Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Przyszłość badań i terapii komórkowych leży w hodowlach komórkowych 3D^1,2,3. Modele organoidowe i sferoidalne wypełniają lukę między eksperymentami in vitro a modelami zwierzęcymi, tworząc lepsze modele, które naśladują rozwój ludzkiego ciała, fizjologię i choroby^4,5,6,7,8,9. Jednak odtwarzalność i powtarzalność tych modeli pozostaje wyzwaniem. Co więcej, obsługa, zbiór, przenoszenie i odwirowywanie tych struktur przy użyciu obecnych technologii powoduje utratę lub uszkodzenie organoidów i sferoidów w wielu warunkach, co znacząco wpływa na wyniki.

Pomimo wielu protokołów barwienia histologicznego, barwienia immunohistochemicznego, znakowania immunofluorescencyjnego i krioprezerwacji, nie ma uniwersalnego podejścia związanego ze standaryzacją warunków eksperymentalnych, obchodzeniem się i przetwarzaniem tych delikatnych struktur bez ich utraty lub uszkodzenia. Obecne protokoły są również niewiarygodnie długie, trwają naprzemiennie od kilku dni do kilku tygodni i obejmują złożone procedury z różnymi odczynnikami^{10,11,12,13,14}. Ponadto zbieranie, pipetowanie, odwirowywanie i przenoszenie struktur rosnących 3D między naczyniami do hodowli komórkowych a kriowialiami powoduje zmiany w położeniu struktur i siłach mechanicznych, a ostatecznie wpływa na różnicowanie i dojrzewanie organoidów i sferoidów. Doniesiono, że topologia tkanek, umiejscowienie komórek i siły mechaniczne znacząco wpływają na różnicowanie i dojrzewanie komórek^6,15,16,17.

Dlatego pożądane jest ulepszenie obecnych konwencjonalnych technologii generowania organoidów i sferoidów o stabilnej jakości. Metoda/urządzenie, które pominie wirowanie i inne etapy opisane powyżej i zapewni materiał w jednym bezpiecznym środowisku od początku do końca wielu procesów, byłaby korzystna dla osiągnięcia najbardziej spójnych i wiarygodnych danych. Dodatkowo zmniejszy to ograniczenia czasowe, robocze i kosztowe.

Opisane tutaj urządzenie wielofunkcyjne (MD) zapewnia jedno bezpieczne środowisko dla wielu procesów organoidów i sferoidów (Rysunek uzupełniający 1). To urządzenie i uzupełniające go protokoły eliminują etapy zbioru, pipetowania, przenoszenia i wirowania. Organoidy i sferoidy pozostają w swoim środowisku in vitro podczas procesów sekwencyjnych. Środowisko to składa się głównie z naturalnych lub syntetycznych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak dostępne w handlu hydrożele. Innymi słowy, opisane tutaj metody pozwalają na przetworzenie, zbadanie i zamrożenie całej próbki organoidów/sferoidów jeszcze w kropli hydrożelu.

Biokompatybilne urządzenie jest odporne na temperatury od 60 °C do -160 °C, co umożliwia przywrócenie organoidów/steroidów w zbiorniku z ciekłym azotem w temperaturze -160 °C lub przygotowanie bloków żywicy do mikroskopii elektronowej w temperaturze 60 °C. Wnęka w urządzeniu została zaprojektowana w celu zdefiniowania ograniczonej przestrzeni dla struktur rosnących w 3D i stymulowania tworzenia sferoidów lub organoidów w oparciu o poprzednie badania^{18,19,20,21,22,23}. Ta część urządzenia jest przezroczysta i zawiera specyficzne tworzywo sztuczne, które zapewnia wysoką jakość optyczną (współczynnik załamania światła: 1,43; wartość Abbego: 58; grubość: 7,8 mil [0,0078 cala lub 198 μm]). Zarówno nisza, jak i otaczająca ją "boczna" część powodują autofluorescencję. Przezroczysta wnęka pośrodku ma powierzchnię 80 mm², natomiast część boczna ma 600 mm². Głębokość pojemnika wynosi 15 mm, a grubość 1,5 mm. Cechy te, oprócz wielkości i konstrukcji urządzenia, umożliwiają prowadzenie obserwacji pod różnymi typami mikroskopów high-tech oraz przygotowanie próbek do badań mikroskopem elektronowym (Rysunek 2). System zamykania urządzenia zapewnia dwie pozycje, jedną uszczelnioną w zamrażarce, a drugą umożliwiającą przepływ gazu w inkubatorze. Testy proliferacji i cytotoksyczności CCK8 wykazują podobny wpływ na komórki w porównaniu z tradycyjnymi szalkami do hodowli komórkowych (rysunek uzupełniający 2). Test wykluczenia błękitu trypanowego wykazuje wysoką żywotność komórek (94%) podczas hodowli komórkowej w MD (Rysunek 3).

Procesy, które mogą być wykonane dla jednej próbki w jednym urządzeniu, obejmują (1) hodowlę, (2) barwienie histologiczne, (3) barwienie immunologiczne, w tym znakowanie immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne, (4) zamrażanie, (5) rozmrażanie, (6) badanie pod mikroskopami optycznymi, takimi jak mikroskopy jasnego pola, ciemnego pola, fluorescencji, konfokalne i superrozdzielcze, (7) powlekanie i badanie bezpośrednio pod skaningowym mikroskopem elektronowym, lub (8) przygotowanie do transmisji mikroskopia elektronowa (Rysunek 2).

