Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64557

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Streszczenie

Mięśnie szkieletowe zawierają odrębne populacje dorosłych komórek macierzystych, które przyczyniają się do homeostazy i naprawy tkanki. Komórki macierzyste mięśni szkieletowych (MuSC) mają zdolność do tworzenia nowych mięśni, podczas gdy komórki progenitorowe fibro-adipogenne (FAP) przyczyniają się do rozwoju tkanek podporowych zrębu i mają zdolność do tworzenia fibroblastów i adipocytów. Zarówno MuSC, jak i FAP znajdują się w stanie przedłużonego odwracalnego wyjścia z cyklu komórkowego, zwanego spoczynkiem. Stan spoczynku jest kluczem do ich funkcjonowania. Spokojne komórki macierzyste są zwykle oczyszczane z wielu tkanek mięśniowych połączonych razem w jednej próbce. Jednak ostatnie badania wykazały wyraźne różnice w profilach molekularnych i głębokości spoczynku MuSC wyizolowanych z różnych mięśni. Niniejszy protokół opisuje izolację i badanie MuSC i FAP z poszczególnych mięśni szkieletowych oraz przedstawia strategie przeprowadzania analizy molekularnej aktywacji komórek macierzystych. Szczegółowo opisuje, jak izolować i trawić mięśnie o różnym pochodzeniu rozwojowym, grubości i funkcji, takie jak przepona, triceps, gracilis, piszczel przednia (TA), brzuchaty łydki (GA), płaszczkowaty, prostownik palca długiego (EDL) i mięśnie żwaczy. MuSC i FAP są oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analizowane przez barwienie immunofluorescencyjne i test inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU).

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe mają wysoką zdolność do regeneracji dzięki obecności komórek macierzystych mięśni (MuSCs). MuSC znajdują się na włóknach mięśniowych, pod blaszką podstawną i znajdują się w stanie spoczynku przedłużonego, odwracalnego wyjścia z cyklu komórkowego1,2,3,4. Po uszkodzeniu, MuSC aktywują się i wchodzą w cykl komórkowy, dając początek amplifikującym się progenitorom, które mogą różnicować się i łączyć, tworząc nowe włókna mięśniowe2,5. Wcześniejsze prace wykazały, że MuSC są absolutnie niezbędne do regeneracji mięśni6,7,8. Co więcej, pojedynczy MuSC może wszczepiać i generować zarówno nowe komórki macierzyste, jak i nowe włókna mięśniowe9. Mięśnie szkieletowe zawierają również populację mezenchymalnych komórek zrębowych zwanych włóknisto-adipogennymi komórkami progenitorowymi (FAPs), które odgrywają kluczową rolę we wspieraniu funkcji MuSC podczas regeneracji mięśni6,10,11,12.

Ze względu na ich potencjał do koordynowania regeneracji mięśni, pojawiło się ogromne zainteresowanie zrozumieniem, jak działają MuSC i FAP. Spoczynkowe MuSC są oznaczone ekspresją czynników transkrypcyjnych Pax7 i Sprouty1 oraz receptora kalcytoniny białka powierzchniowego komórki, podczas gdy spoczynkowe FAP są oznaczone przez receptor alfa płytkowego czynnika wzrostu białka powierzchniowego na powierzchni komórki (PDGFRa)10,12,13,14,15. Wcześniejsze badania wykazały, że MuSC i FAP można oczyścić z mięśni szkieletowych za pomocą markerów powierzchni komórek i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Chociaż protokoły te znacznie rozwinęły możliwości badania MuSC i FAP, jedną z wad jest to, że większość z tych protokołów wymaga izolacji MuSC z puli różnych tkanek mięśniowych. Ostatnie prace przeprowadzone przez nas i innych naukowców ujawniły różnice w fenotypie komórki i poziomach ekspresji genów między MuSC wyizolowanymi z różnych tkanek22,23. MuSC z przepony, tricepsa i gracilis wykazują szybszą aktywację niż MuSC z mięśni dolnych kończyn tylnych22, podczas gdy MuSC z mięśnia zewnątrzgałkowego wykazują szybsze różnicowanie niż MuSC z przepony i dolnych mięśni kończyn tylnych23.

Ten protokół opisuje izolację MuSC i FAP od poszczególnych mięśni szkieletowych (Rysunek 1). Obejmuje to rozwarstwienie przepony, tricepsa, gracilis, piszczela przedniego (TA), płaszczkowatego, prostownika długiego palca (EDL), mięśnia brzuchatego łydki (GA) i mięśni żwaczy. Wypreparowane mięśnie są następnie dysocjowane przez trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy II (proteazy, która specyficznie celuje w sekwencję aminową Pro-X-Gly-Pro w kolagenie, umożliwiając degradację tkanki łącznej i dysocjację tkanek24) i dispazę (proteazę, która rozszczepia fibronektynę i kolagen IV, umożliwiając dalszą dysocjację komórek25). MuSC i FAP są izolowane z zawiesin jednokomórkowych za pomocą FACS. Jako przykłady dalszych testów do analizy komórek, aktywację komórek macierzystych określa się przez oznaczenie inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), podczas gdy czystość komórek określa się przez barwienie immunofluorescencyjne dla markerów specyficznych dla typu komórki Pax7 i PDGFRa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Aarhus i lokalnymi przepisami etycznymi.

