą do niezawodnej identyfikacji i resekcji górnego zwoju szyjnego w celu ablacji współczulnego układu nerwowego. Pomyślna identyfikacja i usunięcie ganglionu są weryfikowane poprzez obrazowanie fluorescencyjnych zwojów współczulnych za pomocą myszy transgenicznej, identyfikację zespołu Hornera po resekcji, barwienie markerów adrenergicznych w wyciętych zwojach i obserwację zmniejszonej immunofluorescencji adrenergicznej w narządach docelowych po sympatektomii. Model ten umożliwia w przyszłości badania nad progresją nowotworu, a także innymi procesami fizjologicznymi regulowanymi przez współczulny układ nerwowy.

Wprowadzenie

Wiele badań wykazało, że nerwy w mikrośrodowisku guza odgrywają aktywną rolę we wspieraniu progresji guza. Wykazano, że ablacja adrenergicznych nerwów współczulnych upośledza rozwój i rozprzestrzenianie się guza w raku prostaty i żołądka in vivo1,2,3, podczas gdy farmakologiczna blokada receptorów adrenergicznych hamuje wzrost guza w raku głowy i szyi4. Współczulne zajęcie neuronów zostało również opisane w progresji raka trzustki, szyjki macicy i raka podstawnokomórkowego5,6,7.

W obrębie układu współczulnego, górny zwój szyjny (SCG) jest jedynym zwojem pnia współczulnego, który unerwia głowę. SCG reguluje różne funkcje fizjologiczne, takie jak wydzielanie śliny i rytm okołodobowy, a także bezpośrednio unerwia węzły chłonne szyjki macicy8,9,10. SCG jest również zaangażowany w procesy patologiczne, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej11 i postęp rozwarstwienia aorty12. Ponadto doniesiono, że resekcja SCG nasila ostre uszkodzenie nerek wywołane reperfuzją niedokrwienną13, a także zmienia mikrobiotę jelitową u szczurów14.

Całkowita ablacja SCG w modelu mysim stanowiłaby cenną technikę eksperymentalną umożliwiającą badania nad rakiem i autonomicznym układem nerwowym. Podczas gdy wiele badań wykorzystywało farmakologiczną blokadę receptora adrenergicznego jako ablację adrenergiczną15,16,17,18,19,20, resekcja chirurgiczna pozwala na pełną, jednostronną ablację adrenergiczną, unikając konieczności wielokrotnej interwencji farmakologicznej i związanej z nią strony effects21,22,23.

Chirurgiczna resekcja SCG została opisana w szczurach24, a większość raportów badających efekt górnej ganglionektomii szyjnej (SCGx) wykorzystuje model szczurzy. W porównaniu z modelem szczurzym, SCGx jest technicznie trudniejszy u myszy ze względu na mały rozmiar SCG. Jednak myszy są stosunkowo łatwiejsze w obsłudze, bardziej opłacalne i bardziej podatne na manipulacje genetyczne. Garcia i wsp. byli jednymi z pierwszych, którzy opisali SCGx u myszy i stwierdzono, że wpływa on na uwalnianie insuliny25. Niedawno Ziegler i in. opisali SCGx u myszy w oparciu o opublikowaną technikę opisaną dla szczurów24,26. Ten i inne artykuły opisują metodę, w której tętnica szyjna wspólna (CCA) jest najpierw identyfikowana i preparowana, a następnie SCG jest usuwana z rozwidlenia klasy CCA21,22,27,28. W tym artykule opisano mniej inwazyjną i bezpieczniejszą technikę u myszy, która pozwala uniknąć rozwarstwienia CCA, minimalizując w ten sposób najpoważniejsze powikłanie tej procedury – krwawienie z urazu CCA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Wykorzystano tu ośmiotygodniowe samce i samice myszy NSG. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Narzędzia są sterylizowane, dezynfekowana jest chirurgiczna powierzchnia robocza, dezynfekowana jest powierzchnia skóry zwierzęcia, a chirurg nosi sterylne rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu.

