Immunoznakowanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą protokołów immunohistochemicznych wymaga specyficznych metod przygotowania próbki i przeciwciał anty-PrP. Niniejszy protokół opisuje kluczowe etapy demaskowania epitopów w celu zapewnienia prawidłowego znakowania immunologicznego PrP i zminimalizowania niespecyficznego barwienia tła. Podejście to uwzględnia również środki bezpieczeństwa biologicznego podczas prowadzenia badań immunohistochemicznych na tkankach zakażonych prionami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą immunohistochemii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieprawidłowe białka prionowe (PrPSc) są związaną z chorobą izoformą komórkowego białka prionowego i markerami diagnostycznymi pasażowalnych encefalopatii gąbczastych (TSE). Te choroby neurodegeneracyjne dotykają ludzi i kilka gatunków zwierząt i obejmują trzęsawkę, odzwierzęcą gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), przewlekłą chorobę wyniszczającą jeleniowatych (CWD) i nowo rozpoznaną chorobę prionową wielbłądów (CPD). Diagnostyka TSE opiera się na immunodetekcji PrPSc poprzez zastosowanie zarówno metody immunohistochemicznej (IHC), jak i metody Western Immunoblot (WB) na tkankach mózgu, a mianowicie pnia mózgu (poziom zasuwnicy). IHC jest szeroko stosowaną metodą, która wykorzystuje przeciwciała pierwszorzędowe (monoklonalne lub poliklonalne) przeciwko antygenom będącym przedmiotem zainteresowania w komórkach wycinka tkanki. Wiązanie przeciwciało-antygen można uwidocznić za pomocą reakcji kolorystycznej, która pozostaje zlokalizowana w obszarze tkanki lub komórki, w którą przeciwciało było celowane. W związku z tym w chorobach prionowych, podobnie jak w innych dziedzinach badań, techniki immunohistochemiczne są wykorzystywane nie tylko do celów diagnostycznych, ale także w badaniach patogenezy. Badania takie polegają na wykrywaniu wzorców i typów PrPSc spośród wcześniej opisanych w celu identyfikacji nowych szczepów prionów. Ze względu na to, że BSE może zakażać ludzi, zaleca się, aby laboratorium bezpieczeństwa biologicznego poziomu 3 (BSL-3) i/lub praktyki były wykorzystywane do obchodzenia się z próbkami bydła, małych przeżuwaczy i jeleniowatych objętymi nadzorem nad TSE. Dodatkowo, gdy tylko jest to możliwe, zaleca się stosowanie urządzeń hermetyzujących i dedykowanych prionom, aby ograniczyć skażenie. Procedura PrPSc IHC składa się z etapu demaskowania epitopu kwasu mrówkowego, który działa również jako środek inaktywacji prionów, ponieważ tkanki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie stosowane w tej technice pozostają zakaźne. Podczas interpretacji wyników należy zwrócić uwagę na odróżnienie nieswoistego znakowania immunologicznego od znakowania docelowego. W tym celu ważne jest, aby rozpoznać artefakty znakowania immunologicznego uzyskane u znanych zwierząt kontrolnych ujemnych TSE, aby odróżnić je od określonych typów znakowania immunologicznego PrPSc, które mogą się różnić w zależności od szczepów TSE, gatunków gospodarzy i genotypu prnp, opisanych dalej w niniejszym dokumencie.
Wprowadzenie
Zgodnie z hipotezą prionową, nieprawidłowa izoforma (PrPSc) jest głównym lub jedynym składnikiem czynnika zakaźnego w zakaźnych encefalopatiach gąbczastych (TSE). Potwierdzenie diagnozy TSE opiera się na immunodetekcji PrPSc z zastosowaniem protokołów immunohistochemicznych (IHC) i/lub metod western blot (WB) tkanek mózgu1.
IHC to metoda wykorzystująca przeciwciała monoklonalne lub w niektórych przypadkach poliklonalne (jako przeciwciała pierwotne) w pierwszym kroku immunostainingu specyficznie ukierunkowanych antygenów znajdujących się w komórkach przekroju tkankowego. Każde skuteczne wiązanie przeciwciała pierwotnego z antygenem jest następnie wizualizowane przy użyciu przeciwciał wtórnych specyficznych dla przeciwciał pierwotnych. Przeciwciała wtórne te są sprzężone z enzymami, takimi jak peroksydaza chrzanowa (HRP) lub fosfataza zasadowa (AP). Wizualizację uzyskuje się poprzez dodanie substratu do tych enzymów, co prowadzi do powstania nierozpuszczalnych produktów barwnych zlokalizowanych w obszarach, w których przeciwciała pierwotne związały się z docelowymi antygenami. Poprawę wizualizacji można osiągnąć poprzez barwienie kontrastowe, w którym stosuje się barwnik w celu stworzenia kontrastu pomiędzy tkanką immunoznakowaną a nieznakowaną2.
