Method Article

Ocena przypuszczalnych właściwości antykryptokokowych surowych i klarowanych ekstraktów z

DOI:

10.3791/64540

⸱

December 2nd, 2022

 ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph, 2School of Environmental Sciences, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki patogen grzybiczy Cryptococcus neoformans wytwarza różne czynniki wirulencji (np. peptydazy), aby ułatwić sobie przetrwanie w organizmie gospodarza. Nisze środowiskowe stanowią obiecujące źródło nowych naturalnych inhibitorów peptydazy. Protokół ten określa przygotowanie ekstraktów z i ocenę ich wpływu na produkcję czynników wirulencji grzybów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptococcus neoformans to zamknięty w kapsułkach ludzki patogen grzybiczy o globalnym zasięgu, który przede wszystkim infekuje osoby z obniżoną odpornością. Powszechne stosowanie leków przeciwgrzybiczych w warunkach klinicznych, ich stosowanie w rolnictwie i hybrydyzacja szczepów doprowadziły do zwiększonej ewolucji oporności. Ten rosnący wskaźnik oporności na leki przeciwgrzybicze jest rosnącym problemem wśród klinicystów i naukowców na całym świecie, a opracowanie nowych terapii przeciwgrzybiczych jest coraz pilniejsze. Na przykład C. neoformans wytwarza kilka czynników wirulencji, w tym enzymy wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe (np. peptydazy) odgrywające rolę w degradacji tkanek, regulacji komórkowej i pozyskiwaniu składników odżywczych. Zakłócenie takiej aktywności peptydazy przez inhibitory zaburza wzrost i proliferację grzybów, co sugeruje, że może to być ważna strategia zwalczania patogenu. Co ważne, bezkręgowce, takie jak, wytwarzają inhibitory peptydazy o zastosowaniach biomedycznych i aktywności przeciwdrobnoustrojowej, ale są one niedostatecznie zbadane pod względem ich zastosowania przeciwko patogenom grzybiczym. W tym protokole przeprowadzono globalną ekstrakcję z w celu wyizolowania potencjalnych inhibitorów peptydazy w ekstraktach surowych i klarowanych, a także oceniono ich wpływ na klasyczne czynniki wirulencji kryptokoków. Metoda ta wspiera priorytetyzację o właściwościach przeciwgrzybiczych i daje możliwości odkrycia środków przeciwwirulencyjnych poprzez wykorzystanie naturalnych inhibitorów znajdujących się w.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptococcus neoformans to ludzki patogen grzybiczy, który powoduje ciężką chorobę u gospodarzy z obniżoną odpornością, takich jak osoby żyjące z HIV/AIDS1, i prowadzi do około 19% zgonów związanych z AIDS2. Grzyb jest podatny na kilka klas leków przeciwgrzybiczych, w tym azole, polieny i flucytozynę, które wywierają działanie grzybobójcze i grzybostatyczne przy użyciu różnych mechanizmów3,4. Jednak szerokie zastosowanie leków przeciwgrzybiczych w warunkach klinicznych i rolniczych w połączeniu z hybrydyzacją szczepów wzmocniło ewolucję oporności u wielu gatunków grzybów, w tym C. neoformans5.

Aby sprostać wyzwaniom związanym z opornością na leki przeciwgrzybicze i zmniejszyć częstość występowania infekcji grzybiczych na skalę globalną, obiecującym podejściem jest wykorzystanie czynników wirulencji Cryptococcus spp. (np. zdolność adaptacji do temperatury, kapsułka polisacharydowa, melanina i enzymy zewnątrzkomórkowe) jako potencjalnych celów terapeutycznych4,6. Takie podejście ma kilka zalet, ponieważ te czynniki wirulencji są dobrze scharakteryzowane w literaturze, a celowanie w te czynniki może potencjalnie zmniejszyć wskaźniki oporności na leki przeciwgrzybicze poprzez narzucenie słabszego nacisku selekcyjnego poprzez upośledzenie wirulencji, a nie ukierunkowanie na wzrost komórek6. W tym kontekście w licznych badaniach oceniono możliwość celowania w enzymy zewnątrzkomórkowe (np. proteazy, peptydazy) w celu zmniejszenia lub zahamowania zjadliwości Cryptococcus spp.7,8,9.