Istnieją różne metodologie barwienia histologicznego, znakowania immunohistochemicznego lub fluorescencyjnego znakowania organoidów i sferoidów^{10,11,12,13,14,24,25}. Pozyskiwanie ich z hydrożelu jest pierwszym i głównym krokiem obecnej technologii. Po tym kroku niektóre metody umożliwiają znakowanie immunologiczne w całości. Zebrane organoidy są zatopione w parafinie, pocięte na sekcje i znakowane pod kątem barwienia i barwienia immunologicznego w innych. Sekcje mogą jednak nie przedstawiać całej próbki i dostarczać jedynie ograniczonych danych związanych z architekturą 3D konstrukcji. Co więcej, uszkodzenie tych struktur 3D i utrata antygenowości są dobrze znanymi skutkami ubocznymi tych technologii.

Uzupełniające nowe protokoły badań mikroskopowych w tym artykule pozwalają na analizę całych próbek nadal w hydrożelu. Opisane tutaj protokoły obejmują dwa nowo opracowane preparaty: roztwór do immunohistochemii (S-IHC) i roztwór do znakowania immunofluorescencyjnego (S-IF). Metody wykorzystujące te rozwiązania pozwalają naukowcom uzyskać dokładniejsze dane, ponieważ nie ma szkodliwych skutków tradycyjnych przepływów pracy, takich jak wirowanie, pipetowanie i przenoszenie delikatnych struktur. Opisany tutaj protokół eliminuje również konieczność etapów zbierania, blokowania, oczyszczania i pobierania antygenu oraz skraca całą procedurę do 6-8 godzin. Co więcej, metodologia ta pozwala na jednoczesne dodanie od jednego do trzech przeciwciał do tego samego S-IF. W związku z tym możliwe jest uzyskanie wyników tego samego dnia, nawet po wielokrotnych eksperymentach z etykietowaniem, co jest kolejną zaletą opisanego tutaj protokołu; Tradycyjne protokoły znakowania immunofluorescencyjnego w całości zwykle trwają od 3 dni do kilku tygodni^{10,11,12,13,14}.

Osadzanie parafiny, kolejny szkodliwy krok, który zmniejsza antygenowość, jest również pomijane. Struktura 3D pozostaje w swoim środowisku in vitro od początku do końca badania mikroskopowego. Ponieważ struktura 3D pozostaje w swoich warunkach wzrostu, dane dotyczące ekspresji i lokalizacji białek lepiej naśladują warunki in vivo. Oczekuje się dokładniejszych wyników, ponieważ metodologia eliminuje etapy wpływające na ekspresję antygenu w próbce. Tabele 1 i 2 pokazują, w jaki sposób te nowe protokoły eliminują etapy, oszczędzają czas i pracę w laboratorium oraz zmniejszają koszty i ilość odpadów w porównaniu z tradycyjnymi przepływami pracy.

Oprócz kluczowych kroków opisanych powyżej, kolejnym problemem jest dostarczenie pożywki do krioprezerwacji i metody zachowania struktury 3D próbki o wyższych wskaźnikach żywotności komórek^{26,27,28,29,30,31}. Kriokonserwacja jest niezbędna do stworzenia stabilnego systemu modelowego i umożliwienia biobankowania organoidów i sferoidów^32,33. Biobankowanie całej oryginalnej struktury 3D pozwoli na wierniejsze odwzorowanie naturalnego stanu zdrowia lub choroby. Kluczowymi kwestiami są wygoda i niezawodność kriokonserwacji oraz rozmrażania organoidów/sferoidów. Odzysk organoidów po rozmrożeniu jest bardzo niski w większości obecnych technologii, często poniżej 50%. Jednak ostatnie badania wykazały obiecujące wyniki z lepszymi wskaźnikami przeżycia^26,27,28,29. Lee i wsp. wykazali, że 78% komórek sferoidalnych przeżyło po krioprezerwacji, gdy użyli roztworu University of Wisconsin zawierającego 15% DMSO²⁸. Współczynnik przeżywalności komórek wzrósł do 83% w badaniu Arai et al.²⁹. Jednak wyniki po kriokonserwacji są znacznie naruszone, ponieważ struktury 3D nie mogą zachować tych samych właściwości i jakości. Ponadto odczynniki niezawierające surowicy są wymagane do dobrej praktyki produkcyjnej w warunkach farmaceutycznych i diagnostycznych. Tradycyjne przepływy pracy wykorzystują pożywkę zawierającą płodową surowicę bydlęcą (FBS) i dimetylosulfotlenek (DMSO) do metody powolnego zamrażania, z których obie wiążą się z upośledzeniami. FBS jest produktem pochodzenia zwierzęcego i może mieć różne wersje partii. DMSO jest bardzo skutecznym środkiem krioprotektantycznym, ale długotrwałe narażenie, zwłaszcza podczas rozmrażania, może powodować efekty cytotoksyczne^30,31.

Ten artykuł opisuje również metodologię zamrażania/rozmrażania całych organoidów lub sferoidów jeszcze w hydrożelu. W badaniu zastosowano dwie formuły zamrażania organoidów i sferoidów: (1) 10% DMSO zawierające tradycyjny roztwór do zamrażania (FS) oraz (2) pożywkę do kriokonserwacji wolną od surowicy i DMSO. Ta pożywka do krioprezerwacji zawiera składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, które różnią się od obecnych formuł. Macierz zewnątrzkomórkowa składa się z dwóch głównych klas makrocząsteczek, proteoglikanów i białek włóknistych, które są niezbędne do fizycznego rusztowania składników komórkowych, ale także inicjują procesy wymagane do morfogenezy, różnicowania i homeostazy tkanek^{34,35,36,37,38,39,40}. Kolageny zapewniają wytrzymałość na rozciąganie, regulują adhezję komórek, wspomagają chemotaksję i migrację oraz kierują rozwojem tkanek³⁷. Ponadto włókna elastyny zapewniają odrzut tkankom, które są poddawane wielokrotnemu rozciąganiu³⁸. Trzecie białko włókniste, fibronektyna, kieruje organizacją śródmiąższowej macierzy zewnątrzkomórkowej i odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w przyłączaniu komórek i pełni funkcję zewnątrzkomórkowego mechanoregulatora³⁹. Du i wsp. wykazali krioprotekcyjne działanie hydrolizatu kolagenu kurzego na naturalny system modelowy aktomiozyny⁴¹. Ich wyniki sugerują, że hydrolizat kolagenu może hamować wzrost kryształków lodu, zmniejszać marnozalizację i utlenianie białek, podobnie jak w przypadku komercyjnych krioprotektantów, oraz zapewniać lepszą strukturę żelu po cyklach zamrażania i rozmrażania. Dlatego dodanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej do pożywki do kriokonserwacji zapewnia bezpieczniejsze i bardziej ochronne środowisko dla próbki oraz wspomaga gojenie się żywych struktur po zamrożeniu i rozmrożeniu.