UWAGA: Upewnij się, że przestrzegasz przepisów lokalnej komisji etycznej dotyczącej eksperymentów na zwierzętach i postępowania z pośmiertnymi próbkami gryzoni. Myszy są potencjalnym źródłem alergenów; Jeśli to możliwe, włącz wentylację wyciągową i umieść ją nad miejscem pracy, aby uniknąć nadmiernego narażenia na alergeny. Alternatywnie noś maskę na twarz, jeśli eksperyment jest przeprowadzany regularnie. Protokół ten obejmuje pracę z ostrymi narzędziami, a badaczom zaleca się zapoznanie się z procedurami i logistyką udzielania pierwszej pomocy w przypadku skaleczenia.

1. Przygotowanie (1-2 h; dzień przed preparacją)

UWAGA: Roztwory, płytki i podłoża są przygotowywane w sterylnych warunkach i filtrowane (0,45 μm) przed użyciem, chyba że zaznaczono inaczej. Przygotować roztwory podstawowe dypazy (11 j./ml w PBS) i kolagenazy II (1.000 j./ml w PBS) i przechowywać je w temperaturze -20 °C (Tabela 1). Zapasy są rozmrażane i wykorzystywane do wtórnego roztwarzania w kroku 4.2.6.

  1. Powłoka kolagenowa 96-dołkowej płytki półpowierzchniowej
    1. Przygotuj kwaśną wodę. Dodać 5,15 ml lodowatego kwasu octowego do 895 ml autoklawowanej wody w zlewce o pojemności 2 l.
    2. Przefiltrować roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm, 500 ml. Przenieś 800 ml przefiltrowanej kwaśnej wody do butelki o pojemności 1 l.
    3. Do butelki dodać 40 ml sterylnego roztworu wyjściowego kolagenu. Delikatnie wymieszać roztwór, mieszając i przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, aż do użycia.
    4. Pokryj jedną lub więcej 96-dołkowych półpłytek kolagenem. Dodać 50 μl roztworu powlekającego kolagen do każdego dołka i pokryć płytkę przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.
    5. Następnego dnia odessać roztwór kolagenu za pomocą aspiratora próżniowego i umyć płytkę 2x, dodając 100 μl autoklawizowanej wody i odsysając.
    6. Przechyl pokrywę talerza i pozostaw talerz do wyschnięcia w okapie na 20-30 minut.
    7. Gdy talerz całkowicie wyschnie, zawiń go w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Powlekane talerze można przechowywać do 4 tygodni.
      UWAGA: Powłoka kolagenowa umożliwia adhezję komórek. Ważne jest, aby zmyć wolny kolagen, ponieważ może on zakłócać funkcjonowanie komórek i sygnalizację (np. wiązanie kolagenu V z receptorami kalcytoniny na MuSCs)26.

2. Przygotowanie (0,5 godziny; dzień sekcji):

  1. Przygotowanie dodatkowych rozwiązań i przestrzeni roboczej
    1. Przygotować sterylną pożywkę myjącą, dodając 50 ml surowicy końskiej i 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 445 ml pożywki F10 firmy HAM. Pracuj w okapie z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    2. Obliczyć i zważyć odpowiednią ilość kolagenazy II potrzebną do przygotowania buforu dysocjacyjnego. (Dla każdej myszy 26 000 jednostek kolagenazy II jest używane do wytworzenia 40 ml buforu dysocjacyjnego przy 650 U/ml kolagenazy II). Dodać zważony proszek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać na lodzie.
    3. Przygotuj dwie 10-centymetrowe naczynia do izolacji mięśni. Wlać 3 ml pożywki do płukania (tabela 1) do każdej szalki Petriego. Wynieś 10-centymetrowe naczynia na zewnątrz okapu z przepływem laminarnym do późniejszego użycia.
    4. Przygotuj materiały do trawienia mięśniowego. Na podstawie liczby próbek oznacz odpowiednią liczbę stożkowych probówek o pojemności 50 ml (osiem na mysz, po jednej na każdy mięsień) i pozostaw je na stole. Spryskaj igły, strzykawki o pojemności 10 ml i sitka do komórek 40 μm 70% etanolem (po osiem na mysz, po jednym na każdy mięsień) i umieść je w okapie z przepływem laminarnym. Przymocować igły do strzykawek.
    5. Przygotuj materiały do sortowania. Oznaczyć probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml nakrętkami z sitkiem na komórki w zależności od liczby próbek. Przykryj rurki folią aluminiową i pozostaw je w okapie z przepływem laminarnym.
    6. W zależności od liczby sortowanych próbek i populacji należy przygotować 1,5 ml probówek wirówkowych z 500 μl pożywki do przemywania do pobierania komórek (16 na mysz, jedna probówka na każdą populację komórek na tkankę mięśniową). Przechowuj te probówki na lodzie.

3. Rozwarstwienie mięśni (20-30 min)

UWAGA: Ta część protokołu jest przeprowadzana w niesterylnym środowisku. Zabieg można przeprowadzić przy użyciu jednej lub kilku myszy. Jednak jedna mysz wystarcza do przygotowania zarówno próbek do sortowania, jak i kontroli do ustawiania kompensacji i bramek FACS.