W przypadku IHC z wykorzystaniem tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE), utrwalanie formaliną może znosić skuteczność przeciwciał pierwotnych z powodu tworzenia wiązań krzyżowych przez formaldehyd oraz podgrzewania i dehydratacji podczas zatapiania w parafinie. Procesy te zmieniają konformację białek, niszcząc, denaturując lub maskując epitopy, co zmniejsza lub całkowicie znosi możliwość ich detekcji3. W związku z tym konieczne jest przeprowadzenie odzyskiwania antygenu (AR). Techniki AR rozrywają wiązania krzyżowe grup chemicznych wywołane przez formaldehyd w cząsteczkach antygenowych, przywracając lub odsłaniając pierwotną konformację antygenu-białka. Skutkuje to odzyskaniem powinowactwa przeciwciała do antygenu (epitopu) w celu immunoznakowania. Ostateczna skuteczność AR zależy od właściwości docelowego antygenu i/lub przeciwciała pierwotnego2.
Odzyskiwanie antygenu (epitopu) indukowane ciepłem (HIER) jest jedną z procedur AR3 i jest rutynowo stosowane przy detekcji PrPSc metodą IHC, zgodnie z opisem w niniejszym dokumencie. IHC jest niezbędne w diagnostyce i stosowane w laboratoriach badawczych do określania dystrybucji tkankowej antygenu związanego z patologią. Jest ono szeroko wykorzystywane w diagnostyce i badaniach nad nowotworami, neuronauką oraz chorobami zakaźnymi4, między innymi. W przypadku TSE, IHC odgrywa istotną rolę w diagnostyce i badaniach w celu potwierdzenia i analizy dystrybucji PrPSc u naturalnych gospodarzy i w modelach eksperymentalnych. IHC przyczynia się do badań nad patogenezą prionów oraz analizy typów i wzorców depozycji PrPSc, w szczególności w tkankach nerwowych5, co pozwala na wykrycie odchyleń od rutynowo opisywanych infekcji i identyfikację potencjalnych nowych szczepów prionów.
Ponieważ priony wywołujące gąbczaste encefalopatie bydlęce (BSE) mogą zarażać ludzi, niektóre protokoły laboratoryjne związane z pracą z BSE mogą wymagać stosowania udogodnień i praktyk poziomu BSL-36. Obejmuje to m.in. wykorzystanie szczelnego pojemnika wtórnego do transportu próbek tkanek potencjalnie zainfekowanych BSE w obrębie instytutu i laboratorium. Obejmuje to również, w miarę możliwości, wyznaczenie obszarów izolacji oraz sprzętu dedykowanego do badań nad prionami i analizy BSE. Jest to wprowadzane w celu zapobiegania skażeniu poza obszarem roboczym oraz zapewnienia ograniczonej przestrzeni na wypadek konieczności przeprowadzenia procedur dekontaminacji.
W związku z tym Laboratorium Patologii INIAV stosuje zalecane udogodnienia i praktyki dla 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)6 w celu zarządzania potencjalnie zainfekowanymi prionami próbkami tkanek bydła, małych przeżuwaczy i jeleniowatych związanych z nadzorem nad TSE.