1. Przygotowanie myszy i przygotowanie przedoperacyjne

  1. W dniu poprzedzającym zabieg znieczulij mysz 2% izofluranem w komorze indukcyjnej (3,75 szerokości x 9 głębokości x 3,75 wysokości, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia uzyskuje się zwykle w ciągu 3-5 minut, w zależności od indywidualnego zwierzęcia. Ocenić adekwatność znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i w razie potrzeby zwiększyć zawartość procentową izofluranu.
    1. Ogol brzuszną część szyi lub użyj chemicznego środka do usuwania włosów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
  2. W dniu zabiegu znieczulić mysz 2% izofluranem w komorze indukcyjnej. Ocenić adekwatność znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i w razie potrzeby zwiększyć zawartość procentową izofluranu.
  3. Podawać 2 mg/kg meloksykamu podskórnie w celu prewencyjnego znieczulenia ogólnoustrojowego. Stosować miejscowo maść okulistyczną (patrz tabela materiałów), aby zapobiec urazom oczu i suchości w znieczuleniu.
  4. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym po jej grzbietowej stronie i zapewnij wsparcie termiczne. Utrzymuj znieczulenie wziewne za pomocą 2%-2,5% izofluranu za pomocą precyzyjnego waporyzatora i stożka na nos. Delikatnie zabezpiecz obie kończyny przednie hipoalergiczną taśmą (patrz Tabela materiałów).
  5. Ogoloną, brzuszną część szyi oczyść jodonem powidonu, a następnie przetrzyj 70% alkoholem. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy. Upewnij się, że pole operacyjne jest wolne od luźnych włosów.
    UWAGA: Można również użyć pary krótkich zakrzywionych kleszczy. Upewnij się, że używasz pary cienkich lub okulistycznych kleszczyków, aby odpowiednio pracować w tej ograniczonej przestrzeni. Dodatkowa konfiguracja przedoperacyjna może być dołączona zgodnie z wytycznymi instytucji.

2. Sekcja

  1. Wykonaj 1,5 cm nacięcie skóry w linii środkowej na brzusznej stronie szyi za pomocą małych nożyczek od około 2 mm poniżej podbródka do 2 mm powyżej wcięcia mostka.
  2. Cofnij krawędzie skóry na boki za pomocą kleszczy, aby odsłonić leżącą pod spodem powięź i ślinianki podżuchwowe. Oddziel skórę od leżącej pod spodem powięzi, wkładając spiczaste nożyczki pod skórę z każdej strony i rozprowadzając. Pociągnij gruczoły podżuchwowe doogonowo za pomocą kleszczy, aby odsłonić leżące poniżej mięśnie.
  3. Zlokalizuj połączenie tylnego brzucha mięśnia dwubrzuścowego i mięśnia omohyoidalnego (Rysunek 1A, czarne kółko). Przednia żyła szyjna biegnie podłużnie i bocznie do mięśnia omohyoidalnego.
    UWAGA: Mięsień omohyoidalny pokrywa tchawicę wzdłużnie, podczas gdy mięsień dwubrzuścowy leży poprzecznie w czaszkowym aspekcie tchawicy (Rysunek 1C).
    1. Włóż końcówkę kleszczy pod kątem 45° w tym skrzyżowaniu, bocznie do przedniej żyły szyjnej, aby przebić i rozprowadzić otwór w leżącej nad nim głębokiej powięzi szyjnej.
  4. Pozostaw to okno utworzone w kroku 2.3.1 otwarte za pomocą kleszczy ustawionych pod kątem 45°. Rozszerz ten otwór szerzej, wykonując manewry rozpierania z parą zakrzywionych kleszczy w drugiej ręce.

