Artykuł metodologiczny

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg

DOI:

10.3791/64533

⸱

17 lutego 2023

 ,  , 
1Microscopy Core Facility, Technological Research and Scientific Area (ACTI), University of Murcia, 2Confocal Microscopy and Cellular Imaging Unit, Genetic and Molecular Medicine Department, Pediatric Institute for Rare Diseases, Hospital Sant Joan de Déu, 3Research Institute Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Spain 4Algology Laboratory, Biology Faculty, University of Murcia, 4Algology Laboratory, Biology Faculty, University of Murcia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerwone algi (Rhodophyta) zawierają fikobiliproteiny i kolonizują siedliska przy słabym oświetleniu, jednak niektóre (np. niektóre gatunki Chroothece) mogą również rozwijać się w pełnym słońcu. Większość rodofitów jest czerwona, jednak niektóre mogą wydawać się niebieskawe, w zależności od proporcji niebieskich i czerwonych biliprotein (fikocyjaniny i fikoerytryny). Różne fikobiliproteiny mogą wychwytywać światło o różnych długościach fal i przekazywać je do chlorofilu a, co umożliwia fotosyntezę w bardzo różnych warunkach oświetleniowych. Pigmenty te reagują na zmiany siedlisk w świetle, a ich autofluorescencja może pomóc w badaniu procesów biologicznych. Wykorzystując Chroothece mobilis jako organizm modelowy i spektralny tryb skanowania lambda w mikroskopie konfokalnym, zbadano adaptację pigmentów fotosyntetycznych do różnych monochromatycznych świateł na poziomie komórkowym, aby odgadnąć optymalne warunki wzrostu gatunku. Wyniki pokazały, że nawet gdy badany szczep został wyizolowany z jaskini, przystosował się zarówno do słabego, jak i średniego natężenia światła. Przedstawiona metoda jest szczególnie przydatna do badania organizmów fotosyntetyzujących, które nie rosną lub rosną bardzo wolno w warunkach laboratoryjnych, co zwykle ma miejsce w przypadku organizmów żyjących w ekstremalnych siedliskach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerwone algi, takie jak rodzaj Chroothece, mogą rosnąć w ekstremalnych siedliskach, gdzie często muszą radzić sobie z wyraźnymi zmianami środowiskowymi1. Powodzie i susze są częste w regionach półpustynnych, gdzie można znaleźć ten rodzaj, a niektóre gatunki zostały zgłoszone w potokach, klifach, jaskiniach, a nawet wodach termalnych2. Jednak w większości przypadków zmienne biologiczne, takie jak konkurencja lub wypas, spychają gatunki do nieoptymalnych warunków dla ich wzrostu. Ponieważ organizmy te są często trudne do hodowli i albo nie rosną, albo rosną bardzo wolno w warunkach laboratoryjnych, jednym z głównych ograniczeń jest dostępna wielkość próbki. Dlatego bardzo ważne jest, aby stosować metody nieniszczące lub metody, które wymagają minimalnej manipulacji próbką3,4.

Umiejętności fizjologiczne potrzebne do przetrwania w tych trudnych warunkach mogą być monitorowane poprzez śledzenie zmian w ich systemach fotosyntetycznych. Mechanizmy metaboliczne, wydajność fotosyntezy i wrażliwość na światło lub warunki hodowli mogą być ujawnione przez profile emisji fluorescencji pigmentów, dzięki dokładnym zmianom w ich transferze energii lub pułapkowaniu5,6,7,8.