Tkanki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie, wykorzystywane w procedurach diagnostycznych lub badawczych dotyczących TSE, zwłaszcza w obrębie ośrodkowego układu nerwowego, mogą być potencjalnie zakaźne. W związku z tym tkanki utrwalone muszą zostać poddane działaniu kwasu mrówczego w celu zmniejszenia zakaźności prionów, jeśli są obecne, przed przetworzeniem tkanek. Procedurę tę przeprowadza się poprzez umieszczenie utrwalonych, przyciętych tkanek (o grubości około 2-4 mm) w kasecie do obróbki. Kaseta jest następnie zanurzana w 98% kwasie mrówczanym (na 1 h). Po zanurzeniu kasety z tkankami są płukane pod bieżącą wodą przez 30 min, a następnie przeniesione z powrotem do utrwalacza przed dalszym przetwarzaniem. Jeśli skrawki tkanek nie zostały potraktowane przed obróbką, skrawki potraktowane po mikrotomii muszą być zanurzone w nierozcieńczonym kwasie mrówczanym przez co najmniej 5 min przed barwieniem histologicznym7. Protokół IHC dla PrPSc obejmuje rutynowy etap odsłaniania epitopów kwasem mrówczanym, który służy również do inaktywacji prionów7. Po tych etapach inaktywacji prionów uzyskane utrwalone tkanki mogą być przetwarzane w warunkach BSL-2 zgodnie ze standardowymi praktykami BSL-2.
Minimalnym wymogiem w zakresie pobierania próbek tkanek do diagnostyki TSE u każdego zwierzęcia objętego nadzorem nad TSE jest pobranie pnia mózgu (na poziomie obex). Dodatkowo, w celu wykrycia atypowego BSE i scrapie, zaleca się również pobranie części móżdżku1,8. W diagnostyce CWD należy przebadać zarówno pień mózgu (obex), jak i węzły chłonne zakątka gardła, ponieważ PrPSc może zostać wykryty w tkankach limfatycznych przy braku wykrywalnego PrPSc w obex9, co zostało omówione przez Machado i wsp.10.
Fragment pnia mózgu obejmujący obex zawiera diagnostyczne miejsca docelowe TSE, mianowicie: jądro grzbietowe nerwu błędnego (DVN), jądro tractus solitarii (STN) oraz jądro rdzeniowe nerwu trójdzielnego (V). Obszary te konsekwentnie wykazują obustronną akumulację PrPSc, nawet we wczesnych stadiach BSE i klasycznego scrapie. W klinicznych przypadkach zaawansowanego TSE wszystkie obszary istoty szarej w obrębie pnia mózgu wykazują rozległą dystrybucję PrPSc11.
Przed krojenie i opracowaniem próbki mózgu poddawane są ocenie (Rycina 1) w celu ustalenia stopnia autolizy oraz obecności ewentualnych uszkodzeń tkanek, które mogłyby wpłynąć na przydatność próbki do potwierdzającej diagnostyki IHC8Aby potwierdzić poprawność protokołów preparatywnych oraz wyników analitycznych, w każdym badaniu, wraz z przygotowaniem tkanek z przypadków badawczych, dołączono próbki tkanek TSE dodatnie i ujemne jako kontrole.
Rysunek 1: Procedura IHC dla PrPSc . Przedstawienie sekwencji krok po kroku procedury IHC dla PrPSc , od deparafinizacji skrawków tkankowych po końcowe barwienie immunohistoryczne i detekcję (FFPE – utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie; Mab – przeciwciało monoklonalne; DAB – 3,3'-diaminobenzydyna). Rysunek został przygotowany w BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura IHC opisana tutaj jest elementem projektu badawczego FAIRJ-CT98-7021, "Ustanowienie europejskiej sieci nadzoru nad TSE u przeżuwaczy oraz standaryzacja i harmonizacja procesu i kryteriów identyfikacji podejrzanych przypadków". Jest zgodny z kryteriami diagnostycznymi określonymi przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt, WOAH (wcześniej nazywaną Office International des Épizooties, OIE)1 i Europejskie Laboratorium Referencyjne dla zwierzęcych TSEs8,11. Od 2008 roku opisana procedura IHC jest również akredytowana zgodnie z NPISOIEC17025 (ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących). Taka akredytacja oznacza wysokiej jakości system zarządzania obejmujący standardowe procedury operacyjne, wykwalifikowany personel, dokładnie skalibrowany sprzęt, rygorystyczną kontrolę danych i odczynników, udział w międzylaboratoryjnych testach biegłości, prace niezgodne i ocenę ryzyka w celu zwiększenia skuteczności systemu zarządzania, osiągania lepszych wyników i zapobiegania zagrożeniom laboratoryjnym. Zakażone prionami tkanki kontrolne z BSE, trzęsawką klasyczną, trzęsawką atypową i CWD pobrano z różnych źródeł (utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie, FFPE). Sekcje bydła i owiec pochodzą z przypadków zdiagnozowanych w ramach programu nadzoru nad TSE u zwierząt. Sekcje CWD pochodzą z próbek kontrolnych dostarczonych przez prof. Stefanie Czub (Kanadyjska Agencja Kontroli Żywności, Narodowe Centrum Chorób Zwierząt) w 2003 r. oraz z testów biegłości w CWD 2008 zorganizowanych przez Europejskie Laboratorium Referencyjne ds. TSE (APHA, Weybridge).
