Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mięśnie szkieletowe zawierają odrębne populacje dorosłych komórek macierzystych, które przyczyniają się do homeostazy i naprawy tkanki. Komórki macierzyste mięśni szkieletowych (MuSC) mają zdolność do tworzenia nowych mięśni, podczas gdy komórki progenitorowe fibro-adipogenne (FAP) przyczyniają się do rozwoju tkanek podporowych zrębu i mają zdolność do tworzenia fibroblastów i adipocytów. Zarówno MuSC, jak i FAP znajdują się w stanie przedłużonego odwracalnego wyjścia z cyklu komórkowego, zwanego spoczynkiem. Stan spoczynku jest kluczem do ich funkcjonowania. Spokojne komórki macierzyste są zwykle oczyszczane z wielu tkanek mięśniowych połączonych razem w jednej próbce. Jednak ostatnie badania wykazały wyraźne różnice w profilach molekularnych i głębokości spoczynku MuSC wyizolowanych z różnych mięśni. Niniejszy protokół opisuje izolację i badanie MuSC i FAP z poszczególnych mięśni szkieletowych oraz przedstawia strategie przeprowadzania analizy molekularnej aktywacji komórek macierzystych. Szczegółowo opisuje, jak izolować i trawić mięśnie o różnym pochodzeniu rozwojowym, grubości i funkcji, takie jak przepona, triceps, gracilis, piszczel przednia (TA), brzuchaty łydki (GA), płaszczkowaty, prostownik palca długiego (EDL) i mięśnie żwaczy. MuSC i FAP są oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analizowane przez barwienie immunofluorescencyjne i test inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU).
Wprowadzenie
Mięśnie szkieletowe mają wysoką zdolność do regeneracji dzięki obecności komórek macierzystych mięśni (MuSCs). MuSC znajdują się na włóknach mięśniowych, pod blaszką podstawną i znajdują się w stanie spoczynku przedłużonego, odwracalnego wyjścia z cyklu komórkowego1,2,3,4. Po uszkodzeniu, MuSC aktywują się i wchodzą w cykl komórkowy, dając początek amplifikującym się progenitorom, które mogą różnicować się i łączyć, tworząc nowe włókna mięśniowe2,5. Wcześniejsze prace wykazały, że Mu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niniejszy protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Aarhus i lokalnymi przepisami etycznymi.
UWAGA: Upewnij się, że przestrzegasz przepisów lokalnej komisji etycznej dotyczącej eksperymentów na zwierzętach i postępowania z pośmiertnymi próbkami gryzoni. Myszy są potencjalnym źródłem alergenów; Jeśli to możliwe, włącz wentylację wyciągową i umieść ją nad miejscem pracy, aby uniknąć nadmiernego narażenia na alergeny. Alternatywnie noś maskę na twarz, jeśli eksperyment jest przeprowadzany regularnie. Protokół ten obejmuje pracę z ostrymi narzędziami, a badaczom zaleca się zapoznan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem izolacji poszczególnych mięśni szkieletowych (Rysunek 2), mięśnie smukły, piszczelowy przedni (TA), prostownik długi palców (EDL), brzuchaty (GA), płaszczkowaty, trójgłowy, żwacz oraz przepona zostały wyizolowane od trzech samców myszy szwajcarskich z linii outbred, które zostały wycofane z lokalnego programu hodowlanego (Rysunek 2). Po dysocjacji tkanek i barwieniu przeciwciałami, komórki satelitarne mięśni (MuSCs) oraz komórki progenitorow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W realizacji tego protokołu kluczowe jest kilka kroków, aby osiągnąć dobre plony. Poszczególne mięśnie mają małą objętość w porównaniu z ilością mięśni używanych w protokołach izolacji masowej. Powoduje to ryzyko wysuszenia mięśnia podczas rozwarstwienia, co zmniejsza wydajność. Aby temu zapobiec, ważne jest, aby dodać pożywkę do mięśni natychmiast po rozbiorze. Ponadto, jeśli sekcja trwa dłużej, skórę można usuwać z jednej kończyny na raz, aby skrócić czas ekspozycji mięśni na powietrze. Mniejsza objętość powoduje równi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Sortowanie komórek zostało przeprowadzone w FACS Core Facility, Aarhus University, Dania. Figury zostały stworzone przy użyciu Biorender.com. Dziękujemy dr J. Farupowi za podzielenie się króliczym przeciwciałem anty-PDGFRa. Prace te zostały wsparte grantem AUFF Starting Grant dla E.P. oraz grantami Start Package od NovoNordiskFonden dla E.P. (0071113) i A.D.M. (0071116).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka 1,5 ml (testowana pod kątem wydajności PCR, PP, 30 000 xg, bez DNA/DNazy/RNazy, niskie wiązanie DNA, sterylna) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | Probówka 1,5 ml |
| Probówka 15 ml (PP/HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNazy/RNazy, niecytotoksyczne, wolne od pirogenów, sterylne) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | Probówka |
| 15 mlProbówka okrągłodenna z polistyrenu o pojemności 5 ml | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | Probówka FACS bez nasadki sitka |
