Automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji

Summary

Test mikrojądrowy (MN) jest sprawdzonym testem do ilościowego określania uszkodzeń DNA. Jednak ocena testu przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak mikroskopia ręczna lub analiza obrazu oparta na cechach, jest pracochłonna i wymagająca. W artykule opisano metodologię opracowania modelu sztucznej inteligencji do oceny testu MN przy użyciu danych z obrazowej cytometrii przepływowej.

Abstract

Test mikrojądrowy (MN) jest używany na całym świecie przez organy regulacyjne do oceny chemikaliów pod kątem toksyczności genetycznej. Test można przeprowadzić na dwa sposoby: poprzez ocenę MN w raz podzielonych, zablokowanych przez cytokinezę komórkach dwujądrowych lub w pełni podzielonych komórkach jednojądrowych. Historycznie rzecz biorąc, mikroskopia świetlna była złotym standardem metody oceny testu, ale jest pracochłonna i subiektywna. Cytometria przepływowa była stosowana w ostatnich latach do oceny testu, ale jest ograniczona przez niemożność wizualnego potwierdzenia kluczowych aspektów obrazowania komórkowego. Obrazowa cytometria przepływowa (IFC) łączy w sobie wysokoprzepustowe przechwytywanie obrazu i zautomatyzowaną analizę obrazu i jest z powodzeniem stosowana do szybkiego pozyskiwania obrazów i oceny wszystkich kluczowych zdarzeń w teście MN. Ostatnio wykazano, że metody sztucznej inteligencji (AI) oparte na konwolucyjnych sieciach neuronowych mogą być wykorzystywane do oceny danych testowych MN pozyskanych przez IFC. W tym dokumencie opisano wszystkie kroki korzystania z oprogramowania sztucznej inteligencji do tworzenia modelu uczenia głębokiego w celu oceny wszystkich kluczowych zdarzeń i zastosowania tego modelu do automatycznego oceniania dodatkowych danych. Wyniki z modelu głębokiego uczenia się AI wypadają dobrze w porównaniu z mikroskopią ręczną, umożliwiając w ten sposób w pełni zautomatyzowaną ocenę testu MN poprzez połączenie IFC i AI.

Introduction

Test mikrojądrowy (MN) ma fundamentalne znaczenie w toksykologii genetycznej do oceny uszkodzeń DNA podczas opracowywania kosmetyków, farmaceutyków i substancji chemicznych stosowanych u ludzi^1,2,3,4. Mikrojądra powstają z całych chromosomów lub fragmentów chromosomów, które nie włączają się do jądra po podziale i kondensują się w małe, koliste ciała oddzielone od jądra. W związku z tym MN może być używany jako punkt końcowy do ilościowego określania uszkodzeń DNA w testach genotoksyczności¹.

Protocol

1. Akwizycja danych za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

UWAGA: Zapoznaj się z Rodrigues et al.¹⁶ z następującymi modyfikacjami, zauważając, że obszary akwizycji za pomocą IFC mogą wymagać modyfikacji w celu optymalnego przechwytywania obrazu:

1. W przypadku metody innej niż Cyt-B należy przeprowadzić zliczanie komórek przy użyciu dostępnego w handlu licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów) na każdej hodowli bezpośrednio przed hodowlą i bezpośrednio po okresie rekonwalescencji.
2. Jeśli uruchamiasz próbki na cytometrze przepł....

Results

Rysunek 1 pokazuje przebieg pracy przy użyciu oprogramowania AI do stworzenia modelu dla testu MN. Użytkownik ładuje żądane pliki .daf do oprogramowania AI, a następnie przypisuje obiekty do klas modelu prawdy naziemnej za pomocą algorytmów tagowania klastra wspomaganego przez sztuczną inteligencję (Rysunek 2) i predict (Rysunek 3). Gdy wszystkie klasy modeli prawdy gruntowej zostaną wypełnione wystarczającą liczbą obiektów, model m.......

Discussion

Prezentowana praca opisuje wykorzystanie algorytmów głębokiego uczenia się do automatyzacji punktacji testu MN. Kilka ostatnich publikacji wykazało, że intuicyjne, interaktywne narzędzia pozwalają na tworzenie modeli głębokiego uczenia się w celu analizy danych obrazowych bez konieczności posiadania dogłębnej wiedzy obliczeniowej^18,19. Protokół opisany w tej pracy, wykorzystujący pakiet oprogramowania oparty na interfejsie użytkownika, został zaprojektowany tak, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka wirówkowa 15 ml	Falcon	352096
Cleanser - Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546931	Pojemnik do napełniania 200 ml środka czyszczącego.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine	MilliporeSigma	64-86-8
Corning butelkowy filtr próżniowy	MilliporeSigma	CLS430769	0,22 i mikro; m filtr, butelka 500 ml
Cytochalazyna B	MiliporeSigma	14930-96-2	Butelka 5 mg
Debubbler - 70% Isopropanol	MilliporeSigma	1.3704	Napełnij pojemnik 200 ml Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	MilliporeSigma	67-68-5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1X	EMD Milipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ Bezpłatny
Hyklon płodowej surowicy bydlęcej		SH30071.03
Formaldehyd, 10%, bez metanolu, Ultra Pure	Polysciences, Inc.	04018	To jest to, co jest używane do 4% i 1% formaliny. UWAGA: Formalina/formaldehyd toksyczny przez drogi oddechowe i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Może powodować uczulenie przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Potencjalne zagrożenie rakiem.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Analizator komórek Guava Muse	Luminex	0500-3115	Zastosowano analizator komórek Guava Muse o standardowej konfiguracji.
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 mg/ml roztwór
Miliporów mannitoluSigma		69-65-8
MEM Aminokwasy endogenne 100X	Hyklon	SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II	Luminex, firma DiaSorin	100220	A 2 ImageStreamX Mark II wyposażoną w lasery 405 nm, 488 nm i 642 nm.
Oprogramowanie do analizy MIFC - IDEAS	Luminex, firma należąca do DiaSorin	100220	"Oprogramowanie do analizy obrazu" Oprogramowanie towarzyszące MIFC (ImageStreamX MKII)
Oprogramowanie MIFC - INSPIRE	Luminex, firma należąca do DiaSorin	100220	"Oprogramowanie do akwizycji obrazu" Jest to oprogramowanie, które uruchamia oprogramowanie MIFC (ImageStreamX MKII)
Oprogramowanie Amnis AI	Luminex, firma	DiaSorin100221	"Oprogramowanie AI" Jest to oprogramowanie, które pozwala na tworzenie modeli sztucznej inteligencji do analizy danych
Mitomycyna C	MiliporeSigma	50-07-7
Mieszanina NEAA 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
Penicllin/Streptomycyna/Glutamina roztwór 100X	Gibco	15070063
Chlorek potasu (KCl)	MilliporeSigma	P9541
Płukanie - Woda ultraczysta lub woda dejonizowana	NA	NA	Użyj dowolnej wody ultraczystej lub wody dejonizowanej.  Napełnij pojemnik 900 ml płukania.
RNase	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1x	HyClone	SH30027.01
Osłona - PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	To jest to samo, co sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x  Ca++MG++ za darmo.  Napełnij pojemnik 900 ml pochwy.
Sterylizator	HyClone	SH30529.01
0.4%– 0,7% podchlorynu	VWR	JT9416-1	Jest to zdecydowanie 10% wybielacza Clorox, który można uzyskać, rozcieńczając wybielacz Clorox wodą. Napełnij pojemnik 200 ml sterylizatora.
Kolba T25	Falcon	353109
Kolba T75	Falcon	353136
Ogniwa TK6	MilliporeSigma	95111735