3. Identyfikacja i resekcja ganglionu

  1. Zlokalizuj górny ganglion szyjny (SCG) na bocznej ścianie odsłoniętej przestrzeni. Ma postać okrągłej, perłowej tkanki.
    UWAGA: Jeśli SCG nie zostanie zidentyfikowany, tkanki w tej przestrzeni muszą być zbadane bardziej bocznie i dokładniej. SCG można łatwo pomylić z tłuszczem, który często występuje w tym regionie. Tłuszcz ma lekko żółty odcień, podczas gdy SCG wydaje się perłowobiały.
  2. Drugą ręką podtrzymując otwór kleszczami, delikatnie chwyć SCG kleszkami i wyciągnij go z otworu, aby był lepiej widoczny.
  3. Gdy SCG znajdzie się w polu widzenia, chwyć boczną podstawę SCG, gdzie nadal jest przymocowany do otaczających tkanek. Drugą ręką powoli i delikatnie cofnij SCG w kierunku brzusznym i ogonowym.
    1. Cofnij SCG wiele razy, aby stopniowo usuwać ganglion. Podczas tego manewru utrzymuj ganglion w stanie nienaruszonym, aby upewnić się, że nie pozostały żadne resztki ganglionu.
      UWAGA: Delikatnie pociągnij ganglion, ponieważ na tym etapie może wystąpić krwawienie. Jeśli wystąpi niewielkie krwawienie, użyj utlenionej regenerowanej celulozy lub małego paska sterylnej gazy, aby utrzymać ciśnienie nad otworem przez 30 s do 1 minuty. Następnie powoli podnieś gazę i ponownie oceń. W razie potrzeby powtórz proces utrzymywania nacisku nad otworem, aż krwawienie ustanie.
  4. Powoli zwolnij pozostałe kleszcze przytrzymujące podstawę ganglionu. Sprawdź, czy nie ma krwawienia, szukając gromadzącej się krwi.
    UWAGA: Lekkie sączenie w tym czasie jest normalne. Monitoruj i upewnij się, że nie ma uporczywego lub znaczącego krwawienia przed zamknięciem i zakończeniem zabiegu. W takim przypadku należy przytrzymać nacisk na otwór, jak opisano w kroku 3.3.1.
  5. Przesuń gruczoły ślinowe z powrotem do ich normalnych pozycji anatomicznych. Przybliżyć i zamknąć skórę za pomocą prostych, przerywanych szwów nylonowych 5-0 (patrz tabela materiałów).
  6. Umieść mysz w czystej klatce, aby umożliwić pełne wyzdrowienie ze znieczulenia.
    UWAGA: Może minąć 5-15 minut, zanim mysz w pełni wybudzi się ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie umieszczaj myszy w klatce z innymi myszami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Oceń mysz pod kątem rekonwalescencji pooperacyjnej co najmniej raz na 24 godziny przez 72 godziny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten protokół opisuje chirurgiczne usunięcie SCG w modelu mysim. Rysunek 2 ilustruje anatomiczne punkty orientacyjne, w tym CCA, żyłę szyjną przednią i SCG. Po rozwarstwieniu (Ryc. 2A) można zobaczyć prawą żyłę szyjną przednią biegnącą wzdłuż bocznej granicy tchawicy. Ponieważ znajduje się głębiej niż przednia żyła szyjna, lewa CCA i jej rozwidlenie na tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) są słabo widoczne tylko po stronie żyły. Podczas sprawdzania tego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje mysi model do chirurgicznej jednostronnej ablacji danych wejściowych CC. Technika ta pozwala na badanie skutków unerwienia adrenergicznego w różnych warunkach. Ponadto wycięty ganglion współczulny może być również hodowany w kulturze matrigelowej 3D do eksperymentów in vitro 30.

Badania z udziałem SCGx przeprowadzono głównie na szczurach, ponieważ ich większa anatomia pozwala na łatwiejszą wizualizację anatomiczną i preparację. Podczas gdy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Q. W. był wspierany przez NIH T32CA009685. R. J. W. był wspierany przez NIH R01CA219534. Memorial Sloan Kettering Cancer Center Core Facilities było wspierane przez NIH P30CA008748.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynyEMD MilliporeAB152
Sztuczne łzy Smar Maść okulistycznaAkorn59399-162-35
Curity 2 x 2-calowa gąbka z gazy 8-warstwowa, sterylnaCovidien1806
Derf Uchwyt na igłęThomas Scientific1177K00
preparacyjny
Dumont #5/45 KleszczeNarzędzia do nauki11251-35
Kleszcze Dumont #7bNarzędzia do nauki11270-20
Cienkie nożyczki do szwów nylonowych ETHILONEthicon698H
- ToughCutFine Science Tools14058-09
Hipoalergiczna taśma chirurgiczna3M Blenderm70200419342
indukcji Komora, 2 litrowyVetEquip941444
IsofluraneBaxter1001936060
NairChurch & Dwight Co., Inc40002957chemiczny środek do usuwania włosów
NORADRENALINE RESEARCH ELISALabor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)BA E-5200
NSG MouseJackson LaboratoryJAX:005557
Powidonowo-jodowa pomadka wacinowaPDIS41350
Webcol Alkohol przygotowujeCovidien5110
Mikroskop

Bibliografia

  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Science Translational Medicine. 6 (250), 115(2014).
  3. Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
  4. Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
  5. Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
  6. Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
  7. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
  8. Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
  9. Yamazaki, S., et al. Ontogeny of circadian organization in the rat. Journal of Biological Rhythms. 24 (1), 55-63 (2009).
  10. Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114(2013).
  11. Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643(2020).
  12. Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
  13. Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000(2022).
  14. Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
  15. Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
  16. Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
  17. Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
  18. Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
  19. Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
  20. Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485(2019).
  21. Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
  22. Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
  23. Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. Neuroscience. 120 (3), 827-836 (2003).
  24. Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
  25. Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
  26. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
  27. Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
  28. Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641(2018).
  29. Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
  30. Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
  31. Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chirurgiczna sympatyktomiaukład nerwowy współczulnyablacja adrenergicznabarwienie na hydroksylazę tyrozynowąmikroskopia fluorescencyjnazespół Horneraoznaczanie ilości norepinefrynyślinianka podżuchwowa
Technika chirurgiczna dla górnej ganglionektomii szyjki macicy w modelu mysim
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.