Autofluorescencja związków komórkowych może być używana jako marker do cytodiagnozy lub jako naturalny wskaźnik stanu komórkowego lub metabolizmu w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne i wewnętrzne poprzez zmiany w emisji9. Może być również używany do rozróżniania taksonomicznie różnych grup organizmów fotosyntetyzujących10. W zależności od pozycji filogenetycznej mikroorganizmów fototroficznych można znaleźć różne cechy fluorescencji in vivo. W związku z tym kilkakrotnie podjęto próbę identyfikacji taksonomicznej na podstawie charakterystyki fluorescencji fototroficznej in vivo (w tym absorpcji fluorescencji i widm emisyjnych)11,12. Ze względu na różnorodność pigmentów dodatkowych wśród taksonów fitoplanktonu, różnice w długościach fal, przy których stymulowana jest fluorescencja chlorofilu a (Chl a) lub różnice w widmach emisyjnych, mogą być wykorzystane do wywnioskowania taksonomii13. Widma wzbudzenia fluorescencji i emisji in vivo tych próbek opierają się nie tylko na typie glonów, ale także na adaptacji fotosystemu14. Efektywność transferu energii do Chl a, czyli stosunek Chl a do pigmentów dodatkowych, oraz zawartość pigmentu komórkowego są wrażliwe na warunki wzrostu5.

Czerwone algi, szczególnie Chroothece, mają kilka dodatkowych pigmentów fluorescencyjnych - fikobiliproteiny i karotenoidy; te pierwsze koncentrują się w fikobilisomach przyłączonych do tylakoidów chloroplastów. Fikobiliproteiny (fikocyjanina, fikoerytryna i allofikocyjanina) mogą wychwytywać światło o różnych długościach fal i przekazywać je do Chl a, co umożliwia fotosyntezę w bardzo różnych warunkach oświetleniowych i hodowlanych15. Na przykład, gatunki Chroothece mogą rosnąć w jaskiniach lub prawie wyłaniać się w lekko zasolonych strumieniach wapiennych2.

Monochromatyczne światła wpływają na wzrost i skład pigmentu organizmów fotosyntetyzujących i były badane w celu zapobiegania lub kontrolowania wzrostu organizmów fotosyntetycznych w jaskiniach. Mulec i in. wykazali, że czerwone wzbogacone oświetlenie sprzyja rozwojowi sinic, glonów i roślin16. Wcześniejsze badania wykazały również, że zielone światło wpływa na skład pigmentu cyjanobakterii17, podczas gdy inne wykazały, że zielone światło zapobiega wzrostowi większości organizmów fotosyntetycznych, a niektóre cyjanobakterie wykazują zmniejszenie tylakoidów i słabszą średnią intensywność fluorescencji18.

Aby zrozumieć zdolność Chroothece jako organizmu modelowego do pokonywania trudnych warunków, hodowane komórki zostały wystawione na działanie zwiększonego natężenia światła i monochromatycznego światła (zielonego lub czerwonego)15, aby zobaczyć, jak radzi sobie z ciemnymi warunkami w jaskiniach (gdzie dominuje czerwone światło). Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół odtwarza wpływ wyżej wymienionych zmiennych na fikobiliproteiny Chroothece na poziomie komórkowym za pomocą własnej autofluorescencji.

Obecnie fluorescencja jest powszechnie używana jako narzędzie do badania fizjologicznych reakcji roślin naczyniowych, mikroalg, makroglonów i cyjanobakterii13,14,16. Spektralna konfokalna mikroskopia fluorescencyjna jest doskonałym narzędziem do badań in vivo do oceny fizjologii próbek fotosyntetycznych na poziomie pojedynczej komórki10,17,18,19,20, unikając problemów związanych z niskim tempem wzrostu w laboratorium i trudności z uzyskaniem wystarczającej ilości biomasy dla powiązanej biomasy Metody ekstrakcji i biochemicznej8. Po poddaniu komórek działaniu w różnych warunkach hodowli przez 2 tygodnie, można zmierzyć profil skanowania lambda in vivo. Chociaż istnieje kilka publikacji, w których zastosowano różne długości fal wzbudzenia za pomocą obrazowania konfokalnego3,4,10,17, większość fikobiliprotein i Chl a można wykryć za pomocą linii wzbudzenia o długości fali 561 nm, a wykryta emisja mieści się w zakresie od 570 do 760 nm długości fali. Kryteria te zostały oparte na wcześniej przeprowadzonej analizie10 z komercyjnymi czystymi pigmentami (Tabela 1) za pomocą obrazowania konfokalnego i uzyskanych wyników dla różnych gatunków glonów20,21,22.

