Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kontrolowanie frakcji cząstek w mikroporowatych rusztowaniach z wyżarzonymi cząstkami do hodowli komórek 3D

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64554

⸱

28 października 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

Minimalizacja zmienności frakcji cząstek w granulowanych rusztowaniach ułatwia powtarzalne eksperymenty. W pracy opisano metody generowania rusztowań ziarnistych o kontrolowanych frakcjach cząstek do zastosowań w inżynierii tkankowej in vitro.

Streszczenie

Mikrożele są budulcem rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP), które służą jako platforma zarówno do hodowli komórkowych in vitro, jak i naprawy tkanek in vivo. W tych ziarnistych rusztowaniach wrodzona porowatość generowana przez pustą przestrzeń między mikrożelami umożliwia infiltrację i migrację komórek. Kontrolowanie frakcji pustek i frakcji cząstek ma kluczowe znaczenie dla projektowania rusztowań MAP, ponieważ porowatość jest bioaktywną wskazówką dla komórek. Sferyczne mikrożele mogą być generowane na urządzeniu mikroprzepływowym w celu kontrolowania rozmiaru i kształtu, a następnie liofilizowane przy użyciu metod zapobiegających pękaniu sieci polimerowej. Po ponownym nawodnieniu liofilizowane mikrożele prowadzą do kontrolowanych frakcji cząstek w rusztowaniach MAP. Wdrożenie tych metod liofilizacji mikrożeli doprowadziło do powtarzalnych badań wykazujących wpływ frakcji cząstek na dyfuzję makrocząsteczek i rozprzestrzenianie się komórek. Poniższy protokół obejmie wytwarzanie, liofilizację i rehydratację mikrożeli do kontrolowania frakcji cząstek w rusztowaniach MAP, a także wyżarzanie mikrożeli poprzez bioortogonalne sieciowanie do hodowli komórek 3D in vitro.

Wprowadzenie

Rusztowania z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP) to podklasa materiałów ziarnistych, w których bloki budulcowe mikrożelu (μgel) są ze sobą połączone, tworząc masywne, porowate rusztowanie. Dzięki unikalnej mikroarchitekturze tych granulowanych rusztowań, wrodzona porowatość generowana przez pustą przestrzeń między połączonymi sferycznymi mikrożelami wspiera przyspieszoną infiltrację i migrację komórek1. Mikrożelowe elementy budulcowe rusztowań MAP mogą być wytwarzane zarówno z syntetycznych, jak i naturalnych polimerów z modyfikacjami chemicznymi2. Opisane tutaj metody kładą szczególny nacisk na stosowanie mikrożeli składających się ze szkieletu kwasu hialuronowego (HA) zmodyfikowanego funkcjonalnymi uchwytami norbornenu (NB). Funkcjonalny uchwyt NB na polimerze HA wspomaga reakcje chemiczne kliknięcia w celu tworzenia mikrożeli i łączenia ich ze sobą w celu wygenerowania rusztowań MAP3,4. Zastosowano wiele schematów łączenia ze sobą mikrożeli (tj. wyżarzania), takich jak enzymatic1, light-based5,6 i bez dodatków click chemistry3,7 reakcji. W niniejszej pracy opisano chemię kliknięć bez dodatków, wykorzystującą koniugację Dielsa-Aldera na odwrócony popyt elektronowy tetrazyny-norbornenu do łączenia mikrożeli HA-NB.

Aby wytworzyć rusztowania MAP, użytkownicy najpierw generują bloki budulcowe mikrożelu za pomocą odwrotnych emulsji w systemach wsadowych lub w urządzeniach mikroprzepływowych, a także za pomocą natrysku elektrohydrodynamicznego, litografii lub mechanicznej fragmentacji2. Produkcja sferycznych mikrożeli HA-NB została dobrze opisana i wcześniej opisana przy użyciu zarówno emulsji wsadowej2, jak i technik generowania kropel mikroprzepływowych8,9,10,11. W tej pracy sferyczne mikrożele HA-NB zostały wygenerowane na platformie mikroprzepływowej skupiającej przepływ w celu kontrolowania rozmiaru i kształtu, jak opisano wcześniej8,9,10. Po oczyszczeniu mikrożele znajdują się w zawiesinie wodnej i muszą być zagęszczone, aby wywołać stan zakleszczenia. Po zakleszczeniu mikrożele wykazują właściwości rozrzedzające ścinanie, dzięki czemu mogą funkcjonować jako materiały do wstrzykiwań, wypełniające przestrzeń1. Jedną z metod wywołania stanu zakleszczenia jest suszenie mikrożeli poprzez liofilizację lub liofilizację, a następnie ponowne uwodnienie wysuszonego produktu w kontrolowanej objętości12. Alternatywnie, nadmiar buforu można usunąć z zawiesiny mikrożelu poprzez odwirowanie przez sitko lub poprzez ręczne usunięcie buforu z granulki mikrożelu przez aspirację lub przy użyciu materiału absorpcyjnego. Jednak użycie wirowania do suszenia mikrożeli może generować bardzo zmienny zakres frakcji cząstek i frakcji pustych podczas tworzenia rusztowań ziarnistych12. Opisano techniki liofilizacji mikrożeli przy użyciu 70% IPA dla mikrożeli z glikolu polietylenowego (PEG)13, olejów fluorowanych dla mikrożeli żelatynowo-metakryloylowych (GelMa)14 i 70% etanolu dla mikrożeli HA12. Protokół ten przedstawia metody liofilizacji sferycznych mikrożeli HA przy użyciu 70% etanolu, standardowego odczynnika laboratoryjnego, w celu zachowania pierwotnych właściwości mikrożelu podczas procesu suszenia. Liofilizowane mikrożele HA mogą być ważone i ponownie uwodnione z wartościami wagowymi zdefiniowanymi przez użytkownika, aby kontrolować końcowe frakcje cząstek w rusztowaniach MAP12.

Ostatni krok w tworzeniu rusztowania MAP polega na wyżarzaniu mikrożeli w celu stworzenia masywnego, porowatego rusztowania1. Wykorzystując natywne komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej i stosując bioortogonalne schematy wyżarzania, rusztowania MAP służą jako biokompatybilna platforma zarówno do hodowli komórkowych in vitro, jak i naprawy tkanek in vivo3. Dzięki tym podejściom, rusztowania MAP mogą być wytwarzane z bloków konstrukcyjnych HA-NB ze zdefiniowanymi przez użytkownika frakcjami cząstek w celu ich zastosowania w zastosowaniach inżynierii tkankowej12. Poniższy protokół opisuje mikroprzepływową produkcję mikrożeli HA-NB, po której następuje liofilizacja i rehydratacja w celu kontrolowania frakcji cząstek w rusztowaniach MAP. Na koniec opisano etapy wyżarzania mikrożeli przy użyciu chemii bioortogonalnej do eksperymentów z hodowlami komórkowymi 3D in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wykonanie urządzenia mikroprzepływowego