Dodatkowo, niniejsze badanie opisuje prosty protokół oznaczania błon cytoplazmatycznych i jąder żywych organoidów i sferoidów, gdy są one jeszcze w hydrożelu.

1. Hodowla organoidów i sferoidów

1. Umieść hydrożel na lodzie na noc (w lodówce lub chłodni) do rozmrożenia.
2. Umieścić dostępne w handlu urządzenie wielofunkcyjne (MD; patrz tabela materiałów) w inkubatorze na 1 dzień przed eksperymentem (37 °C, 5% CO₂) do ogrzania.
3. Umieść sterylne końcówki pipet z szeroką końcówką w lodówce w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Kroki 1.1-1.3 należy wykonać w dniu 0, a kroki 1.4-1.11 należy wykonać w dniu 1.
4. Umieść hydrożel na lodzie w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut.
   1. Opcjonalnie: Rozcieńczyć hydrożel w pożywce do hodowli zimnokomórkowych zgodnie z zaleceniami producenta.
5. Umieścić probówkę zawierającą osad komórek HepG2 (uzyskana w handlu linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego; patrz tabela materiałów) na lodzie.
6. Umieść 30-35 μl 100% hydrożelu we wnęce wstępnie podgrzanego urządzenia, aby utworzyć kroplę żelu.
7. Umieść 10 000 komórek HepG2 w środku górnej części każdej kropli hydrożelu (Rysunek 2) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
8. Przykryj kroplę hydrożelu 200 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą.
9. Przykryj pokrywę MD we właściwej pozycji, aby umożliwić przepływ gazu, i umieść urządzenie w inkubatorze.
10. Nakarm komórki 200 μl DMEM z 10% FBS co drugi dzień.
11. Sprawdź wzrost sferoid pod odwróconym mikroskopem (Rysunek 3). Tworzenie sferoidów rozpoczyna się po 3^dniu. Wideo 1 pokazuje położenie sferoid na różnych poziomach w kopule hydrożelowej.
    UWAGI: Zdecydowanie zaleca się delikatne zassanie płynu otaczającego hydrożel i powolne dodawanie nowego płynu do otoczenia, aby zapobiec uszkodzeniu kropli hydrożelu.

2. Barwienie hematoksyliną i eozyną organoidów/sferoidów w hydrożelu

1. Podgrzej utrwalacz (4% paraformaldehydu; PFA), PBS i hematoksyliny (patrz tabela materiałów) do 37 °C.
2. Odessać pożywkę otaczającą kroplę hydrożelu za pomocą pipety, dodać 100-200 μl 4% PFA w celu utrwalenia i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C.
3. Odessać 4% PFA i dodać 200 μl PBS do mycia 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie odessać PBS i inkubować z 200 μl roztworu hematoksyliny przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C.
4. Odessać hematoksylinę i dodać 200 μl_dH2O, przemywać 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odessać_dH2O i inkubować z 200 μl etanolu przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
5. Zassać etanol i inkubować z 200 μl eozyny (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odessać eozynę i dodać 200 μl dH₂O do płukania przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
6. Zassać dH₂O i dodać 100 μl glicerolu w celu pokrycia kropli hydrożelu jako medium mocującego.
7. Opcjonalnie: Zamontuj wnękę za pomocą szkiełka nakrywkowego. Ten krok można pominąć, aby uniknąć ściskania organoidów/sferoidów o znacznych rozmiarach.
8. Mocno zamknij pokrywę MD, aby uniknąć wysuszenia do czasu badania. Próbka jest stabilna do badania przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Immunohistochemia całych organoidów/sferoidów w hydrożelu

1. Otrzymany w handlu roztwór do badań immunohistochemicznych (S-IHC; patrz tabela materiałów) ogrzać do temperatury 37 °C.
2. Inkubować organoidy lub sferoidy w hydrożelu z 3% nadtlenkiem wodoru (_H2O2) w 200 μl_dH2Oprzez 5 minut w temperaturze 37 °C.
3. Zassać roztwór nadtlenku wodoru i przemyć w_{dH 2}O przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zassać dH₂O i inkubować dwukrotnie ze 100 μl S-IHC w temperaturze 37 °C przez 10 minut każdy.
4. Odessać S-IHC i inkubować ze 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w S-IHC przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C (zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania roboczego).
5. Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować ze 100 μl S-IHC 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
6. Odessać 100 μl S-IHC i inkubować z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
7. Odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i inkubować ze 100 μl S-IHC 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odessać S-IHC i inkubować ze 100 μl peroksydazy chrzanowej (HRP) znakowanej streptawidyną (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
8. Odessać streptawidynę znakowaną HRP i inkubować ze 100 μl S-IHC 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
9. Zassać S-IHC i inkubować ze 100 μl mieszaniny roztworu chromogenu DAB/AEC (patrz tabela materiałów) przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
10. Monitoruj intensywność barwienia pod mikroskopem świetlnym.
11. Myć dH₂O 3x po 2 min.
12. Opcjonalnie: Inkubować ze 100 μl hematoksyliny (patrz tabela materiałów) w celu barwienia przeciwjądrowego przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
13. Odessać Hematoksylinę i przemyć w dH₂O przez 5 min.
14. Zassać dH₂O i przykryć kroplę hydrożelu 100 μl glicerolu jako medium mocującym.
15. Mocno zamknij pokrywę MD do czasu badania mikroskopowego.
    UWAGI: Etapy pobierania antygenu i blokowania białek są pominięte w tym protokole, ponieważ S-IHC eliminuje te kroki.