  1. Inicjowanie izolacji mięśni
    1. Przygotuj niesterylne miejsce pracy do rozwarstwienia i izolacji mięśni. Zdezynfekuj stanowisko pracy 70% etanolem. Umieść sterylną jednorazową podkładkę ochronną na stanowisku pracy.
    2. Za pomocą markera permanentnego narysuj pudełko dla każdego mięśnia na pokrywie szalki Petriego, aby później umieścić izolowany mięsień.
    3. Spryskaj narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.
    4. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 i/lub zwichnięcie szyjki macicy.
    5. Izoluj poszczególne mięśnie (od jednej myszy na raz, jeśli używasz kilku myszy). Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zwilżyć sierść i zdezynfekować skórę. Umieść mysz na podkładce brzuchem skierowanym do góry. Przegląd wszystkich ośmiu mięśni i ich lokalizacji anatomicznej jest pokazany na Rysunek 2A.
  2. Izolowanie mięśni gracilis
    1. Użyj nożyczek, aby wykonać 0,5 cm poziome nacięcie w skórze brzucha.
    2. Usuń skórę: Obiema rękami użyj kciuka i palca wskazującego, aby chwycić górną i dolną część nacięcia. Pociągnij po obu stronach nacięcia, aby rozerwać i rozchylić skórę tułowia i kończyn dolnych. Pociągnij w dół skórę kończyny dolnej, aby odsłonić obie kończyny tylne (w dół od biodra do palców). Podobnie pociągnij w górę, aby odsłonić tułów.
    3. Zlokalizuj mięsień gracilis (wewnętrzna strona uda). Używając zakrzywionych kleszczy, chwyć za gracilis i lekko unieś mięsień (Rysunek 2B). Za pomocą nożyczek wykonaj 0,5 cm nacięcie (Rysunek 2C), z którego wycina się gracilis i całkowicie izoluje (Rysunek 2D). Powtórz to dla drugiej nogi, aby odizolować drugi mięsień gracilis.
  3. Izolowanie mięśni TA i EDL (dolna kończyna tylna, strona brzuszna)
    1. Za pomocą skalpela przeciąć powięź, wykonując 0,5 cm nacięcie wzdłuż bocznej strony kości piszczelowej (najgrubsza dolna kość kończyny tylnej). Użyj zakrzywionych kleszczy, aby chwycić powięź i pociągnij, aby ją zdjąć.
      UWAGA: Gdy powięź została całkowicie usunięta, ścięgna na dystalnym końcu tylnej nogi są widoczne i można je rozdzielić.
    2. Użyj prostych kleszczyków z bardzo cienkimi końcówkami, aby przejść między dystalnym ścięgnem TA (boczna strona kości piszczelowej) a EDL (poniżej TA) (Rysunek 2E-G).
      UWAGA: Wraz z doświadczeniem zamiast prostych kleszczy można użyć końca ostrza skalpela.
    3. Przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięśnie.
    4. Przynieś proste kleszcze z powrotem do dystalnego końca. Przetnij dystalne ścięgno.
    5. Delikatnie chwyć dystalne ścięgno mięśnia zakrzywionymi kleszczami. Podnieś mięsień do góry i nad jego bliższy przyczep i ostrożnie przetnij ścięgno proksymalne jak najbliżej jego punktu przyczepu. Odetnij drugi koniec i przenieś TA na szalkę Petriego.
    6. Użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby przejść pod dystalnym ścięgnem EDL.
    7. Przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięśnie.
    8. Przynieś proste kleszcze z powrotem do dystalnego końca. Przetnij dystalne ścięgno bez uszkadzania mięśnia.
    9. Delikatnie chwyć dystalne ścięgno EDL za pomocą zakrzywionych kleszczy. Podnieś mięsień do góry i nad jego bliższy przyczep i ostrożnie przetnij ścięgno proksymalne jak najbliżej jego punktu przyczepu. Odetnij drugi koniec i przenieś EDL na szalkę Petriego. Powtórz tę czynność dla drugiej kończyny tylnej, aby wyizolować drugi mięsień TA i EDL.
  4. Izolacja mięśni górnokadłubowych i płaszczkowatych (dolna kończyna tylna, strona grzbietowa)
    1. Użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby wejść między ścięgno Achillesa a dolne kości kończyn tylnych.
    2. Przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięsień.
    3. Przynieś proste kleszcze z powrotem do dystalnego końca. Przetnij ścięgno dystalne.
      UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia mięśnia płaszczkowatego, który znajduje się pod GA, przeciąć jak najbliżej jego dystalnego przyczepu ścięgna Achillesa, pozostawiając kawałek ścięgna przyczepionego do GA (Rysunek 2H).
    4. Aby odsłonić i wyizolować mięsień płaszczkowaty, pociągnij GA w górę i nad kością strzałkową (najcieńsza kość z dwóch kości w dolnej kończynie tylnej).
      UWAGA: Mięsień płaszczkowaty wyróżnia się charakterystycznym ciemnoczerwonym kolorem w stosunku do GA (Rysunek 2I).
    5. Zlokalizuj ścięgno proksymalne mięśnia płaszczkowatego. Za pomocą prostych kleszczy wejdź między płaszczkowaty i GA.
    6. Przesuń kleszcze w kierunku dystalnego końca mięśnia, aby oddzielić płaszczkowaty od GA.
    7. Najpierw odizoluj płaszczkowaty. Przetnij ścięgno bliższe, chwyć ścięgno zakrzywionymi kleszczami i ostrożnie podnieś mięstek płaszczkowaty, aby uzyskać dostęp do dystalnego ścięgna. Przeciąć dystalne ścięgno, aby odizolować płaszczkowaty od GA. Umieść płaszczkowaty na szalce Petriego z podłożem do mycia (Rysunek 2J)
    8. Pokrój GA i umieść go na szalce Petriego. Powtórz to dla drugiej nogi, aby odizolować drugi mięsień płaszczkowaty i GA.
  5. Izolacja mięśni trójgłowych (górna kończyna przednia, strona grzbietowa)
    1. Użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby wejść między mięsień trójgłowy a kość ramienną (główną kość górnej części kończyny przedniej) (Ryc. 2K-M).
    2. Przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięsień. Przetnij bliższy koniec mięśnia.
    3. Chwyć bliższy koniec tricepsa zakrzywionymi kleszczami i pociągnij go w górę i nad łokciem, aby uzyskać dostęp do dystalnego ścięgna. Przetnij dystalne ścięgno tricepsa, przenieś mięsień na szalkę Petriego i powtórz procedurę dla drugiej kończyny przedniej.
  6. Izolowanie mięśni żwaczy
    1. Usuń sierść i skórę ze szczęki. Wykonaj poziome nacięcie 0,5 cm nożyczkami. Używając obu rąk, uszczypnij po obu stronach nacięcia kciukiem i palcem wskazującym. Usuń skórę, pociągając w górę i w dół.
    2. Zlokalizuj główne ścięgno żwacza (ogonowe, poniżej oka). Włóż płaskie ostrze skalpela między kość a mięsień (Rysunek 2N). Przetnij ścięgno.
    3. Chwyć główne ścięgno żwacza za pomocą zakrzywionych kleszczy. Przetnij go ostrzem skalpela lub nożyczkami w kierunku rostralnym, aby oddzielić mięsień żwacza od kości szczęki (Rysunek 2O, P). Umieść izolowany mięsień żwacza na szalce Petriego. Powtórz procedurę dla drugiego mięśnia żwacza.
  7. Izolowanie mięśnia przepony
    UWAGA: Podczas izolowania mięśnia przepony należy pamiętać o ostrożnym cięciu, aby uniknąć przecięcia narządów wewnętrznych i jelit, ponieważ jest to źródło zanieczyszczenia.
    1. Za pomocą nożyczek wykonaj torakotomię (nacięcie między żebrami) w środku mostka (długa płaska kość, znajdująca się pośrodku klatki piersiowej, która łączy żebra) i przetnij mostek (Rysunek 2Q).
    2. Odsłoń membranę, przecinając klatkę piersiową o 360°.
    3. Oddziel górną część ciała od dolnej części/brzucha. Za pomocą nożyczek przetnij tchawicę, przełyk, żyłę główną i aortę brzuszną.
    4. Oddziel membranę od dolnej części ciała. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię (chirurgiczne nacięcie w jamie brzusznej) 1 cm poniżej mostka i wykonaj cięcie 360° (Ryc. 2R).
    5. Umieść zamknięte nożyczki między klatką piersiową a narządami jamy brzusznej i dociśnij. Delikatnie pociągnij za klatkę piersiową, aby oddzielić ją od narządów jamy brzusznej (Rysunek 2S).
    6. Oddziel membranę od klatki piersiowej. Luźno przytrzymaj membranę między dwoma palcami i przetnij klatkę piersiową nożyczkami. Użyj nożyczek, aby przyciąć membranę jak najbliżej żeber w cięciu 360°. Umieść izolowaną membranę na szalce Petriego.
      UWAGA: Podczas zwichnięcia szyjki macicy przepona może pęknąć i zapaść się na klatkę piersiową, co utrudnia jej zlokalizowanie. Mięsień można nadal izolować. Zidentyfikuj zapadnięty mięsień, przytrzymaj go między dwoma palcami i przetnij 360° wzdłuż klatki piersiowej.