  1. Miękka litografia
    UWAGA: Niniejszy protokół opisuje wykonanie urządzenia mikroprzepływowego z układem skupiania przepływu (flow-focusing) według projektu Wilsona i wsp.9. Protokół ten może być jednak zastosowany do dowolnego projektu urządzenia na płytce SU-8. Płytkę można przykleić taśmą do szalki Petriego, a następnie należy ją poddać silanizacji, aby zapobiec przyleganiu PDMS do struktur na płytce15.
    1. Wymieszać bazę elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) z utwardzaczem (patrz Tabela materiałów) w stosunku 10:1. Przygotować około 100 g, aby pokryć płytkę warstwą PDMS o grubości ~5 mm. Wlać mieszaninę PDMS na płytkę i odgazować w deskrypcie przez około 30 min. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza umieścić w piekarniku w temperaturze 60 °C na co najmniej 2 h w celu utwardzenia PDMS.
    2. Za pomocą noża ostrożnie obrysować obwód urządzenia, uważając, aby nie uszkodzić płytki, a następnie ostrożnie odlepić PDMS od płytki. Użyć wycinaka do biopsji o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów), aby stworzyć kanały wlotowe i wylotowe.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas wycinania otworów w urządzeniu mikroprzepływowym. Rozdarcia wokół kanałów wlotowych lub wylotowych mogą spowodować wycieki podczas produkcji mikrożeli.
    3. Użyć taśmy, aby usunąć kurz ze strony urządzenia z naniesionymi strukturami. Umieścić urządzenia oraz czyste szkiełka przedmiotowe na płycie grzejnej w temperaturze 135 °C przez co najmniej 15 min, aby usunąć wilgoć.
    4. W dygestorium użyć pistoletu do plazmy koronowej (patrz Tabela materiałów) na wysokim ustawieniu, traktując zarówno szkiełka, jak i urządzenia (odkrytą stronę ze strukturami) przez około 30 s, a następnie szybko je ze sobą połączyć. Delikatnie docisnąć, aby zapewnić szczelne połączenie urządzenia ze szkiełkiem. Umieścić urządzenia w piekarniku w temperaturze 60 °C na noc, aby utrwalić wiązanie.

2. Mikrofluidyczna produkcja mikrogeli kwasu hialuronowego (HA) z funkcjonalnymi uchwytami norbornenowymi (NB)

  1. Synteza HA-NB
    UWAGA: Synteza kwasu hialuronowego z norbornenem (HA-NB) została opracowana na podstawie metody Darlinga i wsp.3 przy użyciu sodowego HA o masie 79 kDa z ekwiwalentami molowymi jednostek powtarzalnych HA do chlorku 4-(4,6-dymetoksy-1,3,5-triazyn-2-ylo)-4-metylomorfolinium (DMTMM) i 5-norbornen-2-metyloaminy (NMA) w stosunku 1:1,5:2,5.
    1. Zważ substraty. Rozpuść HA w stężeniu 20 mg/ml w 200 mM buforze MES (pH ~6), mieszając w zlewce lub kolbie na mieszalniku magnetycznym. Po rozpuszczeniu dodaj DMTMM do roztworu HA i pozostaw do reakcji na około 20 min w temperaturze pokojowej. Na przykład: 1 g HA + 1,09 g DMTMM + 845 µL Można zastosować NMA.
    2. Dodawaj NMA kroplami do roztworu HA/DMTMM. Zamknij otwór naczynia reakcyjnego Parafilmem, aby zminimalizować parowanie, a następnie owiń naczynie folią. Kontynuuj mieszanie, pozwalając reakcji przebiegać przez około 24 h.
    3. Po 24 h schłodzić etanol o stężeniu 200 proof (około 10-krotność objętości reakcji). Za pomocą mieszadła magnetycznego przenieść kroplowo mieszaninę poreakcyjną do schłodzonego etanolu w celu wytrącenia HA-NB, a następnie kontynuować mieszanie przy 200–300 obr./min przez 20 min.
    4. Przenieść roztwór do probówek stożkowych o pojemności 50 ml, a następnie odwirować przy 5 000 x g przez 10 min. Odlać nadmiar etanolu i zutylizować go jako odpad. Na tym etapie produkt HA-NB powinien mieć postać białych grudek w probówkach stożkowych. Poddać HA-NB działaniu próżni w eksykancie w celu wysuszenia przez noc.
    5. Oczyścić HA-NB, używając rurek do dializy z celulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej 12-14 kDa (patrz Tabela materiałów). Rozpuścić HA-NB w 2 M roztworze NaCl i przenieść do rurki dializacyjnej. Związać rurkę i w razie potrzeby zabezpieczyć zaciskami. Przenieść wypełnioną rurkę dializacyjną do pojemnika z 5 L wody ultrapure i dializować HA-NB przeciwko wodzie przez noc.
    6. Następnego dnia usunąć wodę i zastąpić ją roztworem 1 M NaCl na 30 min. Usunąć roztwór NaCl, a następnie dializować przeciwko wodzie ultrapurej przez 3 dni, codziennie wymieniając wodę.
    7. Przefiltruj produkt po dializie za pomocą 0.2 µm przefiltrować za pomocą filtra próżniowego, a następnie przenieść przefiltrowany produkt do stożkowatych probówek o pojemności 50 mL.
    8. Nalać ciekły azot do pojemnika kriogenicznego i zamrozić gwałtownie probówki HA-NB przez 10 min. Następnie wyjąć probówki stożkowe za pomocą pęsety, szybko zdjąć nakrętkę i przykryć ją chusteczką laboratoryjną (patrz Tabela materiałów). Zabezpieczyć tkankę gumką recepturką i przenieść do pojemnika lub komory liofilizacyjnej (patrz Tabela materiałów) i poddać liofilizacji. Produkt liofilizowany przechowywać w temperaturze -20 °C.
      OSTRZEŻENIE: Ciekły azot jest substancją niebezpieczną. Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej.
    9. Oznacz ilość modyfikacji norbornenowej, rozpuszczając HA-NB w stężeniu 10 mg/ml w D2O i analiza poprzez spektroskopia NMR protonów (Rysunek 1A)16.
      1. Aby określić stopień funkcjonalizacji, najpierw skalibrować D2Sygnał rozpuszczalnika znajduje się przy 4,8 ppm. Przeprowadź całkowanie sygnału protonów metylowych HA (δ2,05) i skalibruj całkę do wartości 3,0. Następnie przeprowadź całkowanie sygnałów dla wiszących grup norbornenowych przy δ6,33 i δ6,02 (protony winylowe, endo). Znormalizuj całkę tych sygnałów względem odpowiadającej im liczby protonów, aby wyznaczyć średni stopień modyfikacji.3.
  2. Przygotowanie prekursora mikrożelu HA-NB
    1. Przygotować bufor HEPES 50 mM (pH 7,5) i przefiltrować bufor sterylnie za pomocą 0.2 µm filtr próżniowy. Z wykorzystaniem buforu HEPES przygotować odpowiednie roztwory zapasowe o stężeniu 50 mM fotoinicjatora fenylo(2,4,6-trimetylobenzoilo)fosfinianu litu (LAP) oraz reduktora tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP). Roztwór LAP przechowywać w ciemności.
    2. Przygotuj pozostałe komponenty prekursorów mikrożelu, sporządzając odpowiednie roztwory zapasowe o stężeniu 50 mM łącznika ditiolowego oraz peptydu RGD w sterylnej wodzie destylowanej. Odważ HA-NB i rozpuść w buforze HEPES, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml.
      UWAGA: W zależności od preferencji użytkownika do wewnętrznego sieciowania mikrogeli można zastosować różne łączniki ditiolowe. Wymieniono zarówno łącznik degradowalny (tj. rozszczepialny przez MMP), jak i niedegradowalny (ditiotreitol lub DTT) w Tabela materiałówPeptyd RGD jest zawarty w składzie mikrożelu w celu promowania adhezji komórek w rusztowaniach MAP, jednak komponent ten można usunąć i zastąpić równą objętością buforu HEPES.
    3. Połączyć komponenty prekursorowe o końcowych stężeniach 9,9 mM LAP, 0,9375 mM TCEP (4 thiol/TCEP), 2,8 mM łącznika ditiolowego, 1 mM peptydu RGD oraz 3,5% masowych (w/v) HA-NB, dodając dodatkowy bufor HEPES do uzyskania pożądanego końcowego wolumenu. Dokładnie wymieszać prekursor, używając pipety o dodatnim przemieszczeniu.
    4. Za pomocą pipety P1000 powoli pobierz całą mieszaninę. Umieść końcówkę na wylocie strzykawki o pojemności 1 ml i zdejmij końcówkę z pipety. Pociągnij tłok strzykawki, aby pobrać mieszaninę do strzykawki, a następnie dodaj 0.2 µm przefiltrować przez filtr zamocowany na końcówce strzykawki do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odwir掌握ować przefiltrowany roztwór prekursora, aby usunąć pęcherzyki powietrza powstałe podczas filtrowania.
    5. Ponownie, używając pipety P1000, powoli pobierz przefiltrowany prekursor, uważając, aby nie stworzyć pęcherzyków powietrza. W przypadku powstania pęcherzyków delikatnie stuknij końcówką pipety, aby się one oddzieliły i wypłynęły na powierzchnię.
    6. Nałóż końcówkę na wylot strzykawki o pojemności 1 mL, a następnie wyjmij końcówkę z pipety. Trzymając strzykawkę w pionie, powoli odciągnij tłok, aż cały roztwór prekursora znajdzie się w strzykawce. Do strzykawki dołącz igłę z tępym zakończeniem i wypchnij prekursor przez jej końcówkę. Owiń strzykawkę folią, aby zabezpieczyć ją przed światłem.
  3. Przygotowanie roztworu do ściskania mikrogeli
    1. Przygotować 5% v/v Span-80 w ciężkim białym oleju mineralnym i dokładnie wymieszać. Poddać działaniu desykatora w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Mieszaninę surfaktanta z olejem przechowywać w temperaturze pokojowej, owiniętą w folię. Przed każdym użyciem dokładnie wymieszać i poddać działaniu desykatora.
    2. Użyj strzykawki 5 ml, aby pobrać mieszaninę oleju i surfaktantu (minimalizując powstawanie pęcherzyków powietrza), aż odległość między tłokiem a uchwytem dla palców będzie w przybliżeniu równa odległości w strzykawce z prekursorem. Do strzykawki włóż igłę stuptową i wypchnij olej przez jej otwór.
  4. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego
    1. Do strzykawki o objętości 1 ml załóż tępą igłę i napełnij ją syntetycznym roztworem do obróbki hydrofobowej (patrz Tabela materiałów). Powoli przepuść roztwór przez urządzenie mikroprzepływowe, aż wypełni on każde wejście i wyjście. Pozostaw roztwór do wyschnięcia w urządzeniu na blacie laboratoryjnym przez około 30 min, a następnie wytwórz podciśnienie na wyjściu, aby usunąć nadmiar roztworu. Zabeziecz urządzenie za pomocą zacisków na mikroskopie stołowym.
    2. Owiń probówkę stożkową o pojemności 15 ml folią i umieść ją w statywie na probówki, aby służyła jako pojemnik do zbierania mikrożeli. Używając statywu z uchwytem, umieść sondę światła UV w otworze probówki zbiorczej. Użyj detektora UV (patrz Tabela materiałów) w celu pomiaru natężenia promieniowania UV, przesuwając sondę aż do uzyskania wartości 20 mW/cm²2 zostanie osiągnięte. Wyłączyć lampę UV do czasu późniejszego etapu.
    3. Utnij rurkę na długość, która pozwoli na połączenie urządzenia mikroprzepływowego z pojemnikiem zbiorczym. Na jednym końcu rurki wytnij 45° kąt. Delikatnie wsuń zagięty koniec rurki do kanału wylotowego.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas wkładania rurek do urządzenia mikroprzepływowego. Rozdarcia lub pęknięcia w obrębie kanałów wlotowych lub wylotowych mogą spowodować wycieki podczas produkcji mikrogeli.
    4. Zamocuj obie strzykawki z fazą prekursorową i olejową w pompie dwustrzykawkowej (patrz Tabela materiałów). Odetnij dwa kolejne odcinki rurek o długości umożliwiającej połączenie końcówek strzykawek z urządzeniem mikroprzepływowym. Na jednym końcu każdej rurki utnij 45° kąt. Starannie zamocuj rurkę (tępy koniec) na końcówkach obu strzykawek.
    5. Zmień ustawienia pompy dla strzykawki 1 ml i wprowadź przybliżoną objętość prekursora. Powoli przesuń pompę do przodu, aż zostanie przyłożona wystarczająca presja do tłoków strzykawek, aby wypchnąć zarówno olej, jak i prekursor do końców przewodów, usuwając w ten sposób powietrze z układu. Pozostaw układ na 5–10 min w celu wyrównania ciśnienia przed przejściem do kroku 2.4.6.
    6. Ostrożnie wprowadź ścięty koniec rurki do kanałów wlotowych urządzenia mikroprzepływowego, wprowadzając roztwór prekursora mikrogelu przez wlot przedni, a olej zwężający przez wlot tylny. Przesuwaj pompę do przodu małymi skokami, aż w urządzeniu pojawi się przepływ, a w obszarze ogniskowania przepływu zaczną tworzyć się sferyczne mikrogele. Uruchom pompę za pomocą 0.4 µL/min przepływ i pozostaw urządzenie włączone do momentu stabilizacji. W razie potrzeby dostosuj szybkość przepływu o ±0.1 µL/min w małych przyrostach, aby ustabilizować produkcję mikrożeli.
    7. Po ustabilizowaniu się procesu produkcji mikrożeli, co przedstawiono w Rycina 1Bwymień probówkę zbiorczą na nową i włącz lampę UV. Okresowo sprawdzaj przebieg procesu, aby upewnić się, że produkcja mikrożeli jest stabilna przez cały czas trwania analizy.