1. Cięcie tkanek i przygotowanie preparatu
- Wyciąć odcinki tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) o grubości 3-5 μm za pomocą mikrotomu.
- Spływać sekcje na oczyszczoną wodę o temperaturze około 10 °C niższej od temperatury topnienia użytej parafiny. Podnieś skrawki z wody na specjalnie przygotowane szkiełka mikroskopowe (patrz Tabela materiałów). Poczekaj, aż woda dokładnie spłynie ze szkiełek.
- Szkiełka należy inkubować przez noc w temperaturze 50 °C, aby zwiększyć przyczepność szkiełek do szkiełek.
UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżo wyciętych tkanek do protokołów IHC, chociaż sekcje kontroli dodatniej i ujemnej TSE mogą być przygotowane wcześniej i przechowywane. Kroki od 2 do 4 należy wykonać w dygestorium chemicznym.
2. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie
- Umieść szkiełka z skrawkami tkanek w koszu do barwienia ze stali nierdzewnej (patrz Tabela materiałów). Zanurz kosz w kąpieli ksylenowej (pojemnik do barwienia ze stali nierdzewnej) na 3 minuty, wyjmij i ponownie zanurz.
- Usuń skrawki ksylenu i ponownie nawodnij, zanurzając je w absolutnej kąpieli etanolowej na 3 minuty. Wyjmij i zanurz ponownie.
- Wysuszyć skrawki na powietrzu i umieścić w kąpieli z 90% etanolem na 1 minutę. Przenieść do kąpieli w 70% etanolowej na kolejną minutę, a następnie ostatecznie przenieść do kąpieli w 50% etanolowej na 1 minutę. Przy każdym zabiegu kąpieli etanolowej delikatnie dwukrotnie porusz kosz szkiełkowy i opróżnij kosz przed następnym przeniesieniem.
3. Pobieranie epitopów
- Ostrożnie zanurz skrawki tkanki w 98% kwasie mrówkowym w temperaturze pokojowej na 30 minut. Opłucz skrawki w wodzie z kranu przez 5 minut, a następnie dwukrotnie spłucz w wodzie destylowanej.
UWAGA: Kwas mrówkowy jest silnie. Należy nosić okulary ochronne i rękawice. - Wykonaj pobieranie antygenu wywołanego ciepłem (HIER), wykonując poniższe czynności.
UWAGA: Ten etap jest wykonywany przez uwodniony autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 30 minut w określonej komorze ciśnieniowej (patrz Tabela materiałów).- Podgrzewać bufor cytrynianowy (10 mM, pH 6,1, patrz tabela materiałów) w temperaturze 98 °C przez około 20 minut w pojemniku do barwienia ze stali nierdzewnej umieszczonym w komorze ciśnieniowej wypełnionej 500 ml wody destylowanej.
UWAGA: W niniejszym badaniu nastawa programu wynosiła 1 (SP1) dla konkretnego używanego sprzętu. - Gdy alarm wskaże, że urządzenie osiągnęło zaprogramowany czas i temperaturę, zanurz kosz ze szkiełkami i rozpocznij program do Nastawy 2 (121° C na 30 min). W celu kontroli jakości umieść na koszu odcinek samoprzylepnej taśmy wskaźnikowej autoklawu, aby monitorować temperaturę i ciśnienie oraz rejestrować ciśnienie początkowe i końcowe tego programu.
- Jeśli liczba szkiełek do barwienia immunologicznego nie osiąga pojemności kosza, użyj czystych, pustych szkiełek, aby zająć puste miejsca. Po zakończeniu programu należy odczekać pasywny powrót komory do ciśnienia otoczenia (co najmniej 30 min).
UWAGA: Dłuższy czas trwania może zmniejszyć niespecyficzne plamienie tła. - Ostrożnie przenieś kosz przesuwny do pojemnika na plamy ze stali nierdzewnej wypełnionego wodą destylowaną na 5 minut.