4. Trawienie mięśniowe do zawiesiny jednokomórkowej (~1 h 35 min)

UWAGA: Następujące kroki obejmują niesterylne (kroki 4.1-4.2) i sterylne środowisko pracy (krok 4.3).

  1. Trawienie mechaniczne
    1. Umieść odizolowane mięśnie w pokrywie szalki Petriego o średnicy 10 cm.
    2. Za pomocą zakrzywionych kleszczy chwyć izolowane mięśnie jeden po drugim. W przypadku mięśnia płaszczkowatego i GA usuń pozostałe części ścięgna Achillesa.
    3. Za pomocą nożyczek zmiel izolowane mięśnie jeden po drugim, krojąc je na około 1 mm3 kawałki.
  2. Trawienie enzymatyczne
    1. Przygotować bufor dysocjacyjny do mięśni, dodając 40 ml pożywki do płukania na zimno do zważonego proszku kolagenazy II (kolagenaza II: 650 U/ml w podłożu do mycia).
      UWAGA: Użyj świeżo przygotowanego buforu dysocjacji mięśni, aby zapewnić optymalną aktywność enzymatyczną.
    2. Przenieść zmielone mięśnie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml buforu dysocjacyjnego.
    3. Inkubować probówkę przez 35 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 60 obr./min.
    4. Po inkubacji dodać pożywkę do płukania do całkowitej objętości 15 ml. Wirować probówkę o sile 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać supernatant do objętości 4 ml za pomocą aspiratora próżniowego. Aby uniknąć zakłócenia osadu, powoli zasysaj od góry i usuń pływający tłuszcz.
    6. Rozmrozić podwielokrotności zapasowe dypazy i kolagenazy II. Dodać 500 μl roztworu kolagenazy II (1 000 j./ml podstawy, -20 °C) do pozostałych 4 ml próbki. Następnie dodać 500 μl roztworu dypazy (11 U/ml bulionu, -20 °C).
      UWAGA: Dyspaza może generować osad. W takim przypadku należy odwirować roztwór podstawowy dypazy o sile 10 000 x g, 1 minutę przed użyciem. Przenieść teraz przezroczysty supernatant do zawiesiny komórkowej bez naruszania osadu.
    7. Krótko wymieszać próbki, aby rozpuścić osad.
    8. Inkubować próbki przez 20 minut w łaźni wodnej wytrząsającej o temperaturze 37 °C przy 60 obr./min.
      UWAGA: Trawienie dużej liczby próbek mięśni jest czasochłonne. W przypadku kroków 4.3.1-4.3.6 należy oszacować czas na próbkę w ciągu 2-5 minut. Ten krok przebiega szybciej, gdy jest wykonywany równolegle przez dwóch lub więcej badaczy.
  3. Homogenizacja próbek
    1. Homogenizować zawiesinę komórkową. Przenieść zawiesinę z probówki o pojemności 15 ml do probówki o pojemności 50 ml. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 20G, aby ponownie zawiesić próbkę, przeciągając próbkę w górę iw dół przez igłę 5x.
      UWAGA: Jeśli kawałki niestrawionego mięśnia zatkają igłę, zetrzyj je na papierowej chusteczce.
    2. Umieść sitko do komórek o pojemności 40 μm na nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    3. Pobrać pełną zawiesinę komórek do strzykawki i przecedzić próbkę do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z sitkiem do komórek na górze. Odcedź próbkę, dozując całkowitą objętość bezpośrednio na filtr.
    4. Aby pobrać wszystkie komórki jednojądrowe, dodać 20 ml pożywki płuczkowej do pustej stożkowej probówki i przelać ją przez sitko do komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej odcedzoną próbkę. Odzyskaj pozostałą objętość pod sitkiem za pomocą pipety p1000.
    5. Odrzucić sitko do komórek i obracać próbkę w temperaturze 1,600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Pipetując pipetą p1000, odessać supernatant bez naruszania osadu.
    7. Pipetując pipetą p1000, ponownie zawiesić osad membrany w 500 μl medium myjącego i ponownie zawiesić pozostałe próbki mięśni w 300 μl medium do płukania każda.
      UWAGA: Przepona jest największym z mięśni o największej zawartości komórek macierzystych i dlatego może być używana do barwienia kontrolnego.

5. Barwienie i sortowanie (~40 min + 30 min sortowania/próbki)

UWAGA: Pracuj w sterylnym środowisku na lodzie dla następujących kroków.

  1. Przenieść 50 μl podwielokrotności zawiesiny komórek diafragmy do czterech nowych probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml do barwienia kontrolnego (po 50 μl każda). Dodać 250 μl medium myjącego do każdej probówki kontrolnej do końcowej objętości 300 μl.