Diagram widm NMR kwasu hialuronowego; układ UV prekursora żelu mikroprzepływowego; wykresy rozkładu wielkości.
Rysunek 1: Mikroprzepływowa produkcja mikrogeli kwasu hialuronowego (HA) z uchwytami funkcjonalnymi norbornenowymi (NB). (A) Około 31% jednostek powtarzalnych HA zostało pomyślnie zmodyfikowanych NB, co określono za pomocą analizy protonowego NMR przeprowadzonej w tlenku deuteru. Przesunięcia 1H NMR zawieszonych norbornenów przy δ6,33 i δ6,02 (protony winylowe, endo) oraz δ6,26 i δ6,23 ppm (protony winylowe, exo) porównano z grupą metylową HA przy δ2,05 ppm, aby określić stopień funkcjonalizacji. Przedrukowano z Anderson et al.12 za zgodą Elsevier. (B) Schemat mikroprzepływowego urządzenia do ogniskowania przepływu (flow-focusing) użyttego do generowania µgeli HA-NB. (C) Do wizualizacji µgeli znakowanych fluorescencyjnie wykorzystano projekcje maksymalnej intensywności z mikroskopii konfokalnej (pasek skali = 500 µm). (D) Rozkłady częstotliwości średnic mikrogeli z niezależnych serii pomiarowych na układzie mikroprzepływowym wykazują kontrolę nad rozmiarem mikrogeli (~50 µm lub ~100 µm w zależności od użytego urządzenia). (E) Średnicę mikrogelu podano jako średnią i odchylenie standardowe dla każdej niezależnej serii. Przedrukowano z Wilson et al.9 za zgodą Wiley. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Oczyszczanie i suszenie mikrogeli