Organizmy takie jak bezkręgowce i rośliny nie posiadają adaptacyjnego układu odpornościowego, który chroniłby je przed patogenami. Polegają jednak na silnym wrodzonym układzie odpornościowym z ogromnym wachlarzem związków chemicznych, aby radzić sobie z mikroorganizmami i drapieżnikami10. Cząsteczki te obejmują inhibitory peptydazy, które odgrywają ważną rolę w wielu układach biologicznych, w tym w komórkowych procesach odporności bezkręgowców, takich jak krzepnięcie hemolimfy, synteza cytokin i peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ochrona gospodarzy poprzez bezpośrednią inaktywację proteaz patogenów11. Tak więc inhibitory peptydazy z bezkręgowców, takich jak, mają potencjalne zastosowania biomedyczne, ale wiele z nich pozostaje niescharakteryzowanych10,12,13. W tym kontekście w Ontario występują około 34 gatunki lądowych, a w Kanadzie 180 słodkowodnych14. Jednak ich dogłębne profilowanie i charakterystyka są nadal ograniczone15. Organizmy te stwarzają okazję do identyfikacji nowych związków o potencjalnej aktywności przeciwgrzybiczej10.

W tym protokole opisane są metody izolowania i klarowania ekstraktów z bezkręgowców (np.) (Rysunek 1), a następnie pomiar przypuszczalnej aktywności hamującej peptydazę. Właściwości przeciwgrzybicze tych ekstraktów są następnie oceniane poprzez pomiar ich wpływu na produkcję czynnika wirulencji C. neoformans za pomocą testów fenotypowych (Rysunek 2). Należy zauważyć, że różnice we właściwościach przeciwgrzybiczych między ekstraktami surowymi i klarowanymi mogą wskazywać na czynniki mikrobiologiczne (np. metabolity wtórne lub toksyny wytwarzane przez mikrobiom gospodarza), co może wpływać na obserwacje eksperymentalne. Takie odkrycia potwierdzają potrzebę, aby w tym protokole niezależnie oceniać zarówno surowe, jak i klarowane ekstrakty, aby rozwikłać sposoby działania. Ponadto proces ekstrakcji jest bezstronny i może umożliwić wykrycie właściwości przeciwdrobnoustrojowych wobec wielu patogenów grzybowych i bakteryjnych. W związku z tym protokół ten stanowi punkt inicjacyjny do priorytetyzacji gatunków o właściwościach przeciwgrzybiczych przeciwko C. neoformans oraz możliwość oceny powiązań między aktywnością enzymatyczną a wytwarzaniem czynników wirulencji poprzez domniemane mechanizmy hamujące.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja białka z

  1. Zbieraj z wyznaczonego i zatwierdzonego obszaru naturalnego (np. Speed River, Guelph, Ontario). Do tego badania wybrano zarówno gatunki rodzime, jak i inwazyjne, aby ocenić szeroki zakres potencjalnych skutków przeciwgrzybiczych.
  2. Delikatnie rozbij skorupę (np. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi i Cipangopaludina chinensis) za pomocą tłuczka i moździerza, a następnie usuń stałe kawałki pęsetą. Ogólnie rzecz biorąc, 10 jest gromadzonych do użytku w całym protokole.
  3. Zbierz i zważ narządy. Optymalna jest około 15-20 g próbki. Za pomocą nożyczek pokrój narządy na małe kawałki o wielkości około 0,5-1 cm.
  4. Błyskawiczne zamrożenie wypreparowanych i pociętych próbek narządów za pomocą ciekłego azotu. Następnie zmiel próbki organów na drobny proszek za pomocą tłuczka i moździerza.
  5. Dodać sproszkowaną próbkę narządu (około 15 g) do 30 ml zimnej wody destylowanej (4 °C) w celu uzyskania proporcji 1:2 (m/v).
  6. Wlać 2 ml próbki do probówek o dużej mocy 2 ml. Do każdej probówki dodać miarkę kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 3 mm (około 500 μg) i homogenizować za pomocą blendera (patrz tabela materiałów) przez 3 minuty przy 1 200 obr./min i w temperaturze 4 °C.
  7. Wirować przy 12 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać wszystkie supernatanty za pomocą pipety do świeżej probówki o pojemności 50 ml, odrzucając osady.
  8. Przefiltrować-wysterylizować supernatant za pomocą membrany 0,22 μm. Przechowywać próbki na lodzie i postępować zgodnie z protokołem klarowania (sekcja 2), w stosownych przypadkach.
    UWAGA: Próbki można błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu wykorzystania jako ekstrakty surowe.