szt. Rozdział TGL TGL TGL TGL
Pigmentyλflmax (nm)λ exc (nm)
351364Z numerem 458Okręg wyborczy 476Z numerem 488Okręg wyborczy 514Okręg wyborczy 543633
Chl a660,9-678,143,4 ± 1,811,2 ± 0,21,8 ± 0,052,0 ± 0,0812,2 ± 0,76,0 ± 0,34,2 ± 0,1680,7 ± 1,5
R-PE569,2-583,35,9 ± 0,65,9 ± 0,1611,1 ± 0,0442,2 ± 0,3100,0 ± 090,0 ± 0,399,2 ± 0,08-
652,1-668,6--1,5 ± 0,013,7 ± 0,0426,7 ± 0,58,7 ± 0,1611,1 ± 0,1611,3 ± 0,2
C-PC (Komputer Centralny)636,2-676,42,3 ± 0,041,0 ± 0,010,6 ± 0,0040,7 ± 0,0082,0 ± 0,082,0 ± 0,043,3 ± 0,1633,6 ± 0,9
Pakiet APC-XL667,3-683,815,1 ± 1,59,6 ± 0,981,0 ± 0,041,2 ± 0,085,9 ± 0,74,1 ± 0,523,2 ± 3,591,4 ± 2,3

Tabela 1: Czysta informacja o pigmentach użyta do przeprowadzenia analizy skanowania lambda. Poniższa tabela przedstawia piki emisji i maksima pasma ramion/fluorescencji różnych fluorochromów/pigmentów za pomocą spektrofotometrii obrazowania konfokalnego dla wszystkich długości fal wzbudzenia oraz procentowy udział emisji światła przez pigmenty/fluorochromy. Wartości obliczono według wzoru: = MIF*100/255. Każda wartość jest średnią ± SE (średnia ± błąd standardowy od średniej). Do kalibracji konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego użyto czystych pigmentów w następujący sposób1,2,10. Chlorofil a otrzymywano ze Spinacia oleracea, R-fikoerytrynę (R-PE) z Porphyra tenera, a C-fikocyjaninę (C-PE) ze Spirulina sp. Wszystkie gatunki rozpuszczono w przefiltrowanej wodzie destylowanej. Allofikocyjaninę-XL (APC-XL) otrzymano z Mastigocladus laminosus, którą rozpuszczono w siarczanie amonu (60%) i fosforanie potasu (pH = 7) do uzyskania stężenia 38 mM. Skany wykonano z 400 μl każdego roztworu pigmentu (stężenie 1 mg/ml) przy użyciu 8-dołkowej komory dolnej ze szkła.

Badanie pojedynczej długości fali wzbudzenia jest dość użytecznym pierwszym przybliżeniem. W tym przypadku konieczne jest jednak wyjaśnienie względnego udziału różnych kompleksów w sygnale fluorescencyjnym, co jest zalecane między innymi do przeprowadzenia współczynnika fluorescencji lub analizy widma na kilku długościach fal