4. Znakowanie immunofluorescencyjne organoidów/sferoidów w hydrożelu

1. Rozgrzać następujące materiały do temperatury 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w S-IF, drugorzędowy roztwór przeciwciała w S-IF, barwienie jądrowe i glicerol (patrz tabela materiałów).
2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i utrwalić 200 μl 4% PFA przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C. Odessać utrwalacz i przemyć w S-IF 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj dH₂O po stronie otaczającej wnękę, aby zapewnić wilgotność podczas poniższych kroków.
4. Odessać S-IF otaczający kroplę hydrożelu i inkubować kroplę hydrożelu ze 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) w S-IF przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C.
5. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć w S-IF 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
6. Zassać S-IF i inkubować w 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (patrz tabela materiałów) w S-IF przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
7. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć PBS 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
8. Odessać PBS i inkubować w 100 μl barwienia jądrowego DNA zawierającego pożywkę montażową lub glicerol, w temperaturze 37 °C w ciemności.
9. Wypełnij niszę glicerolem, aby uniknąć wysuszenia.
10. Opcjonalnie: Przykryj wnękę szkiełkiem nakrywkowym. Ten krok można pominąć, aby uniknąć ściskania organoidów/sferoidów.
11. Szczelnie zamknij MD. Próbki w MD mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności przez co najmniej 6 miesięcy przy minimalnej utracie fluorescencji.
12. Użyj następujących ustawień do konfokalnego badania mikroskopowego: ustaw wartość otworkową wszystkich kanałów na 20.1, utrzymuj główną stałą wzmocnienia na poziomie 550 dla 488 nm, 485 dla 550 nm i 450 dla 594 nm, utrzymuj stałą moc lasera dla wszystkich eksperymentów i najniższą wartość procentową na poziomie 2.0.
    UWAGI: Przeciwciała pierwszorzędowe: ATPaza anty-Na-K (1:100), anty-arginaza (1:50), antyalbumina (1:50), anty-beta-galaktozydaza (1:25), przeciwciało antymitochondrialne (1:100), przeciwciało anty-Golgiego (1:50), antycytokeratyna 5 (1:100), przeciwciało Ov6 (1:100). Przeciwciała drugorzędowe: kozia anty-królicza IgG (H + L)-488, kozia anty-królicza IgG (H + L)-550, kozia anty-mysia IgG (H + L)-488, kozia anty-mysia IgG (H + L)-550, kozia anty-kurczak IgY(H+L)-647. Rozcieńczenie dla wszystkich przeciwciał drugorzędowych wynosi 1:100. Dodatkowo stosuje się również FITC-falloidynę (1:100), przeciwciało sprzężone (patrz tabela materiałów).

5. Znakowanie błony plazmatycznej i jądra żywych organoidów i sferoidów w hydrożelu

1. Przygotować roztwór do etykietowania zawierający aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa fluor (5,0 μg/ml) i Hoechst (2 μM) w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), zgodnie z zaleceniami producenta (patrz tabela materiałów) i ogrzać do temperatury 37 °C.
2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 100 μl roztworu do znakowania, aby przykryć kroplę hydrożelu. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C.
3. Usunąć roztwór do etykietowania i umyć dwukrotnie w PBS 2x przez 10 minut każdy w temperaturze 37 °C. Opcjonalnie: Utrwalić 200 μl 4% formaldehydu przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
4. Przykryj kroplę hydrożelu glicerolem jako medium montażowym. Opcjonalnie: Zamontuj wnękę za pomocą szkła osłonowego.
5. Zamknij szczelnie pokrywę MD i przechowuj ją w lodówce w ciemności do czasu fluorescencji/konfokalnego badania mikroskopowego. Jest stabilny przez co najmniej 6 miesięcy.

6. Zamrażanie i rozmrażanie całych organoidów/sferoidów w hydrożelu

1. Zamroź organoidy, wykonując poniższe czynności.
   1. Otrzymany w handlu roztwór do zamrażania (FS; patrz tabela materiałów) rozgrzać do temperatury 37 °C.
   2. Delikatnie zassać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą kopułę hydrożelową.
   3. Delikatnie dodaj 200 μl FS. Inkubować próbkę z FS w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   4. Zamknij szczelnie pokrywę urządzenia i umieść je w piankowym pudełku. Umieść to pudełko piankowe w innym pudełku piankowym, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 3. Zamknij szczelnie oba pudełka z pianki. Dwa pojemniki piankowe umieszczone jeden w drugim zapewniają gradient temperatury próbki w zakresie od 1 do 2°C/min w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
   5. Umieść pudełko w temperaturze -20 °C na 2 godziny. Przenieś pudełko do zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostaw na noc.
   6. Wyjmij próbkę z pudełek. Próbka w MD może być przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
   7. Przenieś MD zawierający próbkę do zbiornika ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
2. Rozmrozić organoidy, wykonując poniższe czynności.
   1. Wyjąć MD z próbką ze zbiornika zamrażarki/azotu i umieścić ją bezpośrednio w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Dodać 200 μl ciepłej pożywki hodowlanej do wnęki (stosunek FS do pożywki do pożywki do hodowli komórkowej wynosi 1:1) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Dodać więcej ciepłej pożywki do wnęki (stosunek FS do pożywki do pożywki do hodowli komórkowej wynosi 1:2) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   4. Delikatnie zassać pożywkę i mieszaninę FS. Przejdź do skaningowej mikroskopii elektronowej (krok 7) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (krok 8), obrazowania organoidów/sferoidów z całą mocą w hydrożelu.