  1. Oczyszczanie mikrożeli
    1. Przygotować bufor do płukania mikrożeli (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mM CaCl2) oraz 2% (w/v) roztwór surfaktantu Pluronic F-127 w buforze do płukania. Roztwory wysterylizować za pomocą filtra próżniowego 0,2 µm.
    2. Wirować probówkę z mikrożelami (5 000 x g) przez 5 min. W komorze sterylnej ostrożnie odessać olejową fazę nadosadu. Połączyć µgele z 2% roztworem surfaktantu Pluronic F-127 w stosunku 1:1 i wymieszać za pomocą wortexa. Wirować (5 000 x g) przez 5 min i odessać płuczący roztwór nadosadu.
    3. Dodać bufor do płukania w ilości 4-krotności objętości mikrożeli i wymieszać za pomocą wortexa. Wirować mieszaninę (5 000 x g) przez 5 min i odessać roztwór płuczący. Powtórzyć proces płukania buforem 4–8 razy, aż surfaktant zostanie usunięty z układu (t.j. do momentu braku pęcherzyków powietrza).
  2. Znakowanie fluorescencyjne mikrożeli HA-NB
    UWAGA: Wewnętrzna synteza znakowanej fluorescencyjnie tetrazyny opiera się na dwóch następujących po sobie reakcjach addycji thiolu- Michaela katalizowanych zasadami, które zostały szczegółowo opisane i wcześniej zaraportowane3. W niniejszej pracy Alexa Fluor-488 sprzęgnięto z tetrazyną w celu znakowania µgeli zmodyfikowanych norbornenem. Liofilizowany produkt (Alexa Flour 488-Tet) rozpuszczono w dimetyloformamidzie w stężeniu 1 mg/mL i przechowywano w temperaturze -20 °C.
    1. Aby znakować fluorescencyjnie µgele, najpierw przygotować roztwór roboczy Alexa Fluor 488-Tet, rozcieńczając roztwór stokowy 1 mg/mL w stosunku 1:14 w sterylnym 1x PBS. W komorze sterylnej połączyć µgele z roztworem roboczym (w stosunku objętościowym 2:1).
    2. Użyć pipety wypierającej i dokładnie wymieszać. Inkubować mieszaninę przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
    3. Wirować (5 000 x g) i odessać roztwór barwiący. Przepłukać µgele dwukrotnie 1x PBS (w stosunku objętościowym 1:1), aby usunąć niezwiązany Alexa Fluor 488-Tet.
      UWAGA: Na tym etapie znakowane fluorescencyjnie µgele można obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu określenia wielkości mikrożeli (Ryc. 1C-E)9. Metody pomiaru wielkości mikrożeli zostały szczegółowo opisane przez Roosę i wsp.17.
  3. Suszenie mikrożeli HA-NB
    1. Przenieść oczyszczone µgele (Ryc. 2A) do probówki z zakrętką typu cryo-safe za pomocą pipety wypierającej. Dodać 70% etanol do oczyszczonych µgeli w stosunku 50% (v/v) i dokładnie wymieszać pipetą wypierającą. Wirować przez 5 min przy 5 000 x g.
      OSTROŻNIE: Etanol jest substancją wysoce łatwopalną.
      UWAGA: Probówkę cryo-safe z zakrętką można zważyć przed dodaniem µgeli, a następnie ponownie po liofilizacji, aby określić masę µgeli. Jest to zalecane w celu zminimalizowania błędu przy ilościach mniejszych niż 1 mg. Przed użyciem należy upewnić się, że waga jest wewnętrznie dostrojona lub skalibrowana.
    2. Odessać płynny nadosad i zastąpić go 70% etanolem (50% v/v) (Ryc. 2B). Dokładnie wymieszać pipetą wypierającą. Inkubować przez noc w 4 °C.
      UWAGA: Mikrożele można przechowywać w 70% etanolu w 4 °C przed liofilizacją w celu długoterminowego przechowywania, jeśli jest to konieczne. Liofilizowane mikrożele przedstawiono na Ryc. 2C. Na tym etapie można zastosować inne media liofilizacyjne, jeśli pożądane jest utworzenie kriożelu (Ryc. 2D).
    3. Krótko wirować, aby upewnić się, że µgele znajdują się na dnie probówki z zakrętką. Wlać ciekły azot do pojemnika kriogenicznego, a następnie włożyć probówkę z µgelami w celu szybkiego zamrożenia.
    4. Po 5–10 min wyjąć probówkę z µgelami za pomocą pęsety. Szybko zdjąć zakrętkę i przykryć chusteczką laboratoryjną. Przymocować chusteczkę gumką recepturką i przenieść do pojemnika lub komory liofilizacyjnej.
    5. Załadować próbkę do liofilizatora zgodnie z instrukcjami producenta. Liofilizować przy ciśnieniu 0,066 Torr i temperaturze -63 °C. Przechowywać liofilizowane µgele (lyo-µgele) w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze pokojowej.
      ​UWAGA: Liofilizacja jest zakończona, gdy cały płyn zostanie usunięty z probówki i pozostanie suchy produkt. Rozpuszczalniki organiczne mogą skracać żywotność gumowych uszczelek w powszechnie stosowanych systemach liofilizacyjnych.

proces liofilizacji μżeli; diagramy/wykresy; rehydratacja, efekty rozpuszczalnika, rozkład wielkości cząstek.
Rycina 2: Suszenie mikrożeli HA-NB. (A) Projekcja maksymalnej intensywności μżeli w roztworze wodnym (pasek skali = 100 µm). (B) Oczyszczone μżele można inkubować w stosunku 1:1 objętościowo w wybranym medium do liofilizacji, a następnie poddać liofilizacji. (C) Projekcja maksymalnej intensywności wysuszonych lio-μżeli (pasek skali = 100 µm). (D) Mikrożele są resuspendowane po liofilizacji. W celu zachowania pierwotnych właściwości μżeli w całym procesie liofilizacji zaleca się stosowanie EtOH (70%); jednakże inne media, takie jak alkohol izopropylowy (IPA), woda i acetonitryl (MeCN), mogą być stosowane zamiennie w celu ułatwienia tworzenia kriożeli (pasek skali = 100 lub 50 µm, zgodnie z oznaczeniem). (E) Pomiar średnicy mikrożeli HA-NB przed (szary) i po liofilizacji (zielony) w 70% EtOH, przedstawiony jako rozkłady częstotliwości dla trzech populacji mikrożeli. Przedrukowano z Anderson et al.12 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