  2. Dodać 3 μl (1:100) przeciwciał fluorescencyjnych minus jeden (kontrola FMO) do trzech kontrolnych probówek barwiących i pozostawić jedną probówkę bez przeciwciał (kontrola niebarwiona) (patrz tabela 2).
  3. Dodać 3 μl (1:100) przeciwciał (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC i SCA1-PacificBlue) do pozostałych zawiesin pojedynczych komórek mięśniowych, w tym do pozostałej próbki przepony.
  4. Inkubować zawiesiny komórek przez 15 minut w temperaturze 4 °C w wytrząsarce typu head-over-head.
    UWAGA: Barwienia kontrolne są niezbędne do określenia poziomów fluorescencji tła i ustawienia bramek dla cytometrii przepływowej. Można stosować różne przeciwciała, ale każde z nich będzie miało określone stężenie robocze i czas inkubacji, które należy przetestować. Jeśli stosowane są przeciwciała od różnych dostawców, stężenie, a tym samym rozcieńczenie, może się różnić. Do mieszaniny barwiącej można dodać barwnik żywotności komórek, aby wyeliminować martwe lub umierające komórki podczas sortowania.
  5. Wirować próbki w temperaturze 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu przez pipetowanie.
  6. Pipetując pipetą p1000, każdą próbkę należy ponownie zawiesić w 800 μl medium myjącego.
  7. Przefiltrować próbki za pomocą probówki FACS z nasadką sitową (40 μm) w celu usunięcia wszelkich pozostałych grudek komórek (lub agregatów).
  8. Umyj sitko do komórek, dodając dodatkowe 800 μl medium myjącego.
  9. Próbki należy przechowywać przykryte folią aluminiową na lodzie do czasu analizy.
    UWAGA: Jeśli w tym momencie zawiesina komórek wydaje się mętna/gęsta z powodu wysokiego stężenia komórek, dodaj dodatkowe 800 μl pożywki płuczącej, aby zmniejszyć gęstość komórek.
  10. Uruchom FACS za pomocą dyszy 70 μm.
  11. Użyj niebarwionych kontrolek i FMO, aby ustawić strategię bramkowania: MuSC są ujemne dla CD45-FITC, CD31-FITC i SCA1-PacBlue oraz dodatnie dla VCAM1-PECy7; FAP są ujemne dla CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 i dodatnie dla SCA1-PacBlue.
  12. Posortować wybarwione zawiesiny jednokomórkowe za pomocą sortowania dwukierunkowego i zebrać MuSC i FAP do oddzielnych probówek zbiorczych zawierających 500 μl pożywki płuczącej.
    UWAGA: Stosując FACS z czterema laserami (konfiguracja: dysza 70 μm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm), wybrana kombinacja fluoroforów nie wymaga kompensacji sygnału fluorescencji. Jednakże w przypadku stosowania innego cytometru przepływowego lub innej kombinacji fluoroforów zaleca się dodatkowe jednobarwne próbki kontrolne w celu kompensacji. W przypadku mniejszych mięśni (EDL, płaszczkowaty, TA) należy spodziewać się wydajności 3 000 MuSC i 5 000 FAP. W przypadku innych większych mięśni należy spodziewać się wydajności 20 000 MuSC i FAP. Liczba zdarzeń podana przez oprogramowanie FACS może odbiegać od rzeczywistej liczby żywotnych komórek w probówce zbiorczej. Numery komórek można potwierdzić poprzez zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
  13. Odwirowywać posortowane komórki w temperaturze 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pipetując pipetowanie, odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  14. Dodać 100 μl pożywki płuczącej do każdej próbki i ostrożnie ponownie zawiesić komórki, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Przenieść 100 μl zawieszonej próbki na pokrytą kolagenem płytkę 96-dołkową o połowie powierzchni. Płytka 1,000-3,000 komórek na studzienkę.
    UWAGA: Jeśli komórki nie zostaną prawidłowo zawieszone, mogą sklejać się ze sobą w grudkach, zakłócając późniejsze analizy mikroskopowe.
  15. Sprawdź komórki pod mikroskopem i zwróć uwagę na ich rozmieszczenie, kształt i rozmiar.
  16. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Komórki przylegają w ciągu 2 godzin
    UWAGA: Zaleca się potwierdzenie czystości pobranych populacji komórek, albo przez analizę cytometrii przepływowej (poprzez załadowanie podwielokrotności posortowanej próbki do sortera i zarejestrowanie niewielkiej liczby zdarzeń), albo przez barwienie przeciwciałami posianych komórek, a następnie pod mikroskopią (Pax7 jest markerem definiującym mysie MuSC, PDGFRa jest znacznikiem definiującym FAP myszy). Począwszy od sekcji 7 poniżej, znajduje się protokół barwienia komórek pod kątem poziomów białka Pax7 i PDGFRa.