- Podgrzewać bufor cytrynianowy (10 mM, pH 6,1, patrz tabela materiałów) w temperaturze 98 °C przez około 20 minut w pojemniku do barwienia ze stali nierdzewnej umieszczonym w komorze ciśnieniowej wypełnionej 500 ml wody destylowanej.
4. Inaktywacja endogennej peroksydazy
- Zanurzyć kosz szkiełkowy zawierający skrawki próbki w kąpieli z 3% nadtlenkiem wodoru (H2O2) w metanolu na 30 minut. Opłukać sekcje pod bieżącą wodą (5 min). Odcedź i zanurz sekcje w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) na dodatkowe 5 minut.
5. Immunodetekcja
UWAGA: W niniejszym badaniu, immunodetekcja została przeprowadzona przy użyciu formatu szczeliny kapilarnej7 przy użyciu dostępnego na rynku systemu montażu klipsów do slajdów (patrz Tabela Materiałów). Stosowane są również inne systemy szkiełek immunohistochemicznych.
- Umieścić każde szkiełko na dostępnym w handlu uchwycie na pokrywie (patrz tabela materiałów) uprzednio zwilżonym TBS, unikając pęcherzyków, stroną z chusteczką skierowaną w stronę uchwytu i krawędziami szkiełka pokrywającymi się z dwoma dolnymi punktami uchwytu.
- Przytrzymaj zespół uchwytu szkiełka między kciukiem a palcem wskazującym, jednym palcem na górze sample szkiełka, a drugim na spodzie uchwytu. Następnie umieść zespół w galerii systemu.
- Aby upewnić się, że zestaw jest dobrze zmontowany, napełnij studzienkę między szkiełkiem do próbek a uchwytem TBS, który nie może natychmiast się przelać. Od tego momentu należy upewnić się, że około 80 μl TBS musi być zachowane między uchwytem a szkiełkiem. Nie dopuścić do wyschnięcia sekcji.
- Po wejściu do systemu, w celu zmniejszenia barwienia tła przed poddaniem działaniu przeciwciała pierwszorzędowego (anty-PrP, patrz Tabela materiałów), należy wstępnie inkubować szkiełka z próbką z 20% normalną surowicą tego samego gatunku, co drugorzędowe przeciwciało gospodarza używane do barwienia immunologicznego (w tym przypadku surowica końska) przez 30 minut w TBS.
- Rozmrozić liczbę podwielokrotności przeciwciała, które należy zastosować, w zależności od analizowanego gatunku zwierzęcia, liczby odcinków próbki do zbadania oraz ilości roboczego rozcieńczenia.
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj 10% normalnej surowicy tego samego gatunku, co źródło roztworów przeciwciał drugorzędowych i pierwszorzędowych. Jeśli to możliwe, aby uzyskać najlepsze wyniki, źródłem normalnej surowicy i przeciwciał drugorzędowych powinien być gospodarz tego samego gatunku. - Nie myjąc skrawków, nanieść roztwór przeciwciała pierwszorzędowego bezpośrednio (200 μl) do każdej studzienki zestawu szkiełek i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
- Do umycia napełnij dołki zestawów uchwytów do szkiełek TBS i odczekaj 5 minut. Powtórz dwukrotnie.
- Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (monoklonalne przeciwciało antymysie Horse Ab, patrz tabela materiałów) w stosunku 1/200 w TBS 10% surowicą końską. Przygotuj wymaganą objętość w zależności od liczby sekcji, które mają być poddane zabiegowi.
- Nałożyć roztwór przeciwciał drugorzędowych (200 μl) do każdej studzienki z zestawu szkiełek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyć zgodnie z opisem w kroku 5.5.
- Do inkubacji z peroksydazą kompleksu awidyna-biotyna (kompleks ABC/HRP, patrz tabela materiałów), należy przygotować odczynnik 30 minut przed użyciem. Nałożyć złożony roztwór ABC/HRP (200 μl) do każdego dołka z zestawu uchwytów na płytki ślizgowe. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyć zgodnie z opisem w kroku 5.5.
6. Rozwój z chromem DAB
UWAGA: DAB jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. W związku z tym podczas pracy z tym odczynnikiem należy zachować odpowiednią ostrożność, w tym ochronę oczu, fartuchy laboratoryjne, rękawice i dobre procedury laboratoryjne. Utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.
- Rozcieńczyć chromogen zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów) bezpośrednio przed użyciem. Nanieść roztwór chromogenu (400 μl) na każdą studzienkę zestawu płytek szkiełkowych.