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gatunek glonów Chroothece mobilis został wykorzystany do niniejszego badania. Gatunek został pozyskany z kolekcji kultur Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Przegląd protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd badania. Chroothece mobilis jest inkubowany w ekstremalnych warunkach siedliskowych, takich jak różne monochromatyczne światła, przez 2 tygodnie. Wpływ na fizjologię Chroothece'a ocenia się za pomocą autofluorescencji białek zawartych w fikobilisomach i fotosystemach przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotować inokulum Chroothece mobilis z kultury agarowej z kolekcji, przenosząc je do płynnej pożywki SWES (Tabela 2).
    UWAGA: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = medium wody morskiej23.
  2. Utrzymywać wszystkie kultury przez 2 tygodnie z fotoperiodem 16:8 światło/ciemność w temperaturze 20 °C w warunkach niskiego natężenia światła białego (LL: 80 μM/m 2/s) i bez wstrząsania, aż do uzyskania pożądanej gęstości komórek (patrz krok 1.3).
    UWAGA: Warunki świetlne wzrostu to natężenie światła 80 μM/m 2/s (aktywne promieniowanie fotosyntetyczne, PAR). Warunki te są używane jako warunki słabego oświetlenia (kontrola). Skład podłoża SWES przedstawiono w tabeli 2.
  3. Przeprowadzić inokulacje do różnych eksperymentów w fazie hodowli wykładniczej o gęstości komórek 5 x 103 komórek/ml na 24-dołkowej płytce, używając 1 ml na basenik.
    UWAGA: Zliczanie komórek należy przeprowadzić za pomocą komory Neubauera24 i w razie potrzeby rozcieńczyć kulturę za pomocą SWES.

Skład średni SWES
składnikkoncentracja
Zobaczmateriał KNO 31,98 mln
K2HPO4115 μM
MgSO481 μM
ZnSO4, 7H2O17 nM
MnSO4, 7H2O45 Nm
H3BO3, 4H2O3,1 mM
Co(NO3)217 mM
Na2MoO4, 6H2O21 nM
CuSO4, 2H2O0,1 nM
FeSO4,5H 2O13 μM
EDTA, 7H2O11 μM
Wit B125 μg
Ekstrakt z gleby30 ml
Filtrowana woda rzeczna455 ml

Tabela 2: Średni skład SWES.

2. Odtwarzanie ekstremalnych warunków siedliskowych glonów: zielony i czerwony monochromatyczny efekt świetlny

  1. Dodać 1 ml kultury komórkowej z kultury podstawowej przygotowanej przy wyżej wymienionej gęstości komórek (krok 1.2) w celu zaszczepienia każdej studzienki na 24-dołkowej płytce.
  2. Trzymaj kulturę komórkową pod przykryciem przez 2 tygodnie, aby odtworzyć monochromatyczny efekt świetlny.
    1. Użyj zielonego filtra, który przepuszcza zielone światło od 470 do 570 nm ze szczytem na długości fali 506 nm (zgodnie ze specyfikacją producenta; patrz Tabela materiałów) i wystaw go na działanie culture25.
    2. Użyj czerwonego filtra, który przepuszcza czerwone światło w zakresie od 590 do 720 nm i osiąga szczyt przy 678 nm (zgodnie ze specyfikacją producenta; patrz Tabela materiałów), aby wystawić go na działanie culture25.
      UWAGA: Warunek niskiego natężenia światła białego (LL: 80 μM/m 2/s; patrz Tabela materiałów) służy jako kontrola natężenia światła w celu porównania uzyskanych efektów. Stosowane jednostki natężenia światła to mikromol na sekundę i metr kwadratowy (μmol m-2 s-1) lub gęstość strumienia fotonów fotosyntetycznych (PPFD).

3. Obrazowanie autofluorescencyjne

UWAGA: Konfiguracja oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela materiałów) jest zilustrowana w Rysunek 2.