6. Test inkorporacji EdU

UWAGA: Pracuj w sterylnych warunkach i używaj dygestorium chemicznego podczas pracy z paraformaldehydem (PFA) do następujących kroków. EdU jest analogiem nukleotydowym wbudowanym w DNA, gdy komórki przechodzą przez fazę S cyklu komórkowego. W wysokich stężeniach jest mutagenny. Zawsze noś rękawice podczas obchodzenia się z EdU. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi postępowania z odpadami EdU.

  1. Puls EdU (dzień 1)
    1. Przygotować roztwór roboczy 2x EdU w świeżym podłożu myjącym.
    2. Wyjąć 96-dołkową płytkę z komórkami z inkubatora. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby monitorować zbieganie się. Przenieś się do okapu z przepływem laminarnym.
    3. Usunąć 50 μl pożywki z płytki za pomocą pipetowania. Dodać 50 μl 2x roztworu roboczego EdU, tak aby końcowa objętość w studzience wynosiła 100 μL.
    4. Hodować komórki w obecności EdU przez zamierzony okres czasu w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Czas i czas trwania impulsu EdU mogą się różnić. Średnio wyciszone MuSC potrzebują 2 dni, aby w pełni aktywować się i zakończyć swój pierwszy podział komórek19. EdU można dodać do posortowanych komórek natychmiast po posiewaniu.
  2. Fiksacja (dzień 2)
    UWAGA: PFA jest czynnikiem rakotwórczym. Zawsze należy obchodzić się z PFA ostrożnie. Zapoznaj się z lokalnymi przepisami dotyczącymi obchodzenia się z PFA i utylizacji odpadów.
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z komórkami z inkubatora. Sprawdź komórki pod mikroskopem i przenieś płytkę do dygestoria.
    2. Pipetując usuń pożywkę i utrwal komórki, dodając 50 μl 4% PFA do każdego dołka. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w dygestorium chemicznym.
    3. Usuń PFA za pomocą pipety i wyrzuć go do odpowiedniego pojemnika na odpady.
    4. Umyj komórki, dodając 100 μl PBS do wszystkich studzienek. Pipetując pipetowanie, odessać PBS i powtórzyć pranie. Przechowywać komórki w 100 μl PBS.
      UWAGA: Aby uniknąć wypłukania jakichkolwiek komórek, dozuj PBS na bok studzienki, powoli pipetując.
  3. Etykietowanie EdU
    1. Przepuszczalność komórek przed wykryciem EdU poprzez usunięcie PBS i dodanie 100 μl 0,5% Triton X-100 do PBS. Inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Triton X-100 jest środkiem powierzchniowo czynnym i może powodować podrażnienia skóry. Obchodź się z nimi ostrożnie i zawsze używaj rękawiczek.
    2. Po 5 minutach odessać Triton X-100 i dodać 100 μl PBS.
    3. Przygotuj mieszankę reakcyjną EdU typu click-chemistry zgodnie z protokołem producenta.
    4. Odessać PBS i dodać 33 μl mieszaniny reakcyjnej EdU z klikanym klikiem. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać mieszaninę reakcyjną EdU typu click-chemistry i przemyć komórki 100 μl PBS.
    6. Odessać PBS, dodać 100 μl PBS za pomocą Hoechst (1:2 000) i inkubować pod osłoną przed światłem przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać Hoechst i przemyć dwukrotnie, dodając 100 μl PBS. Przechowywać komórki w 100 μl PBS w temperaturze 4 °C w ciemności.
    8. Wyobraź sobie komórki pod mikroskopem odwróconym. Komórki mogą być przechowywane w ciemności przez wiele miesięcy, o ile studzienki nie wyschną.
      UWAGA: Możliwe jest współbarwienie komórek przeciwciałami. W takim przypadku należy przejść do etapu blokowania, a następnie inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Wybrać przeciwciało drugorzędowe ze sprzężonym fluoroforem, którego widmo emisyjne nie pokrywa się z widmem emisji fluoroforu używanego do wykrywania EdU. Należy upewnić się, że nie stosuje się przeciwciał drugorzędowych z fluoroforami pokrywającymi się z zakresem widmowym Hoechst.

7. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: Ta część protokołu może być wykonywana niezależnie od sekcji 6. Pomijając sekcję 6, wykonaj kroki 6.3.1 i 6.3.2, aby włączyć przenikanie komórek, zanim przejdziesz do kroku 7.2 poniżej.

  1. Wyjąć płytkę zawierającą komórki znakowane EdU.
  2. Przygotować 20 ml buforu blokującego, dodając 2 ml surowicy osła do 18 ml PBS.
  3. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, należy usunąć 100 μl PBS z każdej studzienki i dodać 50 μl buforu blokującego za pomocą pipety p200. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem i pokryć folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu znakowanego fluoroforem EdU.
    UWAGA: Ogniwa są przymocowane do dna studzienki, ale mogą się odczepić, jeśli podczas pipetowania zostanie przyłożona zbyt duża siła.
  4. Blokując próbki, przygotuj pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał. Dodaj 8,0 μl (1:100) mysiego anty-Pax7 i króliczego anty-PDGFRa do 800 μl buforu blokującego, aby wybarwić 16 dołków (osiem tkanek, dwa typy komórek).
  5. Po zablokowaniu usuń surowicę osła i dodaj 50 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C, przykrytą folią aluminiową.
  6. Po inkubacji usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i dodać 50 μl Trytonu (0,5% w PBS) do każdego z dołków. Inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem, w celu wypłukania niezwiązanego przeciwciała. Powtórz pranie trzy razy.
  7. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał wtórnych, dodając 1,0 μl (1:1 000) osła anty-mysz-Alexa647 i osła anty-królika-Alexa555 do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1,000 μl buforu blokującego.
  8. Dodać 33 μl głównej mieszanki przeciwciał wtórnych do każdego z dołków. Inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem.
  9. Usunąć nadmiar przeciwciała drugorzędowego przez pipetowanie, dodać 50 μl Trytonu (0,1% w PBS) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Powtórz pranie trzy razy.
  10. Na koniec dodaj 100 μl PBS. Zdecydować, czy natychmiast zobrazować płytkę za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z chłodzoną kamerą CCD, czy też przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy, uszczelniając krawędzie płytki parafilmem i owijając zapieczętowaną płytkę folią aluminiową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem izolacji poszczególnych mięśni szkieletowych (Rysunek 2), mięśnie smukły, piszczelowy przedni (TA), prostownik długi palców (EDL), brzuchaty (GA), płaszczkowaty, trójgłowy, żwacz oraz przepona zostały wyizolowane od trzech samców myszy szwajcarskich z linii outbred, które zostały wycofane z lokalnego programu hodowlanego (Rysunek 2). Po dysocjacji tkanek i barwieniu przeciwciałami, komórki satelitarne mięśni (MuSCs) oraz komórki progenitorow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W realizacji tego protokołu kluczowe jest kilka kroków, aby osiągnąć dobre plony. Poszczególne mięśnie mają małą objętość w porównaniu z ilością mięśni używanych w protokołach izolacji masowej. Powoduje to ryzyko wysuszenia mięśnia podczas rozwarstwienia, co zmniejsza wydajność. Aby temu zapobiec, ważne jest, aby dodać pożywkę do mięśni natychmiast po rozbiorze. Ponadto, jeśli sekcja trwa dłużej, skórę można usuwać z jednej kończyny na raz, aby skrócić czas ekspozycji mięśni na powietrze. Mniejsza objętość powoduje równi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Sortowanie komórek zostało przeprowadzone w FACS Core Facility, Aarhus University, Dania. Figury zostały stworzone przy użyciu Biorender.com. Dziękujemy dr J. Farupowi za podzielenie się króliczym przeciwciałem anty-PDGFRa. Prace te zostały wsparte grantem AUFF Starting Grant dla E.P. oraz grantami Start Package od NovoNordiskFonden dla E.P. (0071113) i A.D.M. (0071116).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 1,5 ml (testowana pod kątem wydajności PCR, PP, 30 000 xg, bez DNA/DNazy/RNazy, niskie wiązanie DNA, sterylna)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S72.706.700Probówka 1,5 ml
Probówka 15 ml (PP/HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNazy/RNazy, niecytotoksyczne, wolne od pirogenów, sterylne)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S62.554.502Probówka
15 mlProbówka okrągłodenna z polistyrenu o pojemności 5 mlFalcon, Fisher Scientific 352054Probówka FACS bez nasadki sitka
5 ml polistyrenu Probówka okrągłodenna z nakrętką sitka Falcon, Fisher Scientific   352235Probówka FACS z nasadką sitka
Probówka 5 ml (PP, niesterylna autoklawowalna)Kolekcja VWR525.0946Probówka 5 ml
50 ml (PP / HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNazy/RNazy, niecytotoksyczna, wolna od pirogenów, sterylna)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S62.547.254Probówka 50 ml
Alexa Fluor 555 IgG przeciw królikowi osłowi (H+L)Invitrogen, Thermo FisherLot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 osioł-anty mysz IgG (H+L)Invitrogen, Thermo FisherLot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3BDFACS, Główny zakład Wirówka uniwersytecka w Aarhus
5810eppendorfEP022628188Wirówka
Click-iT EdU Zestaw do proliferacji komórek do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 488Invitrogen, Thermo FisherLot: 2387287 (Cat# C10337)Zestaw do proliferacji komórek
Kolagen ze skóry cielęcej Bioodczynnik, Sigma Aldrich Źródło: SLCK6209 (Cat# C8919)
Kolagenaza typu IIWorthington, Fisher Scientific Numer działki: 40H20248 (cat# L5004177 )Collagenase
DispaseGibco, Fisher Scientific Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )Dispase
Donkey surowica (niesterylna)Sigma Aldrich, MerckLot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mmDumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1606.327Kleszcze proste z cienkimi końcówkami
