Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo znacznych postępów w zrozumieniu biologii nowotworów, zdecydowana większość kandydatów na leki onkologiczne wchodzących w próby kliniczne kończy się niepowodzeniem, często z powodu braku skuteczności klinicznej. Ten wysoki wskaźnik niepowodzeń rzuca światło na niezdolność obecnych modeli przedklinicznych do przewidywania skuteczności klinicznej, głównie ze względu na ich nieadekwatność w odzwierciedlaniu heterogeniczności guza i mikrośrodowiska guza. Ograniczeniom tym można zaradzić za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli hodowlanych (sferoid) ustalonych na podstawie próbek ludzkich guzów pochodzących od indywidualnych pacjentów. Te kultury 3D reprezentują rzeczywistą biologię lepiej niż ustalone linie komórkowe, które nie odzwierciedlają heterogeniczności guza. Co więcej, hodowle 3D są lepsze niż dwuwymiarowe (2D) modele hodowli (struktury jednowarstwowe), ponieważ replikują elementy środowiska guza, takie jak niedotlenienie, martwica i adhezja komórek, oraz zachowują naturalny kształt i wzrost komórek. W niniejszym badaniu opracowano metodę przygotowania pierwotnych kultur komórek nowotworowych od indywidualnych pacjentów, które są 3D i rosną w sferoidach wielokomórkowych. Komórki mogą pochodzić bezpośrednio z guzów pacjenta lub ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta. Metoda ma szerokie zastosowanie w przypadku guzów litych (np. okrężnicy, piersi i płuc), a także jest opłacalna, ponieważ można ją wykonać w całości w typowym laboratorium badawczym / biologii komórki bez polegania na specjalistycznym sprzęcie. W niniejszym artykule przedstawiono protokół generowania modeli hodowli 3D nowotworów (sferoid wielokomórkowych) z pierwotnych komórek nowotworowych i oceny ich wrażliwości na leki przy użyciu dwóch uzupełniających się podejść: testu żywotności komórek (MTT) i badań mikroskopowych. Te wielokomórkowe sferoidy mogą być wykorzystywane do oceny potencjalnych kandydatów na leki, identyfikacji potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych oraz badania mechanizmów odpowiedzi i oporności.
Wprowadzenie
Badania in vitro i in vivo reprezentują komplementarne podejścia do opracowywania metod leczenia raka. Modele in vitro pozwalają na kontrolę większości zmiennych eksperymentalnych i ułatwiają analizy ilościowe. Często służą one jako tanie platformy przesiewowe i mogą być również wykorzystywane do badań mechanistycznych1. Jednak ich znaczenie biologiczne jest z natury ograniczone, ponieważ takie modele tylko częściowo odzwierciedlają mikrośrodowisko guza1. Natomiast modele in vivo, takie jak ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), oddają złożoność mikrośrodowiska guza i są bardzi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobieranie próbek ludzkich guzów używanych do hodowli pierwotnych komórek nowotworowych zostało przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) w Centrum Medycznym Rabin za pisemną świadomą zgodą pacjentów. Pacjenci kwalifikujący się do udziału w badaniu obejmowali dorosłych i dzieci płci męskiej i żeńskiej z rakiem piersi, jelita grubego, wątroby, płuc, raka neuroendokrynnego, jajnika lub trzustki, dowolnego raka dziecięcego lub dowolnego raka z przerzutami. Jedynym kryterium wykluczającym był brak zdolności do wyrażenia świadomej zgody.
1. Generowanie i zbieranie sferoid
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół przedstawia procedury generowania homogenicznej kultury sferoidów z pierwotnych komórek nowotworowych, ilościowej oceny skuteczności leków w kulturze sferoidów (test MTT) oraz określania wpływu badanych leków na morfologię sferoidów. Przedstawiono dane z reprezentatywnych eksperymentów przeprowadzonych na sferoidach wygenerowanych z kultur komórek raka jelita grubego i piersi. Podobne eksperymenty wykonano z wykorzystaniem innych typów nowotworów, w tym cholangiokarcinoma oraz raka żołądka, płuc i trzu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół opisuje prostą metodę generowania pierwotnych kultur komórkowych 3D (sferoidów) pochodzących z próbek ludzkich guzów. Sferoidy te mogą być wykorzystywane do różnych analiz, w tym do oceny potencjalnych kandydatów na leki i kombinacji leków, identyfikacji potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych oraz badania mechanizmów odpowiedzi i oporności. W protokole wykorzystuje się pierwotne komórki nowotworowe pochodzące bezpośrednio z próbek pobranych od pacjentów lub komórki nowotworowe z modeli PDX.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5 Fluorouracyl | TEVA Izrael | partia 16c22NA | Fluorouracyl, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Dysocjacja komórek |
| Cisplatyna | TEVA Izrael | 20B06LA | Abiplatyna, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Matryca błony podstawnej, typ 3 |
| DMSO (dimetylosulfotlenek) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Termo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometr Czytnik ELISA | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Kwas solny (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | do rozwiązania zatrzymującego |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA& | nbsp; Wersja 1.52a | Oprogramowanie typu open source ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | do roztworu zatrzymującego |
| L-glutaminę | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy Sigma Aldrich M5655-1G Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium | ||
| Aminokwasy endogenne | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)*Bez penicyliny wapniowo-magnezowej |
| – Streptomycyna | Invitrogen | 2119399 | |
| Bez fenolu RPMI 1640 | Przemysł biologiczny, Izrael | 01-103-1A | |
| Zbiornik pippetowy | Alexred | RED LTT012025 | |
| Pożywka hodowlana RPMI-1640 | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Bazylea, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0,5% roztwór | Przemysł biologiczny, Izrael | 03-102-1B | |
| 96-dołkowa płytka o bardzo niskim nasadce | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Bibliografia
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Yoshida, G. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