  1. Włączyć wszystkie elementy odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM; patrz tabela materiałów), w tym laser.
  2. Umieścić komórki z każdej studzienki doświadczalnej 24-dołkowej płytki w pożywce wzrostowej SWES w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (patrz tabela materiałów) w celu obrazowania.
  3. Wybierz obiektyw zanurzeniowy 63x/1.30 NA glicerolu i umieść glicerol na soczewce (patrz Tabela materiałów).
  4. Umieść płytkę studzienkową na stoliku mikroskopu i upewnij się, że próbka nie porusza się podczas akwizycji obrazu.
  5. Wyśrodkuj próbkę na ścieżce światła i skup się na środku komórki, wybierając płaszczyznę o największej intensywności fluorescencji.
  6. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i wybierz xyλ z listy rozwijanej w trybie akwizycji26.
  7. Wybierz linię wzbudzenia lasera na 561 nm DPSS, 8 bitów zakresu dynamicznego i 1024 x 1024 pikseli.
    UWAGA: Upewnij się, że mikroskop konfokalny jest wyposażony w laser DPSS 561 nm lub laser światła białego (WLL).
  8. Zebrać widma emisji fluorescencji w paśmie 10 nm i wielkość kroku lambda 4 nm w zakresie 570-760 nm.
  9. Ustaw otwór na 1 jednostkę Airy i uruchom akwizycję skanowania lambda.
  10. Powtórz ten proces tyle razy, ile to możliwe w różnych polach widzenia, aby zebrać akceptowalną ilość danych do analizy statystycznej (zwykle odchylenie standardowe mniejsze niż 10%22).
  11. Powtórz ostatni krok w różnych warunkach (przy czerwonym i zielonym świetle) i zapisz dane.
    UWAGA: Użyj tych samych ustawień akwizycji dla różnych próbek i warunków, aby porównać i przeprowadzić analizę statystyczną.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Konfiguracja oprogramowania. Interfejs użytkownika oprogramowania do obrazowania do ustawiania parametrów skanowania lambda. (A) Od lewej do prawej, aby wybrać z listy rozwijanej tryb akwizycji xyλ, który odpowiada krokowi 3.6 w protokole, i wybrać odpowiedni typ soczewki zanurzeniowej, odpowiadający krokowi 3.3 w protokole. Upewnij się, że usunąłeś wszystkie filtry ze ścieżki światła w kroku 3.9. (B) Panel do ustawiania parametrów skanowania lambda odpowiada krokowi 3.8 w protokole. (C) Uruchom skanowanie lambda w kroku 3.10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Parametry do oceny fizjologii Chroothece'a

  1. Po uzyskaniu skanu lambda kliknij okno kwantyfikacji w górnej części oprogramowania (jak pokazano na Rysunek 3), aby ocenić zebrane widma emisji fluorescencji. Przejdź do okna Otwórz projekt i wybierz jeden plik xyλ (Rysunek 3).
  2. Wybierz opcję Stack profile analysis (Analiza profilu stosu) w oprogramowaniu do obrazowania.
  3. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) o wielkości 4μm2 w środku komórki, aby przeanalizować średnią intensywność fluorescencji (MFI). Eksportuj dane w formacie CSV.
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać obecności czarnych pikseli (aby upewnić się, że wybrane piksele zawierają wartości dodatnie) i zawsze utrzymywać ten sam rozmiar ROI.
  4. Powtórz ten proces z różnymi komórkami w różnych warunkach, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do przeprowadzenia analizy statystycznej.
  5. Otwórz pliki CSV, aby wybrać różne piki emisji fluorescencji spośród fikobiliprotein i chlorofilów wszystkich zmierzonych ROI.
    1. W pliku csv należy wybrać odpowiednio dane fluorescencji fikoerytryny-fikocyjanoliny (PE-PCB; 620 nm), C-fikocyjaniny (CPC; 648 nm), allofikocyjaniny (APC; 660 nm) i chlorofilu a (Chl a; 680 nm).
  6. Utwórz nową tabelę ze wszystkimi maksymalnymi wartościami fluorescencji uzyskanymi z każdego piku fikobiliproteiny i chlorofilu i wykreśl dane na wykresie.
  7. Przeprowadzanie analiz statystycznych.
    1. Przeanalizuj, czy uzyskane dane spełniają normę i homoskedastyczność27.
    2. Przejdź do analizy testu t27,28, jeśli pierwszy warunek jest spełniony. Jeśli nie, uruchom test U Manna-Whitneya29.
    3. Rozważ różnice istotne przy wartościach p <0,05.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Ocena autofluorescencji Chroothece. Aby przeprowadzić analizę autofluorescencji, upewnij się, że wybrałeś okno kwantyfikacji i jeden plik xyλ w oknie otwartych projektów (krok 4.1); Wybierz opcję Wizualizacja profilu stosu (krok 4.2); wybierz zwrot z inwestycji 4 μm2 na środku komórki i kliknij przycisk raportu, aby wyeksportować dane skanowania lambda w formacie CSV (krok 4.3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlorofil A zazwyczaj absorbuje niebieskie i czerwone długości fal światła widzialnego, podczas gdy fikobiliproteiny używają zielonych, żółtych i pomarańczowych długości fal7. Autofluorescencja tych pigmentów umożliwia pierwsze podejście do badania zachowania fikobiliprotein i chlorofilu w warunkach eksperymentalnych i terenowych.