2. Wyjaśnienie ekstraktu z

  1. Umieścić sklarowaną nad osadem próbkę z etapu 1.8 w łaźni termalnej o temperaturze 60 °C na 30 minut. Następnie szybko schłodzić próbki, przenosząc je do wiadra z lodem na 20 minut.
  2. Odwirować próbki o masie 15 000 × g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 50 ml i wyrzucić osad. Przefiltruj i wysterylizuj próbki za pomocą filtra membranowego 0,22 μm, a następnie przechowuj je na lodzie.
  3. Oznaczyć stężenie białka w próbkach z etapu 1.8 (tj. ekstrakt surowy) i kroku 2.2 (tj. ekstrakt klarowany) za pomocą testu ilościowego (np. test kwasu bicinchoninowego 17). Optymalny zakres stężeń białka to 4-8 mg/mL.
  4. Próbki należy przechowywać na lodzie do 1 godziny lub w stanie błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne.

3. Test aktywności hamującej

  1. Zmierzyć aktywność hamującą ekstraktów surowych i klarowanych, stosując testy enzymatyczne w trzech egzemplarzach technicznych.
    UWAGA: Każdy test enzymatyczny składa się z enzymu (np. subtylizyny A, która bierze udział w zjadliwości grzybów16,17,18; zwykle około 1 x 10−9 mol/L w przypadku testów na bazie chromogenów), buforu i substratu. Reakcja rozpoczyna się, gdy substrat napotka enzym. Aktywność enzymatyczna jest proporcjonalna do szybkości przekształcania substratu w produkt.
  2. Ocenić wpływ stężenia enzymu (EC) na aktywność enzymatyczną (EA), aż do uzyskania liniowej zależności między oboma parametrami. W kolejnych krokach należy użyć stężenia enzymu w mierzonym zakresie liniowym.
    UWAGA: Test enzymatyczny dla peptydazy subtylizyny A jest szczegółowo opisany w poniższych krokach.
  3. Inkubować surowe (etap 1.11) lub oczyszczone (etap 2.5) ekstrakty białkowe (np. 10 μl zawierające 4 mg/ml białka) z 10 μl subtylizyny A (stężenie określone z kroku 3.2) i 220 μl 100 mM Tris-HCl o pH 8,6 (dla kontroli dodać 230 μl buforu Tris bez dodawania ekstraktu) przez 10 minut w temperaturze 25 °C na 96-dołkowej płaskiej płytce.
  4. Dodać 10 μl N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidu, substratu dla subtylizyny A, o końcowym stężeniu 1 Km (stała Michaelisa-Mentena; 0,2 mM dla tego substratu z subtylizyną A), aby uzyskać końcową objętość reakcji 250 μl.
  5. Zmierzyć aktywność enzymatyczną, monitorując wygląd produktu w czasie, odczytując gęstość optyczną (OD) przy 405 nm co 15 s przez 3 minuty.
  6. Oznaczyć resztkową aktywność enzymatyczną, obliczając stosunek aktywności enzymatycznej w obecności ekstraktu z do aktywności w przypadku braku ekstraktu.
  7. W przypadku zaobserwowania aktywności hamującej (tj. aktywności resztkowej poniżej 1) należy zmierzyć wartość stężenia hamującego 50 (IC50) przy użyciu zakresu stężeń ekstraktów (np. seria dwukrotnych rozcieńczeń od 200 μg/ml do 1 μg/ml) zgodnie ze standardowymi metodami19.