Dumont nr. 7, 115 mmDumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1606.335Kleszcze
zakrzywioneF-10 Mieszanka odżywcza (Szynka) (1x), +L-glutaminaGibco, Fisher Scientific Lot. 2453614 (kat# 31550-023)
FITC anty-mysz CD31BioLegend, NordicBioSiteMEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45BioLegend, NordicBioSite30-F11 (Cat# 103108)
Lodowaty kwas octowy (100%)EMSURE, Merck   K44104563 9Kot # 1000631000)
Głowica nad głową rotator mini-tube Fisher Naukowy 15534080 (Model nr 88861052)Rotator z minirurką nad głową
Serum dla koniGibco, Fisher Scientific Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15FisherBrand, Fisher Scientific15325887kąpieli wodnej
MS2 IKA Jednostka wirowa
Igła 20 G (0,9 mm x 25 mm)BD mikrolance, Fisher Scientific Igła 30482720G 
Neutralny bufor formalinowy 10%CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/SPartia: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Niepirogenne sitko do komórek (40 &mikro; M)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S83.3945.040Sitko do komórek 
Pacific Blue anty-myszy Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend, NordicBioSiteD7 (Cat# 108120)
Pax7 pierwotne przeciwciałoDSHBLot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x koncentrat w proszkuFisher BioReagents, Fisher ScientificBP665-1
PE/Cy7 anty-mysie CD106 (VCAM1)BioLegend, NordicBioSite429 (MVCAM. A) (Kat # 105720)
Pióro/paciorkowiecGibco, Fisher Scientific Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Końcówki do pipet p10Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific2140-05Końcówki do pipet o niskiej retencji, wstępnie sterylizowane, Końcówki do
pipet p1000Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific2279-05Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące
Końcówki do pipet p20Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific2149P-05Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące
Końcówki do pipet p200Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific2069-05Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące
Podkład ochronnyAbena ACTC-7712  60 x 40 cm, 8 warstw
Rainin, pipet-lite XLSMettler Toledo, Thermo Scientific 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05Pipety (P10, P20, P200, P1000)
Rekombinowany anty-PDGFR-alfaRabMAb, abcamAB134123
Skalpel (trzonek nr 3)Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1902.502Skalpel
Ostrze do skalpela nr 11Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1902.0911Skalpel
Scanlaf marsLabogeneSzafka klasy 2: Skaner laboratoryjny MarsFlow
ScanROlympus, Główny obiekt Uniwersytet w Aarhus
NożyczkiFST14568-09
Seria 8000 Inkubator DHThermo Scientific3540-MAR
Pipeta serologiczna 10 mlVWR612-3700Sterylna, niepirogenna
pipeta serologiczna 5 mlVWR, Avantor dostarczone przez VWR612-3702Sterylna, niepirogenna
strzykawka 5 mL, końcówka Luer (6%), sterylna BD Emerald, Fisher Scientific307731Strzykawka
TC Dish 100, standardSarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S83.3902Szalka Petriego 
Powierzchnia poddana kulturze tkankowej (TC), polistyren, płaskie dno, sterylna, pokrywka, opakowanie 20 sztukCorning, Sigma Aldrich376496-dołkowa półdolna płyta
Triton X-100Sigma Aldrich, MerckŹródło: SLCJ6163 (Cat # T8787)
Mini-shaker do

Bibliografia

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  2. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
  4. Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
  5. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  7. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  8. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  9. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
  10. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  11. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  12. Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  13. Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  14. Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
  15. Fukada, S. -I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
  16. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  17. Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124(2007).
  18. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476(2011).
  19. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  20. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  21. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
  22. de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
  23. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
  24. Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
  25. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  26. Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
  27. van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
  28. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  29. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  30. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  31. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832(2019).
  32. Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036(2015).
  33. Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
  34. Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  35. de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spoczynkowe kom rki macierzystekom rki macierzyste mi ni szkieletowychfibro adipogenne kom rki progenitoroweizolacja mi nisortowanie kom rek aktywowane fluorescencjbarwienie immunofluorescencyjnewbudowywanie EdUtrawienie tkanekzawiesina pojedynczych kom rekaktywacja kom rek macierzystych
Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.