Porównując uzyskane dane i wykreślając na różnych wykresach, można wyróżnić znaczące zmiany w średniej intensywności fluorescencji (MFI) (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre jednokomórkowe lub kolonialne krasnorosty czerwone, takie jak Chroothece, rosną powoli in vitro, ale zawierają wiele związków autofluorescencyjnych, które można analizować za pomocą analizy spektralnej pod mikroskopem konfokalnym, gdzie można wykryć różnice w pikach emisji pigmentu. Spektralna konfokalna mikroskopia fluorescencyjna pozwoliła nam na przeprowadzenie badań in vivo w celu oceny adaptacji lub aklimatyzacji organizmów fotosyntetycznych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone w ramach projektów TIN2015-68454-R i 20961/PI/18, finansowanych przez hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności oraz Fundację Séneca Regionu Murcji. Irene Hernández Martínez i Francisco Javier Ibáñez López z Sekcji Wsparcia Statystycznego Obszaru Naukowo-Badawczego Uniwersytetu w Murcji (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Rysunek 1 został narysowany na podstawie zdjęć z Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier jest dostępny na licencji Creative Commons Attribution 3.0 Unported (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Dish 35 mm, wysokie szklane dnoIbidi 81158-24
płytka studzienkowaIbidi82406  płaskie i przezroczyste dno do mikroskopii wysokoprzepustowej
Inkubator glonówPanasonicMLR-352-PE
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeica MicrosystemsSP8 TCS-Flask
Fisher Scientific15380591Można kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych.
zielony filtrPNTA, filtry LEE-Możnakupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2Leica Microsystems506353Soczewki zanurzeniowe z glicerolem
Oprogramowanie do akwizycji obrazu. LAS XLeica MicrosystemsSP8 TCS-Źródło
światłaPanasonicFL40SSENW/37MLR-352-PE
Fotoradiometr kwantowyDeltaOhm Oprogramowanie DO 9721-R
R Core Team, 20204.0.2.-
czerwony filtrPNTA, filtry LEE-Możnakupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych.
SWES mediumUniwersytet w Murcji--
Ciecz zanurzeniowa typu GLeica Microsystems11513910Glicerol 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
  2. Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
  3. Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
  4. Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
  5. Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
  6. Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
  7. Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
  8. Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
  9. Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
  10. Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
  11. Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
  12. Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
  13. Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
  14. Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
  15. Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
  16. Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
  17. Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
  18. Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
  19. Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
  20. Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
  21. Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
  22. Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
  23. Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , www.uni-goettingen.de (2022).
  24. Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024(2020).
  25. Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
  26. Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
  27. Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
  28. Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
  29. Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
  30. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  31. Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PhycobiliproteinsConfocal MicroscopyChroothece MobilisPhotosynthetic PigmentsFluorescence Emission SpectraMonochromatic Light AdaptationChlorophyll AAllophycocyanin

Powiązane artykuły