4. Wpływ ekstraktów z na wzrost C. neoformans

  1. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl wprowadzić pojedynczą kolonię C. neoformans var. grubii H99 typu dzikiego (WT) do 5 ml pożywki z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l peptonu i 20 g/l dekstrozy, pH 6,5) i inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Przeprowadzić eksperyment w potrójnym egzemplarzu biologicznym i duplikatach technicznych.
  2. Zbierz 500 μl kultury w kuwecie i zmierz wzrost, odczytując OD przy 600 nm. Rozcieńczyć kulturę pożywką na bazie azotu drożdży (YNB) do końcowego OD600 0,02.
  3. Wspólna hodowla komórek C. neoformans o różnych stężeniach (np. seria trzykrotnego rozcieńczenia od 440 μg/ml do 15 μg/ml białka) ekstraktów (tj. surowych i klarowanych). W tym celu należy zmieszać 10 μl ekstraktów ze 190 μl rozcieńczonej kultury C. neoformans (krok 4.2) na 96-dołkowej płytce.
  4. Zmierzyć wzrost, odczytując OD600 za pomocą czytnika płytek co 15 minut do 1 godziny przez 72 godziny przy 200 obr./min i 37 °C.

5. Wpływ ekstraktów z na produkcję melaniny przez C. neoformans

  1. Przygotować płytki L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny (L-DOPA).
    1. Umieścić w autoklawie 230 ml agaru o stężeniu 14 g/l i pozostawić do ostygnięcia, aż osiągnie temperaturę 50-60 °C.
    2. Do płynnego agaru dodać 3,25 ml 1 M glicyny, 7,35 ml 1 M KH2PO4, 2,5 ml 1 M MgSO 4,7H2O, 0,6 ml 40% glukozy, 70 μl 10 mM tiaminy i 2,5 ml 100 mM L-DOPA (sterylizowanego filtrem).
    3. Wlać 15 ml mieszaniny do szalek Petriego, pozostawić do wyschnięcia na około 1 godzinę w ciemności i przechowywać w temperaturze 2-4 °C przez okres do 1 tygodnia. Upewnij się, że pokrywki są częściowo podniesione, aby agar prawidłowo wyschł.
  2. Zaszczepić 5 ml pożywki YNB 50 μl kultury C. neoformans z kroku 4.1. Inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze 30 °C i 200 obr./min.
  3. Wirować komórki w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 2x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o pH 7,4.
  4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 10-6 komórek/ml.
  5. Przygotować serię rozcieńczeń (np. dwukrotną) surowych i klarowanych ekstraktów. Podobnie, przygotuj 10-krotną serię rozcieńczeń komórek C. neoformans (krok 5.4) od 1 x 106 komórek/ml do 1 x 101 komórek/ml przy użyciu sterylnego PBS w 96-dołkowych płytkach.
  6. Rozprowadzić 200 μl ekstraktów na płytkach Petriego zawierających agar L-DOPA za pomocą wacika i pozostawić do wyschnięcia na 15 minut.
  7. Umieść 5 μl kultury z każdej studzienki na płytce L-DOPA, pozostawiając 1 cm między kroplami. Pozostaw do wyschnięcia w ciemności przez 15 minut.
  8. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C i 37 °C w inkubatorze statycznym przez 3-5 dni, rejestrując obrazy co 24 godziny za pomocą kamery lub urządzenia do obrazowania płytek (np. skanera).
    UWAGA: W celu zbadania wpływu temperatury na hamujące wzrost działanie ekstraktów z zastosowano tutaj dwa warunki temperaturowe, przy czym 30 °C oznacza temperaturę środowiskową, a 37 °C oznacza temperaturę fizjologiczną człowieka.