7. Skaningowa mikroskopia elektronowa organoidów/sferoidów z całego montażu

1. Rozgrzej roztwór utrwalający i postutrwalający Karnovsky'ego (patrz Tabela materiałów) do temperatury pokojowej (RT).
2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą hydrożel w MD. Umieścić próbkę w MD na lodzie w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut.
3. Bardzo delikatnie odessać upłynniony hydrożel otaczający organoidy/sferoidy. Ograniczona ilość matrigelu może pozostać w niszy, aby uniknąć uszkodzenia i utraty próbki.
4. Utrwalić utrwalaczem Karnovsky'ego (2% PFA, 2,5% aldehydu glutarowego w 0,15 M buforze kakodylanu i 2 mM CaCl₂; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
5. Delikatnie odessać utrwalacz i przemyć wodą destylowaną (dH₂O) 3x przez 15 minut każdy.
6. Delikatnie zassać_dH2O i utrwalić roztworem po utrwaleniu (1% wodny tlenek osmu [OsO₄]; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
7. Delikatnie odessać postutrwalacz i przemyć wodą destylowaną (_dH2O) 3x przez 15 min każdy.
8. Odwodnić w stopniowanej serii etanolu (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mieszaniny etanolu/acetonu (1:1; 1:2) i acetonu bezwzględnego w temperaturze pokojowej przez 15 minut każde.
9. Wysuszyć za pomocą suszarki do punktów krytycznych.
10. Pokryj próbkę w urządzeniu złotem/palladem o długości fali 6 nm za pomocą napylarki (patrz Tabela materiałów) przez 90 s.
11. Obserwacje pod skaningowym mikroskopem elektronowym z wbudowanym w soczewkę wtórnym detektorem elektronów przy napięciu 2-3 kV w trybie próżni (5 x ^10-6 mA). Rób zdjęcia z odległości roboczej 8,1-8,2 mm i przy powiększeniach 675x, 1050x i 1570x.
    UWAGI: Wszystkie kroki są wykonywane w MD. Na każdym etapie należy użyć 200-250 μl roztworu.

8. Transmisyjna mikroskopia elektronowa organoidów/sferoidów w hydrożelu

1. Rozgrzać utrwalacz Karnovsky'ego do temperatury 37 °C. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą hydrożel w MD.
2. Utrwalić próbkę utrwalaczem Karnovsky'ego w RT przez 1 godzinę. Przemywać dH₂O 3x przez 15 min każdy.
3. Post-fix z 2% wodnym roztworem OsO₄ i 2,5% żelazocyjankiem potasu w temperaturze pokojowej przez 45 min. Przemywać dH₂O 3x po 10 min.
4. Inkubować w 0,5% tiokarbohydrazydzie (TCH; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przemywać dH₂O 3x przez 10 min każdy.
5. Inkubować w 2% wodnym roztworze OsO₄ w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przemywać dH₂O 3x przez 10 min każdy.
6. Inkubować w 2% roztworze octanu uranylu (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 h.
   UWAGA: Na tym etapie sferoidy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
7. Inkubować w roztworze asparaginianu ołowiu (patrz tabela materiałów) w temperaturze 60 °C przez 45 minut. Przemywać dH₂O 3x przez 10 minut każdy.
8. Odwodnić w stopniowanej serii etanolu (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) i acetonu bezwzględnego w temperaturze pokojowej przez 15 minut każdy.
9. Traktować mieszaniną (1:1; 1:2) acetonu/żywicy Epon i czystej żywicy Epon (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny każde.
10. Polimeryzować żywicę w temperaturze 60 °C przez noc (minimum 16 godzin). Po polimeryzacji usuń blok żywicy z MD, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 4.
11. Przymocuj blok żywicy do większego za pomocą kleju do żywicy. Przytnij blok i dotrzyj do lokalizacji organoidów lub sferoidów.
12. Uzyskaj półcienkie (1 000 nm) i ultracienkie (60 nm) przekroje za pomocą ultramikrotomu (patrz tabela materiałów).
13. Umieść ultracienkie sekcje na miedzianych siatkach o siatce 100 i obserwuj pod skaningowym mikroskopem elektronowym z detektorem STEM przy przyspieszającym napięciu 30 kV. Rób zdjęcia z odległości roboczej 44 mm i powiększeniami 2580x, 5020x i 6060x.
    UWAGI: Na każdym etapie należy stosować 200-250 μl roztworu. Kroki 8.1-8.10 są wykonywane w MD.

Niniejszy artykuł przedstawia wielofunkcyjne urządzenie (MD) i uzupełniające metodologie hodowli, zamrażania, rozmrażania, barwienia histologicznego, barwienia immunohistochemicznego, znakowania immunofluorescencyjnego, powlekania i przetwarzania całych organoidów lub sferoidów podczas gdy nadal w hydrożelu w jednym unikalnie zaprojektowanym środowisku. Obecne badanie miało na celu przygotowanie sferoid raka wątroby HepG2 w 35 kroplach hydrożelowych w 35 MDs. Eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach, aby zapewnić dokładność. Dodatkowo, organoidy płuc w MD zostały oznaczone immunofluorescencyjnie jako przykład, aby zademonstrować wyniki obecnych metodologii badań organoidów.