- Inkubować do 30 minut w temperaturze pokojowej. W sekcjach dodatnich PrPSc zwykle wystarcza 10-minutowy okres inkubacji.
- Usunąć pozostały roztwór chromogenu, myjąc szkiełka w wodzie destylowanej. Wyjmij szkiełka z uchwytów pokrywy i umieść je w plastikowym pojemniku z wodą destylowaną.
7. Barwienie przeciwdziałające hematoksylinie
- Zanurz kosz do barwienia ze stali nierdzewnej wraz z sekcjami w kąpieli z roztworem hematoksyliny (patrz tabela materiałów) na 1 minutę. Delikatnie spłucz w zimnej bieżącej wodzie przez 10 minut lub letniej wodzie przez 5 minut.
- Odwodnić sekcje, umieszczając je w 90% etanolu na 1 minutę, a następnie jedną kąpiel w etanolu absolutnym przez 1 minutę. Następnie umieść szkiełka w kąpieli ksylenowej na 1 minutę.
- Zamontuj sekcje za pomocą dostępnego w handlu medium montażowego (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Czynności te wykonuje się w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej (19 °C-24 °C). Procedura ta obejmuje zapis testu (plik uzupełniający 1) do rejestrowania ukończenia wszystkich kroków, używanego sprzętu i technika laboratoryjnego. Ponadto zaprojektowano arkusz roboczy (plik uzupełniający 2), aby łatwo określić objętości odczynników w zależności od liczby sekcji w każdym teście, rozcieńczeń roboczych i instrukcji producenta, a także rejestrować temperaturę pokojową, sprzęt i partie odczynników.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z uwagi na możliwość wystąpienia niespecyficznego immunoznakowania celu, istotne jest ustalenie poziomu niespecyficznego immunoznakowania u znanych negatywnych zwierząt kontrolnych w kierunku TSE. Jest to ważny krok w celu prawidłowej interpretacji specyficznego PrPSc immunoznakowanie7 (Rycina 2). Odnotowano występowanie nieswoistego znakowania przez przeciwciała anty-PrP w postaci dyskretnych, wewnątrzneuronalnych zabarwień drobnocząsteczkowych (b...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
TSE są potencjalnymi chorobami odzwierzęcymi. Po pojawieniu się BSE w 1986 r. w Wielkiej Brytanii, Portugalia stała się jednym z państw członkowskich Unii Europejskiej o większej częstości występowania tej choroby14,15. W celu zwalczania tej choroby, Dyrekcja Generalna ds. Żywności i Weterynarii (DGAV) oraz Krajowy Instytut Badań Rolniczych i Weterynaryjnych (INIAV), które przeprowadzają diagnostykę TSE jako Krajowe Laboratorium Weterynaryjne TSE, opracowały mech...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten artykuł został sfinansowany przez Projekt POCI-01-0145-FEDER-029947 "Ocena ryzyka przewlekłej choroby wyniszczającej w Portugalii" wspierany przez FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Również autorzy jednostki badawczej CECAV otrzymali dofinansowanie z FCT, w ramach projektu UIDB/CVT/0772/2020.Dziękujemy Bruce'owi C. Campbellowi, dyrektorowi ds. badań (na emeryturze), Western Regional Research Center, USDA, za jego pomoc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alkohol etylowy absolutny | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Rozcieńczony 90%, 70% i 50% w wodzie destylowanej | |||
| Kompleks awidyna-biotyna i peroksydaza Vectastain Elite ABC zestaw Peroksydaza | Vector Laboratories | PK-6100 | Przygotuj i delikatnie wymieszaj 30 minut przed użyciem zgodnie z instrukcją zestawu. Nie mieszać po odstawieniu. |
| Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (IgG H + L u myszy u konia) | Vector Laboratories | BA-2000-1,5 | Rozcieńczyć w 1/200 w TBS z 10% normalną surowicą końską. Przygotuj wymaganą objętość w zależności od liczby sekcji. |
| Chromogen Diaminoferydyna- DAB, zestaw substratów, Peroksydaza | Vector Laboratories | SK-4100 | Przygotować przed użyciem zgodnie z instrukcją zestawu. Użyj 400 µ L roztworu na sekcję. |
| Komora ciśnieniowa DakoCytomation Pascal | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich' s Hematoksylina: | |||
| Hematoksylina | Merck | 115938 | Rozpuść 2 g hematoksyliny w 100 ml absolutnego etanolu. Dodać 100 ml wody destylowanej, 10 ml lodowatego kwasu octowego i 15 g ałunu potasowego, ciągle mieszając. Dodaj 100 ml gliceryny. Naturalny proces utleniania trwa 2 miesiące przed użyciem. |
| Alkohol etylowy absolutny | Labchem | LB0507-9010 | |
| Lodowaty kwas octowy | Merck | 101830 | |
| Ałun potasowy | Merck | 1.01047.1000 | |
| Gliceryna | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenny roztwór blokowy peroksydazy (stężenie 3% H2O2): | 40 ml Nadtlenek wodoru (30% w/w) w 360 ml metanolu. Przygotuj przed użyciem | ||
| Nadtlenek wodoru (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Metanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Kwas mrówkowy 98% | Merck | 1.00264.1000 | Nierozcieńczony |
| mikrotom | Mikrotom Shandon-AS325 | Shandon-AS325 | |
| Medium montażowe Entellan | Merck | 107960 | Gotowy do użycia. |
| Normalny roztwór blokowy surowicy (20%) w TBS: Surowica normalna dla konia | Gibco | 16050-122 | Przygotować objętość końcową zgodnie z liczbą skrawków w teście (200 &mikro; L roztworu na sekcję). |
| Przeciwciało pierwszorzędowe anty-PrP Mysz MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Owce, w tym trzęsawka nietypowa, jeleniowate, kotowate. Nie nadaje się do bydła. W zależności od liczby sekcji w teście (200 &mikro; L roztworu na sekcję) i rozcieńczenie przeciwciała, przygotować końcową objętość w TBS uzupełnioną 10% normalnej surowicy z gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe (normalna surowica konia) Zwykłe rozcieńczenie przeciwciał: MAb 2G11 1/100, ale w każdej nowej partii należy ustalić rozcieńczenie robocze, aby uzyskać stężenie pozwalające uzyskać najsilniejsze oznakowanie z najniższym tłem. Do przechowywania należy zamrozić podwielokrotne objętości co najmniej 10 μn; L do sterylnych mikroprobówek. Rozmrażaj i używaj jednej porcji na raz. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe anty-PrP Mysz MAb 12F10 | Kajmany Firma Chemiczna | 189710 | PrP142-160 Bydło, nie nadaje się do hodowli owiec Zwykłe rozcieńczenie przeciwciał: 1/200, ale należy również ustalić rozcieńczenie robocze. Przygotuj jako MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM komora | Thermo Scientific | ||
| Shandon Sequenza® Centrum szczepień | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Stojak na szkiełka uodparniające | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Bufor cytrynianowy (10 mM pH 6,1): | 2,55 g dwuwodnego cytrynianu trisodu i 0,255 g kwasu cytrynowego w jednym litrze oczyszczonej wody. Dostosuj pH roztworu roboczego do 6,1 za pomocą 10 mM roztworu kwasu cytrynowego (1,05 g kwasu cytrynowego w 500 ml oczyszczonej wody) Przygotuj w dniu testu. | ||
| Cytrynian trisodowy dwuwodny | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Kwas cytrynowy | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Słoik i kosz do barwienia | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Tris-buforowany roztwór soli fizjologicznej (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0,8% NaCI; pH 7,6): | 10xTBS (roztwór podstawowy 0,5 M ZASADA TRIZMA; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g i NaCl 80 g w 800 ml oczyszczonej wody. Dostosować pH roztworu podstawowego za pomocą kwasu solnego 37% i końcowej objętości do jednego litra z oczyszczoną wodą (zachować 5± 3° C do 2 miesięcy) Rozcieńczyć roztwór podstawowy TBS 1/10 w dniu testu. | ||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Merck | 106404 | |
| ksylenu | Odczynniki Panreac Applied Chem ITW | 251769 | nierozcieńczone |
Bibliografia
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry). Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
- Orge, L., et al. Neuropathology of Animal Prion Diseases. Biomolecules. 11 (3), 466(2021).
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al. Identification of H-type BSE in Portugal. Prion. 9 (1), 22-28 (2015).
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. Atlas of veterinary pathology. Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).
- Pires, M. A., et al. Immunology protocols, didactic series. Applied Sciences. , 357(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