6. Wpływ ekstraktów z na produkcję kapsułek polisacharydowych C. neoformans

  1. Przygotuj podłoże o niskiej zawartości żelaza (LIM) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Rozpuścić 5 g żywicy chelatującej (patrz tabela materiałów) w 60 ml ultraczystej wody i zapakować do szklanej kolumny (2 cm średnicy x 25 cm długości). Umyj kolumnę 100 ml wody i wylej zebraną wodę.
    2. Przygotować wodę o niskiej zawartości żelaza (woda LI), przepuszczając 2 litry sterylnej ultraczystej wody przez kolumnę chelatacyjną. Przechowuj wodę LI-water w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
    3. Rozpuścić 5 g glukozy w 100 ml wody liowej. Rozpuścić 5 g L-asparaginy w 200 ml wody liowej w osobnej zlewce.
    4. Do 500 ml wody LI dodać kolejno: 4,78 g HEPES, 0,4 gK2HPO4, 0,08 g MgSO 4,7H2 O, 1,85 gNaHCO3 i 0,25 g CaCl 2,2H2O.
    5. Połącz rozwiązania z kroku 6.1.3 i kroku 6.1.4. Dodać 1 ml 100 mM soli sodowej kwasu batofenantrolinonisulfonowego (BPS) do końcowego stężenia 100 μM.
    6. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą MOPSÓW LI-MOPS 1 M. Dodać wodę LI do końcowej objętości 1 l i przefiltrować pożywkę, przepuszczając ją przez membranę 0,22 μm. Dodać 100 μl sterylnej tiaminy (4 mg/ml) do pożywki.
  2. Zaszczepić 5 ml pożywki YNB 50 μl kultury C. neoformans z kroku 4.1. Inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Użyj tej hodowli do zaszczepienia 5 ml LIM do końcowego stężenia 10-5 komórek/ml.
  3. Dodać odpowiednie objętości ekstraktów z (np. dwukrotne rozcieńczenie lub objętość oznaczoną na podstawie poprzednich testów wirulencji), aby osiągnąć pożądane stężenia. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C i prędkości 200 obr./min z poluzowanymi nakrętkami. Po inkubacji zebrać 1 ml komórek i przemyć 2x sterylnym PBS o pH 7,4 w temperaturze 1 500 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  4. Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Wymieszaj komórki z tuszem indyjskim w stosunku 1:1 (np. 4 μl tuszu indyjskiego z 4 μl zawiesiny komórek) na szklanym szkiełku mikroskopowym. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku
    5. podstawowym.
  5. Wizualizacja próbek za pomocą mikroskopu różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) z obiektywem olejowym o powiększeniu 63x (patrz tabela materiałów). Ustaw kontrast na automatyczny i ustaw ostrość ręcznie za pomocą pokrętła mikroskopu. Zaznacz wszystkie obrazy i wyeksportuj je w formacie TIFF. Nie trzeba stosować żadnych filtrów.
  6. Korzystając z narzędzia linijki w ImageJ20, określ ilościowo stosunek całkowitego rozmiaru komórki (w tym kapsułki) do rozmiaru ciała komórki.