Rysunek 1 pokazuje dokładne przyjrzenie się urządzeniu zawierającemu kopułę hydrożelową. Rozmiar i kształt wnęki zostały zaprojektowane tak, aby zapewnić środowisko ochronne dla hydrożelu zawierającego organoidy/sferoidy i zaoszczędzić odczynniki używane podczas różnych procesów. Ponadto boczna część urządzenia, która otacza wnękę, może być używana jako komora wilgotnościowa podczas eksperymentów z barwieniem immunologicznym. Pożywka do podawania próbki może wahać się w granicach 100-200 μl, w zależności od wysokości kropli hydrożelu. Obecne badanie koncentruje się na metodzie opartej na kopule, ponieważ wiele hydrożeli, komercyjnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej i ekstraktów z błony podstawnej pozwala użytkownikowi na przygotowanie kropli. Jednak możliwe jest również wypełnienie niszy MD hydrożelem, a następnie zasianie komórek w nim w celu wytworzenia organoidów / sferoidów. Metoda ta może być preferowana, jeżeli lepkość matrycy nie pozwala na przygotowanie kopułek lub jeżeli doświadczenie obejmuje duże ilości organoidów. Rodzaj hydrożelu i stosunek hydrożelu do pożywki do przygotowania kropli może się różnić w zależności od typu komórki, projektu eksperymentalnego i pożywki. Rysunek 1 przedstawia również konstrukcję urządzenia, która umożliwia badanie organoidów/sferoidów pod mikroskopem jasnego pola, konfokalnym i skaningowym mikroskopem elektronowym, podczas gdy organoidy/sferoidy nadal znajdują się w swoim naturalnym środowisku in vitro.

Rysunek 2 pokazuje, jak zaszczepić komórki w hydrożelu i zbadać rozwój sferoidów lub organoidów. Na rysunku tym przedstawiono również konstrukcję i wymiary urządzenia wielofunkcyjnego. Film 1 pokazuje lokalizację sferoid rosnących w 3D w hydrożelu. Rysunek 3 przedstawia obrazy na żywo rosnących sferoid od 3 do 21 dnia. Czas tworzenia się sferoidów i organoidów może się różnić w zależności od rodzaju próbki. Na przykład sferoidy z komórek HepG2 i komórek HEK powstały w ciągu 3 dni, podczas gdy tworzenie organoidów wątroby i dróg żółciowych trwało podczas eksperymentów 2 tygodnie.

sferoidy barwione hematoksyliną i eozyną są widoczne w Rysunek 4. Obraz przedstawia dobrze zachowane i jednorodnie wybarwione sferoidy o różnych rozmiarach i fuzjach sferoid. Na uwagę zasługują żywe komórki w środku sferoid. Obraz pokazuje również delikatne połączenia między komórkami z różnych sferoid. Tych delikatnych połączeń nie można było zwizualizować po tradycyjnych przepływach pracy, ponieważ przenoszenie, pipetowanie lub wirowanie mogłoby je uszkodzić. Rysunek 5 przedstawia barwienie immunologiczne sferoidów przeciwciałem specyficznym dla arginazy, jednym z najczęstszych markerów w diagnostyce i prognozowaniu raka wątrobowokomórkowego42,43. Mikrofotografie ujawniają zróżnicowane i niezróżnicowane komórki raka wątroby w tych samych sferoidach. Ten rysunek zawiera obrazy z przeciwbarwieniem hematoksyliną i bez niego. Badacze mogą zdecydować się na pominięcie barwienia przeciwstawnego za pomocą Hematoxyliny w przypadkach, w których trudno byłoby rozróżnić oznakowane obszary w strukturze 3D.

Rysunek 6 przedstawia kolejny prosty protokół do całościowej wizualizacji żywych organoidów/sferoidów w hydrożelu: barwienie żywej błony komórkowej i jądra. Metodologia pozwala na taką samą gęstość znakowania na obrzeżach i w środku, pokazując pełną penetrację odczynnika. Rysunek 7, Rysunek 8, oraz Rysunek 9 pokazuje reprezentatywne obrazy sferoidów oznaczonych odpowiednio jednym, dwoma lub trzema przeciwciałami. Od jednego do trzech pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńcza się jednocześnie w S-IF. Podobnie, od jednego do trzech pasujących przeciwciał drugorzędowych odpowiednich do eksperymentu rozcieńcza się jednocześnie w S-IF. Protokół znakowania immunologicznego pozwala naukowcom oznaczyć struktury 3D w ciągu 4-6 godzin bez ich utraty lub uszkodzenia. Tło jest przezroczyste, a zastosowana tutaj technologia nie wymaga dodatkowego oczyszczania, pobierania antygenu ani metod/rozwiązań blokujących. Metoda ta pozwala również naukowcom na znakowanie próbki wieloma przeciwciałami w jednym kroku. Innymi słowy, użytkownik przygotowuje jeden roztwór zawierający od jednego do trzech przeciwciał pierwszorzędowych i drugi roztwór pasujący do jednego do trzech przeciwciał drugorzędowych. Opisany tutaj protokół eliminuje sekwencyjne etapy znakowania różnymi przeciwciałami w konwencjonalnych metodologiach.

Rysunek 10 przedstawia skanujące i transmisyjne obrazy sferoid pod mikroskopem elektronowym. W pierwszym rzędzie przedstawiono zdjęcia całych sferoid w MD pod skaningowym mikroskopem elektronowym. Drugi rząd zawiera obrazy sferoid z transmisyjnego mikroskopu elektronowego po przygotowaniu bloków żywicznych zawierających sferoidy z pełnym mocowaniem w MD, a także obrazy sferoid przekrojonych i wybarwionych. Dobrze zachowane organelle cytoplazmatyczne i inne cechy ultrastrukturalne komórek pokazują skuteczność tego prostego protokołu, który chroni strukturę 3D całej próbki. MD pozwala również naukowcom na zamrożenie i rozmrożenie całych próbek w hydrożelu. Rysunek 11 pokazuje kopuły hydrożelowe i sferoidy w większym powiększeniu przed i po zamrożeniu. Zauważalna jest nieregularność na granicach kopuły hydrożelowej. Jednak okrągłość sferoid kriokonserwowanych jest prawie stabilna po rozmrożeniu w porównaniu ze sferoidami przed zamrożeniem. Metody znakowania żywych błon komórkowych i jąder komórkowych są również stosowane 48 godzin po rozmrożeniu, aby pokazać, w jaki sposób procedura zamrażania/rozmrażania wpłynęła na architekturę 3D, błonę komórkową i żywotność komórki. Tradycyjny roztwór do zamrażania zawierający dimetylosulfotlenek i obecny nowo opracowany roztwór, SF, wykazują podobne wyniki. Ponad 75% struktur 3D mogłoby przetrwać w tym protokole. Potrzebne są jednak dalsze eksperymenty, aby ujawnić długoterminowe skutki uboczne każdego preparatu na organoidy i sferoidy.