| 5 ml polistyrenu Probówka okrągłodenna z nakrętką sitka Falcon | , Fisher Scientific | 352235 | Probówka FACS z nasadką sitka |
| Probówka 5 ml (PP, niesterylna autoklawowalna) | Kolekcja VWR | 525.0946 | Probówka 5 ml |
| 50 ml (PP / HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNazy/RNazy, niecytotoksyczna, wolna od pirogenów, sterylna) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | Probówka 50 ml |
| Alexa Fluor 555 IgG przeciw królikowi osłowi (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 osioł-anty mysz IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Główny zakład Wirówka uniwersytecka w Aarhus | |
| 5810 | eppendorf | EP022628188 | Wirówka |
| Click-iT EdU Zestaw do proliferacji komórek do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 488 | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Zestaw do proliferacji komórek |
| Kolagen ze skóry cielęcej | Bioodczynnik, Sigma Aldrich | Źródło: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Kolagenaza typu II | Worthington, Fisher Scientific | Numer działki: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey surowica (niesterylna) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Kleszcze proste z cienkimi końcówkami |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Kleszcze |
| zakrzywioneF-10 Mieszanka odżywcza (Szynka) (1x), +L-glutamina | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (kat# 31550-023) | |
| FITC anty-mysz CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Lodowaty kwas octowy (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Kot # 1000631000) | |
| Głowica nad głową rotator mini-tube | Fisher Naukowy | 15534080 (Model nr 88861052) | Rotator z minirurką nad głową |
| Serum dla koni | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | kąpieli wodnej |
| MS2 | IKA | Jednostka wirowa | |
| Igła 20 G (0,9 mm x 25 mm) | BD mikrolance, Fisher Scientific | Igła 304827 | 20G |
| Neutralny bufor formalinowy 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Partia: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Niepirogenne sitko do komórek (40 &mikro; M) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Sitko do komórek |
| Pacific Blue anty-myszy Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 pierwotne przeciwciało | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x koncentrat w proszku | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anty-mysie CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM. A) (Kat # 105720) | |
| Pióro/paciorkowiec | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Końcówki do pipet p10 | Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific | 2140-05 | Końcówki do pipet o niskiej retencji, wstępnie sterylizowane, Końcówki do |
| pipet p1000 | Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific | 2279-05 | Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące |
| Końcówki do pipet p20 | Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific | 2149P-05 | Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące |
| Końcówki do pipet p200 | Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific | 2069-05 | Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące |
| Podkład ochronny | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40 cm, 8 warstw |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipety (P10, P20, P200, P1000) |
| Rekombinowany anty-PDGFR-alfa | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Skalpel (trzonek nr 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Skalpel |
| Ostrze do skalpela nr 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Skalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | Szafka klasy 2: Skaner laboratoryjny Mars | Flow |
| ScanR | Olympus | , Główny obiekt Uniwersytet w Aarhus | |
| Nożyczki | FST | 14568-09 | |
| Seria 8000 Inkubator DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | |
| Pipeta serologiczna 10 ml | VWR | 612-3700 | Sterylna, niepirogenna |
| pipeta serologiczna 5 ml | VWR, Avantor dostarczone przez VWR | 612-3702 | Sterylna, niepirogenna |
| strzykawka 5 mL, końcówka Luer (6%), sterylna | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Strzykawka |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Szalka Petriego |
| Powierzchnia poddana kulturze tkankowej (TC), polistyren, płaskie dno, sterylna, pokrywka, opakowanie 20 sztuk | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-dołkowa półdolna płyta |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Źródło: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Bibliografia
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