7. Wpływ ekstraktów z na produkcję biofilmu C. neoformans

  1. Zaszczepić 5 ml pożywki YNB 50 μl kultury C. neoformans z kroku 4.1. Inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze 30 °C i 200 obr./min.
  2. Zebrać komórki z kultury o pojemności 5 ml. Przemyć komórki sterylnym PBS o pH 7,4 w temperaturze 1 500 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do końcowego stężenia10-7 komórek/ml.
  4. Przenieść 300 μl zawiesiny komórkowej do poszczególnych dołków sterylnej, polistyrenowej płytki 24-dołkowej z płaskim dnem. Używaj studzienek z pożywką tylko jako kontrolki.
  5. Dodać odpowiednie objętości ekstraktów (np. dwukrotne rozcieńczenie lub objętość oznaczoną na podstawie poprzednich testów wirulencji), aby osiągnąć końcowe stężenie 10-20 μg/ml białka. Upewnij się, że objętość ekstraktu nie jest większa niż 10% całkowitej objętości.
  6. Owinąć płytki folią aluminiową (aby uniknąć parowania pożywki) i inkubować przez 48 godzin w inkubatorze statycznym w temperaturze 30 °C i 37 °C.
  7. Za pomocą butelki lub dozownika umyj studzienki 2x sterylną wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 100 μl 0,3% roztworu fioletu krystalicznego do każdej studzienki (w tym studzienek kontrolnych zawierających tylko pożywkę) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Dokładnie umyj studzienki 3x sterylną wodą (biofilmy nie zostaną naruszone podczas mycia). Dodać 200 μl 100% etanolu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Przenieś 75 μl na nową 96-dołkową płytkę z płaskim dnem i odczytaj OD550. Określ ilościowo tworzenie biofilmu jako (OD550nm próbki - OD550nm ślepej próby).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj przepływ pracy umożliwia izolację białek i peptydów z o potencjalnych właściwościach przeciwwirusowych przeciwko C. neoformans. Podobnie, ocena różnych form ekstraktów (tj. surowych i klarowanych) pozwala na częściowe oczyszczenie potencjalnych związków aktywnych i wspiera dalszą ocenę (np. proteomika oparta na spektrometrii mas). Zazwyczaj w procesie ekstrakcji białek powstają homogenizowane roztwory o stężeniu białka 4-8 mg/ml. W tym przypadku reprezentatywne wyniki pokazują ocenę aktywności enzy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół ekstrakcji przedstawia izolację związków z zebranych z Ontario w Kanadzie i demonstruje nowatorskie badanie wykorzystania ekstraktów z przeciwko ludzkiemu patogenowi grzybowemu, C. neoformans. Protokół ten dołącza do rosnącej liczby badań badających aktywność inhibitora peptydazy u bezkręgowców13. Podczas ekstrakcji niektóre próbki ekstraktu były trudne do sterylizacji filtracyjnej, prawdopodobnie ze względu na obecność rozpuszczalnych polisacharydów i/lub pigmentów...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom Laboratorium Geddes-McAlister za cenne wsparcie podczas tego badania i opinie na temat manuskryptu. Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award - University of Guelph dla D. G.-G oraz z Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) i Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award dla J. G.-M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 μ m FiltryVWR28145-477 (Ameryka Północna)
Probówki 1,5 ml (Safe-Lock)Probówki Eppendorf0030120086
2 ml (Safe-Lock)Eppendorf0030120094
3,4-dihydroksy-L-fenyloalanina (L-DOPA)Sigma-AldrichD9628-5GCAS #: 59-92-7
Płytki 96-dołkoweCostar (Corning)3370
Bullet Blender Storm 24NEXT ADVANCEBBY24M
Wirówka 5430REppendorf5428000010
Żywica Chelex 100 InkubatorBioRad142-1253
CO2 (statyczny)SANYONiedostępne
Cryptococcus neoformans Mikroskop208821ATCC
Olympus
DICZeiss
DMEMCorning10-013-CV
Glukoza (D-glukoza, bezwodna, klasa odczynnika)BioShopGLU501CAS #: 50-99-7
GlicynaFisher ChemicalG46-1CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9Dotmatics
HemocytometrVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4.7 H2O)HoneywellM1880-500GCAS #: 10034-99-8 
PeptoneBioShopPEP403
Fosohatowa sól buforowa pH 7,4BioShopPBS408SKU: PBS408.500
Czytnik płytek (Synergy-H1)BioTek (Agilent)Niedostępny
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Fisher ChemicalP285-500CAS #: 7778-77-0
Subtylizyna ASigma-AldrichP4860CAS #: 9014-01-01
Sukcynyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilideSigma-Aldrich573462CAS #: 70967-97-4
Kąpielisko termalneVWR76308-834
Chlorowodorek tiaminyFisher-BioreagentsBP892-100CAS #: 67-03-8
Ekstrakt drożdżowyBioShopYEX401CAS #: 8013-01-2
Drożdże zasada azotowa (z aminokwasami)Sigma-AldrichY1250-250GYNB 
DIC H99 Oprogramowanie mikroskopu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
  2. Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
  3. Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79(2018).
  4. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
  5. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
  6. Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
  7. Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
  8. Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
  9. Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
  10. Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016(2021).
  11. Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
  12. Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
  13. González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
  14. Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
  15. Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
  16. Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
  17. Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
  18. Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051(2016).
  19. Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  21. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
  22. Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
  23. Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
  24. Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
  25. Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173(2017).
  26. Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Anticryptococcal PropertiesMollusk ExtractsCryptococcus NeoformansPeptidase InhibitorsAntifungal ResistanceBiofilm FormationProtein QuantificationSubtilisin A InhibitionFungal Virulence FactorsThermal Tolerance

Related Articles