Tabela 1 i Tabela 2 porównują tradycyjne przepływy pracy z tymi opisanymi tutaj na podstawie liczby kroków, czasu trwania i produkcji odpadów (np. całkowita liczba plastikowych rękawiczek, końcówek do pipet, pipet serologicznych, probówek wirówkowych, probówek do mikrowirówek, naczyń do hodowli komórkowych, kriowialiów itp. dla każdego przepływu pracy).

Rysunek uzupełniający 1 przedstawia sekwencyjne kroki, które można wykonać schematycznie w jednym MD. Rysunek uzupełniający 2 przedstawia wyniki eksperymentów mających na celu porównanie żywotności komórek, toksyczności i szybkości proliferacji komórek HepG2 w naczyniu MD lub tradycyjnym naczyniu ze szklanym dnem. Rysunek uzupełniający 3 przedstawia pudełka piankowe, które zostały użyte do zamrożenia próbek w MD. Rysunek uzupełniający 4 podsumowuje kroki do wyjęcia bloku żywicy z MD. Rysunek uzupełniający 5 zawiera obrazy organoidów dróg oddechowych, które zostały znakowane immunofluorescencyjnie, a następnie uwidocznione, gdy nadal znajdowały się w MD. Podobnie, wideo 2 pokazuje dwa immunofluorescencyjnie znakowane organoidy dróg oddechowych w MD. Wreszcie, rysunek uzupełniający 6 jest wykresem porównującym średnią intensywność znakowania błony komórkowej w żywych sferoidach przed i po zamrożeniu przy użyciu tradycyjnego przepływu pracy i opisanego tutaj przepływu pracy. Do analizy wykorzystano oprogramowanie Image J.

Rysunek 1: Wielofunkcyjne urządzenie do hodowli komórek (MD). (A) Wnęka (N), środkowa część urządzenia, została zaprojektowana w celu stworzenia środowiska ochronnego dla organoidów/sferoidów hodowanych w kropli hydrożelu (D) podczas procesów sekwencyjnych. Bok (S), otaczająca część wnęki, może być używana jako komora nawilżacza podczas eksperymentów z barwieniem immunologicznym. (B) Przezroczysty środek w pokrywie pozwala użytkownikowi obserwować organoidy/sferoidy, gdy urządzenie jest zamknięte. (C) Kopuła hydrożelowa zawierająca organoidy w MD może być barwiona lub zatopiona w bloku żywicy do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Na pokrywie znajduje się również wnęka (N) do metodologii wiszących kropli. Rozmiar i konstrukcja urządzenia pozwalają użytkownikowi na badanie organoidów/sferoidów pod (D) jasnym polem, (E) konfokalnym i (F) skaningowym mikroskopem elektronowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Sadzenie komórek wewnątrz hydrożelu. (A) Osad komórek w pipecie wkłada się do górnej części kopuły. Po 3-5 dniach w kopule stają się widoczne sferoidy, zwłaszcza na obrzeżach kropli. (B) Cztery obrazy na żywo rosnących sferoid z każdej ćwiartki kopuły zostały uchwycone i połączone. Podziałka = 200 μm. (C) Konstrukcja i wymiary (w centymetrach) urządzenia wielofunkcyjnego (MD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Rozwijanie sferoid w kropli hydrożelu od 3 do 21 dnia. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Sferoidy barwione hematoksyliną i eozyną w obrębie MD. Wizualizacja połączeń między komórkami znajdującymi się w sąsiadujących lub zlewających się sferoidach. Delikatne procesy między komórkami (strzałki) są widoczne, ponieważ próbka w całości zamontowana w hydrożelu jest utrwalana, barwiona i badana bez uszkadzania struktur rosnących w 3D. Pasek skali: dzień 3, dzień 9 = 50 μm; dzień 7, dzień 17 = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Immunohistochemiczne barwienie sferoid w całości w hydrożelu w MD. Próbki wybarwiono immunologicznie przeciwciałem specyficznym dla arginazy. W sferoidach widoczne są komórki dodatnie (czerwone strzałki) i ujemne (czarne strzałki). Obrazy pochodzą z dwóch eksperymentów: (A-C) bez i (D-F) z barwieniem przeciwstawnym hematoksyliną. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Konfokalny obraz żywego organoidu w hydrożelu. Żywe organoidy oznaczono żywymi barwnikami błony komórkowej (WGA) i jądra komórkowego (Hoechst). Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Znakowanie immunofluorescencyjne sferoidów w całości w hydrożelu z jednym przeciwciałem i barwnikiem jądrowym (Hoechst). (A-C) Górny panel pokazuje sferoidę znakowaną przeciwciałem specyficznym dla ATPazy Na-K w błonie komórkowej. (D-F) Dolny panel pokazuje lokalizację innego przeciwciała specyficznego dla arginazy, białka cytozolowego specyficznego dla raka wątrobowokomórkowego, w sferoidach raka wątroby. Czas trwania protokołu barwienia: 6 h. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Znakowanie immunofluorescencyjne sferoidów w całości w hydrożelu z dwoma przeciwciałami i barwnikiem jądrowym (Hoechst). (AC) Górny panel pokazuje sferoidę znakowaną dwoma przeciwciałami specyficznymi dla albuminy i Ov6. Pasek skali = 5 μm. (D-F) Dolny panel pokazuje lokalizację białka alfa feto i Ov6 w sferoidach raka wątroby. Podziałka = 20 μm. Czas trwania protokołu barwienia: 6 godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Znakowanie immunofluorescencyjne sferoidów w całości w hydrożelu z trzema przeciwciałami i barwnikiem jądrowym (Hoechst). (A-E) Sferoida w górnym panelu jest znakowana przeciwciałami specyficznymi dla arginazy, ATPazy Na-K i beta-galaktozydazy. Pasek skali = 10 μm. (F-J) Środkowy panel przedstawia sferoidę znakowaną Ov6, beta-galaktozydazą i białkiem alfa-feto. Pasek skali = 20 μm. (K-O) Sferoida w dolnym panelu została oznaczona falloidyną FITC, przeciwciałem antymitochondrialnym i przeciwciałem anty-Golgiego. Podziałka = 20 μm. Zwróć uwagę na wysoką specyficzność etykietowania i zmniejszone tło. Czas trwania protokołu barwienia: 6 godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Obrazy z mikroskopii elektronowej. (A-C) Skaningowe obrazy mikroskopowe całych sferoid w hydrożelu w MD. Podziałka = 10 μm. (D-F) Cechy ultrastrukturalne komórek w sferoidzie zostały również uwidocznione pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym. Podziałka liniowa: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Obrazy sferoid na żywo przed i po zamrożeniu. (A-F) Nieregularność granic kopuł hydrożelowych jest widoczna po zamrożeniu. Jednak rozmiar i okrągłość sferoid pozostają podobne. (F) Migrację komórek na powierzchni hodowli można zaobserwować po rozmrożeniu. (G-L) Żywa błona komórkowa (WGA) i barwienie jądra (Hoechst) wykazują podobną żywotność komórek i nienaruszone błony komórkowe przed i po zamrożeniu całych sferoid w hydrożelu w MD. Skala basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie liczby kroków, czasu i produkcji odpadów między tradycyjnym a nowym przepływem pracy podczas krótkoterminowego eksperymentu.