4. Wytwarzanie rusztowania MAP

  1. Synteza łącznika tetrazynowego
    UWAGA: Łączniki tetrazynowe mogą być wykorzystywane do sieciowania µgels zawierającymi wolne grupy norbornenowe (Rycina 3AProcedura syntezy tetrazyny kwasu hialuronowego (HA-Tet) została opracowana na podstawie metody Zhang i wsp.18 stosując kwas hialuronowy (HA) sodowy o masie 79 kDa z ekwiwalentami molowymi jednostek powtarzalnych HA, DMTMM i tetrazyny-aminy w stosunku 1:1:0,25 (Rycina 3B)12.
    1. Odważ substraty. Rozpuść HA w stężeniu 20 mg/mL w 200 mM buforze MES (pH ~6), mieszając w zlewce lub kolbie na mieszalce magnetycznej. Po rozpuszczeniu dodaj DMTMM do roztworu HA i pozostaw do reakcji na około 20 min w temperaturze pokojowej. Przykładowo można zastosować 100 mg HA + 72,8 mg DMTMM + 14,14 mg tetrazyny-aminy.
    2. Rozpuścić tetrazynę z grupą aminową w stężeniu 15 mg/ml w 200 mM buforze MES i dodać kroplami do roztworu HA/DMTMM. Należy odnieść się do Rycina 3C do konfiguracji reakcji HA-Tet.
    3. Otwór naczynia reakcyjnego zabezpieczyć parafilmem, aby zminimalizować parowanie, a następnie naczynie przykryć folią. Kontynuować mieszanie, pozwalając na przebieg reakcji przez około 24 h.
    4. Po 24 h schłodzić etanol o stężeniu 200 proof (około 10-krotność objętości reakcji). Na mieszadle magnetycznym wkroplowo przenieść mieszaninę z reakcji do schłodzonego etanolu w celu wytrącenia HA-Tet (Rycina 3D) i kontynuuj mieszanie przez 20 min.
    5. Przenieś roztwór do stożkowych probówek o pojemności 50 ml, a następnie wiruj przy 5000 x g przez 10 min. Odlać nadmiar etanolu w celu utylizacji. Poddać HA-Tet próżni w deskrypatorze, aby wysuszyć go przez noc. Przykład wysuszonego produktu na tym etapie protokołu znajduje się w Rycina 3E.
    6. Oczyścić HA-Tet za pomocą dializy. Rozpuścić HA-Tet w 2 M roztworze NaCl i przenieść do celulozowej membrany dializacyjnej o granicy odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 12-14 kDa. Wypełnioną membranę dializacyjną przenieść do naczynia z 5 L wody ultrapure i dializować HA-Tet przeciwko wodzie przez noc.
    7. Następnego dnia usunąć wodę i zastąpić ją 1 M roztworem NaCl na 30 min. Usunąć roztwór NaCl, a następnie dializować przeciwko wodzie ultrapurej przez 3 dni, codziennie wymieniając wodę.
    8. Przefiltrować produkt po dializie, używając 0.2 µm filtr próżniowy, a następnie przenieść przefiltrowany produkt HA-Tet do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
    9. Szybko zamrozić probówki stożkowate w ciekłym azocie przez 10 min, a następnie wyjąć je pęsetą. Szybko zdjąć nakrętkę i przykryć chusteczką laboratoryjną. Przymocować chusteczkę gumką recepturką, przenieść do pojemnika lub komory liofilizacyjnej i poddać liofilizacji. Przechowywać liofilizowany produkt (Rycina 3F) przy -20 °C.
    10. Ilościowo określ modyfikację tetrazynową, rozpuszczając HA-Tet w stężeniu 10 mg/mL w D2O i analizowanie poprzez spektroskopia NMR protonów (Rycina 3G)16.
      1. Aby określić stopień funkcjonalizacji, w pierwszej kolejności należy skalibrować D2Sygnał rozpuszczalnika znajduje się przy 4,8 ppm. Zintegruj sygnał protonów metylowych HA (δ2,05) i skalibruj całkę do wartości 3,0. Następnie zintegruj sygnały dla bocznych grup tetrazynowych przy δ8,5 (2H) i δ7,7 (2H) (protony aromatyczne). Znormalizuj całki tych sygnałów do odpowiadającej im liczby protonów, aby wyznaczyć średni stopień modyfikacji.12.
  2. Sieciowanie lio-µgels do utworzenia rusztowań MAP w celu ich charakterystyki
    1. Przygotuj komponenty rusztowania MAP (t. j. µgels, HA-Tet, objętość rehydratacji). Odważ liofi-µgels (Rysunek 4A) i rozpuścić w 84% końcowej objętości MAP w 1x PBS. Pozostawić mikrożele do napęcznienia przez około 20 min (Rycina 4B,C). Procent masowy (wt%) MAP użyty do rehydratacji może zostać wybrany w zależności od preferencji użytkownika dotyczących końcowej frakcji cząstek (patrz Rycina 4D, E).
    2. Rozpuścić HA-Tet w 1x PBS w wybranym stężeniu (patrz UWAGA poniżej).
      UWAGA: Zmiana zarówno ułamka upakowania (poprzez (mas% MAP), a także stężenie HA-Tet będą wpływać na właściwości mechaniczne całej struktury rusztowania. Na przykład rusztowanie MAP o stężeniu 3,4 mas%, sieciowane przy użyciu 0,02 mg/mL HA-Tet (stosunek wyżarzania 2,6 mol Tet:mol HA-NB), generuje rusztowania MAP o module sprężystości G' wynoszącym około 700 Pa.12.
    3. Użyj pipety wypierającej, aby połączyć HA-Tet i lio-µgels i dobrze wymieszać. Na tym etapie mieszaninę można przenieść poprzez pipetą automatyczną na szkiełka przedmiotowe, płytki wielodołkowe lub do wybranego przez użytkownika pojemnika. Pozostawić µgels poddać procesowi wyżarzania w temperaturze 37 °C przez 25 min, a następnie za pomocą szpatułki przenieść rusztowania MAP do płytek dobrze wypełnionych 1x PBS. Przechowywać rusztowania MAP w 1x PBS do momentu rozpoczęcia charakterystyki.
  3. Obliczanie frakcji cząstek rusztowania MAP
    1. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu, przenieś rusztowanie MAP na szkiełko coverglass za pomocą szpatułki. Obrazuj rusztowania MAP przy użyciu mikroskopu konfokalnego, wykorzystując laser do wzbudzenia i emisji FITC. Obrazuj rusztowania MAP przy użyciu obiektywu 20x i wykonaj stos Z (Z-stack) obejmujący zakres 250-300 µm w kierunku osi Z z krokiem wynoszącym 2.5 µmZanotuj µm/pixekalibracja obrazu.
    2. Zaimportuj obraz stosu Z (Z-stack) do oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów). Wybierz Dodaj nowe powierzchnie przycisk. Zaznacz pole, aby Segmentacja wyłącznie obszaru zainteresowaniaa następnie należy wybrać przycisk z niebieską strzałką Następnie: obszar zainteresowania.
    3. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI), monitorując wymiary X, Y i Z analizowanej objętości. Wybierz przycisk z niebieską strzałką. Następny: Kanał źródłowy.
      UWAGA: Wymiary X i Y podano w pikselach, natomiast wymiar Z określa liczbę kroków. Zalecana wysokość Z dla obszaru zainteresowania powinna obejmować co najmniej dwa µgels.
    4. Użyj Kanał źródłowy lista rozwijana do wyboru kanału FITC. Zaznacz pole obok Gładki i wprowadź szczegół powierzchniowy 2.50 µmW sekcji Thresholding wybierz Intensywność bezwzględnaa następnie należy wybrać przycisk z niebieską strzałką Następny: Próg.
    5. Użyj sugerowanej wartości progu dla kanału FITC. Obróć projekcję 3D, aby ocenić jakość renderowania i w razie potrzeby wprowadzić korekty. Wybierz Następnie: Klasyfikacja powierzchni.
      UWAGA: Powrót Przycisk ten może służyć w razie potrzeby do edytowania poprzednich kroków procesu, takich jak wymiar Z.
    6. Sprawdzić, czy Liczba wokseli wynosi 10,0, a następnie należy wybrać przycisk z zieloną podwójną strzałką Zakończenie: Wykonaj wszystkie kroki tworzenia i zamknij kreator.
      UWAGA: Parametry renderowania objętościowego mogą zostać zapisane do analizy seryjnej, aby do wszystkich rusztowań zastosowano te same ustawienia.
    7. Aby wyeksportować dane, należy wybrać Statystyka karta, a następnie Szczegółowe tab. Użyj drugiego pola rozwijanego, aby wybrać zmienną TomWybierz przycisk dyskietki Eksport statystyk z ekranu wyświetlania do pliku i zapisz jako plik arkusza kalkulacyjnego (.xls) po wyświetleniu odpowiedniego monitu.
    8. Otwórz plik i użyj funkcji SUMA dla kolumny A Objętość aby wyznaczyć całkowitą objętość (µm3) z µgels w obszarze zainteresowania.
    9. Przelicz wymiary analizowanego obszaru zainteresowania z pikseli na µmUżyj µm/pixekalibrację obrazu z kroku 4.3.1 w celu przeliczenia wymiarów X i Y. Pomnóż wymiar Z (liczbę kroków) przez wielkość kroku dla obrazu, aby przeliczyć wymiar Z na µmOblicz objętość obszaru zainteresowania (µm3) poprzez pomnożenie wymiarów X, Y i Z.
    10. Aby określić frakcję cząstek rusztowania, należy podzielić całkowitą objętość µgels w obszarze zainteresowania (wyznaczonym w kroku 4.3.8) przez objętość obszaru zainteresowania (wyznaczoną w kroku 4.3.9).

Schemat ligacji tetrazynowej z układem reakcyjnym HA-Tet, przedstawiający syntezę, wytrącanie oraz wyniki NMR.
Rysunek 3Synteza łącznika tetrazynowego do wytwarzania rusztowań z mikroporowatych wyżarzonych cząstek (MAP). (A) Schemat HA-NB µgels połączone za pomocą łącznika tetrazynowego w celu utworzenia rusztowań MAP. (B) Schemat reakcji syntezy HA-Tet. (C) Reakcję HA-Tet przygotowano i pozostawiono do przebiegu przez noc, po czym (D) wytrącanie HA-Tet w etanolu. (EPo oczyszczeniu i wysuszeniu HA-Tet poddano rehydratacji i liofilizacji w celu uzyskania (F) wysuszony produkt o jasnoróżowym kolorze. (GAnaliza protonowego NMR wykazuje pomyślną modyfikację 11% jednostek powtarzalnych HA. Przedruk z Anderson et al.12 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rehydratacja liofilizowanych mikrogeli, mikroskopia; kontrola frakcji cząstek, analiza danych, wykres.
Rycina 4: Rehydratacja liofilizowanych mikrogeli do wytwarzania rusztowań MAP. (A) Projekcja maksymalnej intensywności wysuszonych lyo-µgels (pasek skali = 100 µm). (B) Wykazano, że po liofilizacji rehydratacja lyo-µgels trwa około 20 min (pasek skali = 100 µm). (C) Lyo-µgels można rehydratować przy różnych wartościach wt% MAP, aby uzyskać upakowane (jammed) µgels (pasek skali = 100 µm). (D) Zwiększenie wt% MAP podczas rehydratacji lyo-µgels zmienia frakcję cząstek w rusztowaniach MAP, co pokazują pojedyncze przekroje Z rusztowań MAP oraz projekcje objętościowe (pasek skali = 100 µm). (E) Dzięki zastosowaniu tych zdefiniowanych przez użytkownika wartości wt% MAP w rusztowaniach można uzyskać unikalne frakcje cząstek (NL = nieliofilizowane µgels). W próbkach (n = 3) przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem Tukey HSD; istotność statystyczną określono jako p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.005 (***) oraz p < 0.001 (****). Przedrukowano z Anderson et al.12 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek na rusztowaniach MAP

  1. Przygotowanie urządzeń do hodowli komórkowej
    1. Aby stworzyć niestandardowe urządzenie do hodowli komórkowej na potrzeby tych eksperymentów (Rycina 5A-C), należy użyć drukarki 3D do wydrukowania formy negatywowej, wykorzystując plik CAD znajdujący się w Uzupełniający plik z kodem 1.
      UWAGA: Wymiary urządzenia do hodowli komórkowej wynoszą: 94,9 mm x 94,9 mm x 4,8 mm, przy całkowitej wysokości studni wynoszącej 2,6 mm. Średnice studni wewnętrznych i zewnętrznych wynoszą odpowiednio 4 mm i 6 mm.
    2. Wymieszać bazę elastomeru polidimetylosiloksanowego (PDMS) z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1. Wlać mieszaninę PDMS do dużej plastikowej szalki Petriego i odgazować w eksykatorze przez około 30 min lub do momentu całkowitego zniknięcia pęcherzyków powietrza.
    3. Gdy wszystkie pęcherzyki powietrza znikną, ostrożnie umieść wydrukowaną w technologii 3D formę w PDMS, aby zminimalizować powstawanie nowych pęcherzyków. Umieść w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 h w celu utwardzenia PDMS.
    4. Za pomocą noża lub żyletki delikatnie obrysuj obwód urządzenia hodowlanego, a następnie ostrożnie usuń formę. Użyj wycinaka do biopsji o średnicy 4 mm, aby usunąć ewentualne pozostałości PDMS z dna dołków. Dotnij urządzenia tak, aby pasowały do szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Urządzenia do hodowli komórek mogą być również przytwierdzone do szkiełek przedmiotowych, jednak szklane zakryweczki poprawiają obrazowanie próbek.
    5. Użyj taśmy klejącej, aby usunąć kurz z dolnej strony urządzeń hodowlanych. Umieść czyste szkiełka nakrywki oraz urządzenia hodowlane (dolną stroną do góry) na płycie grzejnej w temperaturze 135 °C przez co najmniej 15 min w celu usunięcia wilgoci.
    6. W dygestorium użyj pistoletu do plazmy koronowej na wysokim ustawieniu, traktując zarówno szkiełko nakrywkę, jak i dolną stronę urządzenia przez 30 s, a następnie szybko połącz potraktowane powierzchnie. Delikatnie dociśnij elementy, aby zapewnić szczelne połączenie między urządzeniem hodowlanym a szkiełkiem nakrywką.
    7. Powtórz krok 5.1.6 dla wszystkich urządzeń, a następnie umieść w 60 °C pozostawić w piekarniku przez noc w celu utrwalenia wiązania. Przed użyciem wysterylizować urządzenia w autoklawie. in vitro.
  2. Hodowla komórkowa w rusztowaniach MAP
    1. Przygotuj komponenty rusztowania MAP (tj. µgels, HA-Tet, objętość medium) w zależności od pożądanej frakcji cząstek (patrz Rycina 4D-E). Odważ lio-µgels w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie zrekonstytuować w 84% końcowej objętości pożywki komórkowej z MAP, w zależności od wybranego procentowego stężenia wagowego (wt%) MAP. Pozostawić µgels pozostawić do napęcznienia przez około 20 min.
      UWAGA: Metody te wymagają zważenia produktu w postaci liofilizowanego mikrogelu w celu jego rehydratacji. W przypadku małych mas (1 mg lub mniej) sugeruje się uprzednie zważenie probówki kriogenicznej przed dodaniem substancji i liofilizacją. µgelsnastępnie należy ponownie zważyć probówkę po liofilizacji, aby określić masę produktu i zminimalizować błąd pomiarowy.
    2. Rozpuścić HA-Tet w pożywce komórkowej w objętości stanowiącej 16% końcowej objętości MAP.
      UWAGA: Poniższe kroki przygotowania komórek do zasiewu w rusztowaniach MAP mogą ulec zmianie w zależności od stosowanego typu komórek. W niniejszym protokole mezenchymalne komórki mysie D1 hodowano w modyfikowanej pożywce Eagle'a Dulbecco (DMEM) z dodatkiem 1% penicyliny i streptomycyny (pen-strep) oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz Tabela materiałów). W przypadku tych komórek należy stosować standardowe protokoły hodowli komórek adherentnych, utrzymując hodowle w 37 °C oraz 5% CO22 w naczyniach hodowlanych traktowanych do hodowli tkanek.
    3. Gdy mezenchymalne komórki mysie D1 osiągną 70%-80% konfluencji, odessać pożywkę i przemyć komórki 1x PBS. Odkleić komórki, dodając objętość 1% trypsyny-EDTA wystarczającą do pokrycia powierzchni naczynia hodowlanego. Inkubować w 37 °C przez 1–3 min, a następnie przerwać proces trypsynizacji poprzez dodanie pożywki DMEM uzupełnionej o 1% pen-strep i 10% FBS w objętości dwukrotnie większej niż objętość trypsyny z EDTA.
    4. Wirować zawiesinę komórkową przy 100 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu odwirowania komórek. Odessać medium z nadsączu i resuspenderć komórki w 1 ml medium DMEM uzupełnionego o 1% pen-strep oraz 10% FBS.
    5. Należy upewnić się, że zawiesina komórkowa została dobrze wymieszana, a następnie przenieść 20 µL do nowej probówki do mikrocentryfugi. Dodać 20 µL roztwór błękitu trypanu i dokładnie wymieszać. Należy użyć 20 µL tej mieszaniny w celu policzenia komórek przy użyciu hemocytometru lub automatycznego licznika komórek z zastosowaniem szkiełek do liczenia komórek.
    6. Przenieś liczbę komórek wymaganą do wysiewu 10 000 komórek/µL przenieść MAP do nowej probówki do mikrocentryfugi. Centryfugować przy 100 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu odwirowania komórek. Ostrożnie odessać znad osadu komórkowego pożywkę znad pelletu, uważając, aby nie odessać komórek.
    7. Dodaj µgels oraz czynnik sieciujący do osadu komórkowego za pomocą pipety wyporowej. Wymieszać dokładnie pipetą wyporową, a następnie wysiać 10 µL mieszaniny na studzienkę. Podczas wysiewania należy pipetować kolistymi ruchami, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę w studzience.
    8. Pozostawić µgels poddać procesowi wyżarzania w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 25 min przed dodaniem pożywki komórkowej w celu wypełnienia studni (~50 µL pożywki na studzienkę). Hodowle 3D należy utrzymywać w 37 °C i wymieniaj pożywkę w razie potrzeby. Aby uniknąć odessania rusztowania podczas wymiany pożywki, stabilizuj końcówkę pipety wzdłuż krawędzi górnej studni.
      UWAGA: Podczas dodawania lub usuwania cieczy z dołków hodowlanych należy oprzeć końcówkę pipety o krawędź nad rusztowaniem MAP, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia lub aspirations rusztowania z dołka.
    9. W wybranych punktach czasowych należy utrwalić próbki, usuwając medium i dodając 50 µL do każdego dołka 4% paraformaldehydu przez 30 min w temperaturze pokojowej. Przemyć próbki 3x za pomocą 50 µL 1x PBS lub preferowanego buforu. Na tym etapie protokołu można zastosować standardowe metody immunofluorescencji lub barwienia fluorescencyjnego, wykorzystując 50 µL na dołek, jako objętość robocza.
      UWAGA: Przedstawione metody fiksacji i barwienia komórek opisują konkretnie zastosowanie barwników fluorescencyjnych; jednak w tych rusztowaniach można również przeprowadzić immunobarwienie z użyciem koniugatów przeciwciał pierwotnych i/lub wtórnych, zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując 50 µL jako objętość roboczą na dołek.
    10. Obrazuj komórki w rusztowaniach MAP za pomocą mikroskopu konfokalnego z użyciem obiektywu 20x i uzyskaj stos Z (Z-stack) obejmujący 200-250 µm w kierunku osi Z z rozmiarem kroku wynoszącym 2.5 µmPrzykład barwienia fluorescencyjnego z użyciem DAPI (barwnik jądrowy rozcieńczony 1:1000 w 0,15% Triton-X w 1x PBS) oraz faloidyny-647 (barwnik F-aktyny rozcieńczony 1:40 w 0,15% Triton-X w 1x PBS) przedstawiono w Rysunek 5E, F z unieruchomionymi komórkami D1 hodowanymi w rusztowaniach MAP przez 3 dni.
      UWAGA: Obróbka plazmowa powierzchni szklanych prowadzi do zwiększenia hydrofilowości, co według doniesień nasila adhezję komórek. Prawdopodobnie zaobserwuje się rozprzestrzenianie komórek wzdłuż dna studzienek hodowlanych, jednak nie należy ich uwzględniać w zliczeniach komórek ani w kwantyfikacji objętości komórek podczas oceny odpowiedzi komórkowej w rusztowaniach MAP.

Kultura lyo-µgels w żelu MAP; proces siewania komórek, obrazy mikroskopowe, analiza różnych wartości wt%.
Rysunek 5: Hodowla komórkowa w rusztowaniach MAP. (A) Forma do tworzenia studzienek do hodowli komórkowej może być wydrukowana w 3D i odlana z PDMS. Cała forma ma średnicę 95 mm, duże studzienki mają średnicę 6 mm, a małe studzienki wewnętrzne mają średnicę 4 mm. (B) Po odlaniu z PDMS urządzenia do hodowli komórkowej są łączone z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą plazmy w celu poprawy możliwości mikroskopowych. (C) Przekrój poprzeczny studzienki do hodowli komórkowej przedstawia zbiornik na pożywkę komórkową (~50 µL) oraz mniejszy zbiornik do siewania komórek w rusztowanie MAP (~10 µL). (D) Proces siewania komórek w rusztowaniach MAP opiera się najpierw na rehydratacji lyo-µgels do pożądanego przez użytkownika stężenia wt%, a następnie na zmieszaniu ich z komórkami i sieciującym w celu powiązania µgels. (E) Komórki mogą być enkapsulowane w rusztowaniach MAP (zielone) o różnych wartościach wt% MAP. Reprezentatywne obrazy pochodzą z 5. dnia hodowli komórek D1 w rusztowaniach MAP (pasek skali = 100 µm). (F>) Pojedyncze przekroje Z wykazują różnice we wzroście komórek w rusztowaniach zawierających różne wartości wt% MAP (pasek skali = 50 µm). Przedrukowano z Anderson et al.12 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP) z bio-ortogonalnym schematem sieciowania, jak również kontrolowanych frakcji cząstek do hodowli komórek 3D. Po pierwsze, kwas hialuronowy zmodyfikowano za pomocą grup wisiorków norbornenu, które miały być stosowane zarówno w tworzeniu mikrożeli, jak i łączeniu w celu utworzenia rusztowań MAP. Korzystając z tych metod, około 31% powtarzających się jednostek HA zostało z powodzeniem zmodyfikowanych za pomocą fun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazano, że mikroprzepływowa produkcja mikrożeli HA-NB generuje mikrożele o węższym zakresie rozkładu wielkości niż produkcja seryjnaemulsji 3,9. Mikrożele opisane w tym protokole zostały sformułowane przy użyciu rozszczepialnego środka sieciującego MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) w celu wsparcia degradacji materiału. Jednak mikrożele HA-NB można również sieciować przy użyciu alternatywnego łącznika di-tiolowego, takiego jak ditiotreitol (DTT), który ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

ARA i TS złożyły tymczasowy patent na tę technologię.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Narodowym Instytutom Zdrowia, Narodowym Instytutom Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599), oraz Narodowemu Instytutowi Alergii i Chorób Zakaźnych (1R01AI152568). Prace te zostały częściowo wykonane w Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), członku North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), która jest wspierana przez National Science Foundation (numer nagrody ECCS-2025064) w ramach National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Autorzy chcieliby podziękować byłemu post-doc laboratorium, dr Lucasowi Schirmerowi, a także Ethanowi Nicklowowi za ich pomoc w generowaniu wydrukowanego w 3D urządzenia do eksperymentów z kulturami komórkowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawka Luer-Lok sterylna, jednorazowego użytku, poliwęglanBD309628
5 ml strzykawka Luer-Lok sterylna, jednorazowego użytku, poliwęglanBD309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimidInvitrogenA10254Do syntezy znakowanej fluorescencyjnie tetrazyny
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287Do barwienia próbek kultur komórkowych
Folia aluminiowaVWR89107-726
Dziurkacz do biopsji z tłokiem, 1,0 mmIntegra Miltex69031-01
Dziurkacz do biopsji, 4 mmIntegra Miltex33-34
igła, 23 G 0,5", niesterylna, z nakrętkąSAI Infusion TechnologiesB23-50
Butelkowy filtr próżniowy, 0,22 μ mCorningCLS430521
Chlorek wapniaVWR1B1110Do buforu do mycia mikrożeli
Zespoły kapilarno-tłokowe do pipet wyporowych, 1000 μ L maksymalna objętośćZespoły
do pipet wyporowych, 25 μ L maksymalna objętość17008605
Rainin do pipet wyporowych, 250 μ L maksymalna objętośćRainin17008608
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10228
Countess II FL Automatyczny licznik komórekInvitrogenAMQAF1000
Probówka wirówkowa, 15 mlCELLTREAT667015B
Probówka wirówkowa, 50 mlCELLTREAT229421
Chloroform, klasa ACS, szklana butelkaStellar ScientificCP-C7304Do syntezy znakowanego fluorescencyjnie tetrazyny
Corona pistoletu plazmowego, BD-10A Generator wysokiej częstotliwościETP11011
Fiolki CryoTube, polipropylen, gwint wewnętrzny z nakrętkąNunc368632
Mysie komórki mezenchymalneD1 ATCCCRL-12424Przykładowa linia komórkowa do hodowli w żelach MAP
DAPISigma-AldrichD9542Do barwienia próbek kultur komórkowych
Tlenek deuteru, 99,9% atomu DSigma-Aldrich151882Do spektroskopii NMR
Rurki do dializy, membrana z regenerowanej celulozy, odcięcie masy cząsteczkowej 12-14 kDaSpectra/Por132703Do oczyszczania HA-NB i HA-Tet
Eter dietylowyVWRBDH1121-4LPCDo syntezy tetrazyny znakowanej fluorescencyjnie
DimetyloformamidSigma-Aldrich277056Do syntezy znakowanego fluorescencyjnie chlorku
4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyno-2-ylo)-4-metylomorfoliniowego tetrazyny (DMTMM) TCI-ChemicalsD2919Do modyfikacji HA
Ditiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0861Niedegradowalny łącznik ditiolu (substytut peptydu rozszczepialnego MMP)
Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, wysoki poziom glukozy, z 4500 mg / L glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu i wodorowęglanem sodu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowychSigma-AldrichD6429-500MLDla D1 hodowla komórkowa
EMS Paraformaldehyd, granulowanyVWR100504-162Do wytwarzania 4% absolutu etanolu PFA
(200 dowodów)KOPTEC89234-850
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ATCC30-2020Do hodowli komórek D1
Płyta grzewczaKopf InstrumentsHP-4M
ze szkłem nakrywkowymDaigger Scientific
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowy (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Hialuronian sodu, średnia masa cząsteczkowa 79 kDa, wytwarzany przez bakterie Streptococcus zooepidemicus, klasy farmaceutycznej, zanieczyszczenie mikrobiologiczne < 100 jtk/g, endotoksyny bakteryjne < Do syntezy HA-Tet użyto 0,050 j.m./mgContiproN/Aśredniej masie cząsteczkowej 79 kDa, ale metody te można dostosować do innych mas cząsteczkowych.
Pakiet oprogramowania IMARIS EssentialsOxford InstrumentsN/A Oprogramowaniedo analizy obrazów mikroskopowych
Pompa infuzyjna, podwójna strzykawkaChemyxN/A
KimwipeKimberly-Clark34120
Statyw laboratoryjny z uchwytem laboratoryjnymGeyer212100
Ciekły azotAirgasNI 180LT22
Fosforynian fenylo(2,4,6-trimetylobenzoilo)fosfinianu lituTCI-ChemicalsL0290
LiofilizatorLabconcoN/ALabconco FreeZone 6 plus został wycofany z produkcji, ale do tego protokołu można używać innych liofilizatorów konsolowych klasy laboratoryjnej.
Metylotetrazyna-PEG4-maleimidKerafastFCC210Do syntezy znakowanego fluorescencyjnie tetrazyny
Kwas 2-(4-Morfolino)etan sulfonowy (MES)Fisher ScientificBP300-100Do modyfikacji HA
Szkło nakrywkowe Micro, 24 x 60 mm nr 1VWR48393-106
Urządzenie mikroprzepływowe SU8 wafel głównyFlowJemNiestandardowy projekt wykonany we własnym zakresie czysty pokój lub zlecany na zewnątrz
Olej mineralny, ciężkiSigma-Aldrich330760
MMP-rozszczepialny peptyd sieciujący ditiol (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)GenScriptN/A
5-norborneno-2-metyloaminaTCI-Chemicals95-10-3Do syntezy HA-NB
Taśma pakowaScotch3M 1426
ParafilmBemisPM996
PEG(tiol)2JenKem Technology USAA4001-1Do syntezy znakowanej fluorescencyjnie tetrazyny
Penicylina-Streptomycyna, 10 000 jednostek/mlThermo Fisher Scientific15140122Do hodowli komórek D1
szalka Petriego, polistyren, jednorazowe, Średnica x H=150 x 15 mmCorning351058
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Do mycia HMP
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xGibco10010023
RainX wodoodporna powłoka szklanaGrainger465D20Syntetyczny roztwór hydrofobowy do obróbki urządzeń mikroprzepływowych
Peptyd RGD (Ac-RGDSPGERCG-NH2)GenScriptN/A
GumkiZszywki112417
Chlorek soduChem-Impex30070Do dializy
Span 80 do syntezySigma-Aldrich1338-43-8
Sylgard 184 Elastomer silikonowyMikroskopia elektronowa Science4019862elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS) do wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych i urządzeń do hodowli tkankowej
Filtr strzykawkowy, Whatman Uniflo, 0,2 μ m PES, średnica 13 mmCytvia09-928-066
Mikroskop cyfrowy Tetraview LCDCelestron44347
Sól tetrazynoaminowo-aminowa HClChem-Impex35098Do syntezy HA-Tet
TrietyloaminaSigma-Aldrich471283Do syntezy znakowanej fluorescencyjnie tetrazyny
Tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Millipore Sigma51805-45-9
Triton X-100VWR97063-864
Niebieski roztwór trypanu, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsyna EDTA (0,25%), czerwień fenolowaFisher Scientific25-200-056Do podnoszenia przylegających komórek do nasion w żelach MAP
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Rurki medyczne, Średnica igły=23, Grubość ścianki=0.020 in, Średnica wewnętrzna = 0.020, Zewnętrzna średnica = 0,060 calaThomas Scientific1204G82
, LX500 LED OmniCure010-00369R
Głowica utwardzająca UV, punktowy miernikLED OmniCureN/A
, identyfikowalnyVWR61161-386
Eksykator próżniowyBel-Art08-594-15C
Precyzyjny nóż uniwersalny X-Acto serii ZXZ3601WElmer's
kapilarno-tłokowe Rainin 17008609 Zespoły kapilarno-tłokowe Hemacytometr EF16034F o Sterownik systemu utwardzania UV światła UV UV

Bibliografia

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
  5. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  6. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  7. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).
  8. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).
  9. Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).
  10. Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  11. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).
  12. Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
  13. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  14. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  15. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).
  16. JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  17. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).
  18. Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
  19. Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
  20. Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
  21. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).
  22. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).
  23. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  24. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  25. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147(2019).
  26. Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Liofilizacja mikrogelitrójwymiarowa hodowla komórkowamikrofluidalne generowanie mikrogelihydrożele granularnesieciowanie bioortogonalneinfiltracja komórekmikroskopia konfokalnacytometria przepływowa
Kontrolowanie frakcji cząstek w mikroporowatych rusztowaniach z wyżarzonymi cząstkami do hodowli komórek 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.