Tabela 2: Porównanie konwencjonalnego znakowania immunologicznego i nowego protokołu znakowania immunologicznego.

Wideo 1: Seria czasowa obrazów na różnych poziomach hydrożelu zawierającego sferoidy pod mikroskopem kontrastowym z odwróconą fazą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Struktura 3D dwóch organoidów dróg oddechowych oznaczonych przeciwciałami dla Cytokeratyny 5 i DAPI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek uzupełniający 1: Przegląd eksperymentu. Ten schemat przedstawia sekwencyjne etapy eksperymentalne hodowli i badania organoidów w całości w hydrożelu. Opisana tutaj technologia umożliwia hodowlę, zamrażanie, rozmrażanie, etykietowanie i badanie organoidów pod różnymi mikroskopami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Porównanie żywotności komórek, toksyczności i tempa proliferacji komórek HepG2 w tradycyjnym naczyniu ze szklanym dnem lub MD. Komórki HepG2 hodowano na (A) tradycyjnym naczyniu do hodowli komórek ze szklanym dnem lub (B) w MD w celu porównania żywotności komórek i toksyczności. (C) W celu wykazania żywotności zastosowano test wykluczający błękit trypanowy. Podziałka = 20 μm. Wyniki porównano za pomocą testów cytotoksyczności (DE) CCK8 i proliferacji komórek (F). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Rozmieszczenie dwóch pudełek z pianki. Jedno pudełko piankowe jest umieszczane w drugim podczas powolnego procesu zamrażania całych organoidów lub sferoidów w MD. *oznacza dwa pola. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Kroki pokazujące, jak usunąć blok żywicy z MD po polimeryzacji żywicy. (A) Blok żywicy otaczający sferoidy lub organoidy jest przygotowywany wewnątrz niszy MD, a następnie polimeryzowany. (B-D) Następnie, za pomocą odpowiedniego cienkiego pręta, dociska się blok żywicy w celu usunięcia go z wnęki. (E) Następnie blok żywicy, wraz z plastikiem znajdującym się poniżej, jest usuwany. (F-G) Na koniec używa się pęsety, aby je rozdzielić, jeśli blok jest nadal przymocowany do plastiku. (H) Blok jest gotowy do cienkiego cięcia. Organoidy lub sferoidy z pełnym mocowaniem w bloku żywicy (*) są gotowe do przekroju do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Organoidy dróg oddechowych, które zostały znakowane immunofluorescencyjnie, a następnie zobrazowane, gdy były jeszcze w MD. (A-C) Górny panel pokazuje okrągłe organoidy dróg oddechowych z centralnym światłem. Kolor zielony reprezentuje komórki progenitorowe dróg oddechowych wyrażające cytokerynę 5 w najbardziej zewnętrznym pierścieniu organoidu, a niebieski reprezentuje jądra. Podziałka liniowa = 50 μm. (D-F) Dolny panel pokazuje trójwymiarowy obraz dwóch umieszczonych obok siebie organoidów w filtrach (D) DAPI i (E) Alexa 488, a także (F) scalony obraz. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Porównanie gęstości znakowania na żywych błonach komórkowych komórek. Wykres porównuje sferoidy przed i po zamrożeniu przy użyciu tradycyjnego i obecnie przyjętego przepływu pracy. Analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu Image J. Skróty: IntDen = Integrated Density (intensywność fluorescencji w wybranych sferoidach). CTCF = Skorygowana całkowita fluorescencja komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Ranan Gulhan Aktas jest właścicielem wniosków patentowych MD, S-IHC, S-IF i FS. Olgu Enis Tok był zaangażowany w rozwój tych produktów. Olgu Enis Tok i Gamze Demirel są członkami zespołu badawczo-rozwojowego firmy o nazwie Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut i Ozgecan Kayalar nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować.