Artykuł metodologiczny

In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

DOI:

10.3791/64565

⸱

21 października 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR), Universiti Malaya

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przesłany tutaj protokół wyjaśnia kompletny proces in silico potrzebny do przewidywania i funkcjonalnego charakteryzowania circRNA na podstawie danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, badających interakcje gospodarz-patogen.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Okrągłe RNA (circRNA) to klasa niekodujących RNA, które powstają w wyniku splicingu wstecznego. Te circRNA są głównie badane pod kątem ich roli jako regulatorów różnych procesów biologicznych. Warto zauważyć, że pojawiające się dowody wskazują, że circRNA gospodarza mogą ulegać zróżnicowanej ekspresji (DE) po zakażeniu patogenami (np. grypą i koronawirusami), co sugeruje rolę circRNA w regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jednak badania nad rolą circRNA podczas infekcji patogennych są ograniczone ze względu na wiedzę i umiejętności wymagane do przeprowadzenia niezbędnej analizy bioinformatycznej w celu identyfikacji krążków DE na podstawie danych sekwencjonowania RNA (sekwencjonowania RNA). Bioinformatyczne przewidywanie i identyfikacja circRNA ma kluczowe znaczenie przed jakąkolwiek weryfikacją, a badania funkcjonalne z wykorzystaniem kosztownych i czasochłonnych technik mokrych laboratoriów. Aby rozwiązać ten problem, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono krok po kroku protokół przewidywania i charakterystyki circRNA in silico przy użyciu danych sekwencyjnych RNA. Protokół można podzielić na cztery etapy: 1) Przewidywanie i kwantyfikacja circRNA DE za pośrednictwem potoku CIRIquant; 2) Adnotacja za pomocą circBase i charakterystyka circRNA DE; 3) Przewidywanie interakcji CircRNA-miRNA za pomocą rurociągu Circr; 4) analiza wzbogacenia funkcjonalnego genów rodzicielskich circRNA przy użyciu Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Linia ta będzie przydatna w przyszłych badaniach in vitro i in vivo w celu dalszego zbadania roli circRNA w interakcjach gospodarz-patogen.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje gospodarz-patogen reprezentują złożoną interakcję między patogenami a organizmami gospodarza, która wyzwala wrodzone reakcje immunologiczne gospodarzy, które ostatecznie prowadzą do usunięcia atakujących patogenów1,2. Podczas infekcji patogennych wiele genów odpornościowych gospodarza jest regulowanych w celu zahamowania replikacji i uwalniania patogenów. Na przykład powszechne geny stymulowane interferonem (ISG) regulowane w przypadku infekcji patogennych obejmują ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I i OASL3,4. Oprócz genów kodujących białka, badania wykazały również, że niekodujące RNA, takie jak długie niekodujące RNA (lncRNA), mikroRNA (miRNA) i koliste RNA (circRNA) również odgrywają rolę i są regulowane jednocześnie podczas infekcji patogennych5,6,7. W przeciwieństwie do genów kodujących białka, które kodują głównie białka jako cząsteczki funkcjonalne, wiadomo, że niekodujące RNA (ncRNA) działają jako regulatory genów na poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym. Jednak badania obejmujące udział niekodujących RNA, w szczególności circRNA, w regulacji genów odpornościowych gospodarzy nie są dobrze opisane w porównaniu z genami kodującymi białka.

CircRNA są powszechnie charakteryzowane przez kowalencyjnie zamkniętą strukturę pętli ciągłej, która jest generowana przez niekanoniczny proces splicingu zwany splataniem wstecznym8. Proces splicingu wstecznego, w przeciwieństwie do procesu splicingu pokrewnych liniowych RNA, polega na ligacji miejsca dawczego poniżej miejsca donorowego do miejsca akceptora powyżej, tworząc strukturę w kształcie koła. Obecnie zaproponowano trzy różne mechanizmy splicingu wstecznego dla biogenezy circRNA. Są to cyrkularyzacja za pośrednictwem białka wiążącego RNA (RBP)9,10, cyrkularyzacja sterowana parowaniem intronów11, oraz cyrkularyzacja sterowana przez lariat12,13,14. Biorąc pod uwagę, że circRNA są połączone od końca do końca w kolistą strukturę, wydają się być naturalnie odporne na normalne trawienie egzonukleazą, a zatem są uważane za bardziej stabilne niż ich liniowe odpowiedniki15. Inną wspólną cechą wykazywaną przez circRNA jest ekspresja specyficzna dla typu komórki lub tkanki w hosts16.

Jak wynika z ich unikalnej struktury i ekspresji specyficznej dla komórki lub tkanki, odkryto, że circRNA odgrywają ważne funkcje biologiczne w komórkach. Do tej pory jedną z głównych funkcji circRNA jest ich rola jako gąbek mikroRNA (miRNA)17,18. Ta regulacyjna rola circRNA występuje poprzez komplementarne wiązanie nukleotydów circRNA z regionem nasiennym miRNA. Taka interakcja circRNA-miRNA hamuje normalne funkcje regulacyjne miRNA na docelowych mRNA, regulując w ten sposób ekspresję genów19,20. Ponadto circRNA są również znane z regulowania ekspresji genów poprzez interakcję z białkami wiążącymi RNA (RBP) i tworzenie kompleksów RNA-białko21. Chociaż circRNA są klasyfikowane jako niekodujące RNA, istnieją również dowody na to, że circRNA mogą działać jako matryce do translacji białek22,23,24.

Ostatnio wykazano, że circRNA odgrywają kluczową rolę w regulacji interakcji gospodarz-patogen, szczególnie między gospodarzami a wirusami. Ogólnie rzecz biorąc, zakłada się, że circRNA gospodarza pomagają w regulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza w celu wyeliminowania atakujących patogenów. Przykładem circRNA, które promuje odpowiedź immunologiczną gospodarza, jest circRNA_0082633, opisany przez Guo et al.25. Ten circRNA wzmacnia sygnalizację interferonu typu I (IFN) w komórkach A549, co pomaga hamować replikację wirusa grypy25. Co więcej, Qu i in. opisali również ludzki intronowy circRNA, zwany circRNA AIVR, który promuje odporność poprzez regulację ekspresji białka wiążącego CREB (CREBBP), przetwornika sygnału IFN-β26,27. Istnieją jednak również circRNA, o których wiadomo, że promują patogenezę choroby po zakażeniu. Na przykład Yu i in. niedawno opisali rolę, jaką odgrywa circRNA splicowany z domeny palca cynkowego GATA zawierającej gen 2A (circGATAD2A) w promowaniu replikacji wirusa H1N1 poprzez hamowanie autofagii komórek gospodarza28.

Aby skutecznie badać circRNA, zazwyczaj implementuje się algorytm przewidywania circRNA całego genomu, po którym następuje charakterystyka in silico przewidywanych kandydatów na circRNA, zanim można przeprowadzić jakiekolwiek badania funkcjonalne. Takie bioinformatyczne podejście do przewidywania i charakteryzowania circRNA jest mniej kosztowne i bardziej efektywne czasowo. Pomaga to w doprecyzowaniu liczby kandydatów, którzy mają być badani funkcjonalnie, i może potencjalnie prowadzić do nowych odkryć. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół oparty na bioinformatyce do identyfikacji, charakterystyki i adnotacji funkcjonalnej circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen. Protokół obejmuje identyfikację i kwantyfikację circRNA ze zbiorów danych sekwencjonowania RNA, adnotację za pomocą circBase oraz charakterystykę kandydatów circRNA pod względem typów circRNA, liczby nakładających się genów i przewidywanych interakcji circRNA-miRNA. Badanie to zapewnia również funkcjonalną adnotację genów rodzicielskich circRNA za pomocą Gene Ontology (GO) i analizy wzbogacenia Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, zestawy danych biblioteki sekwencyjnej RNA (rRNA) pozbawione elementów identyfikacji rybosomalnego RNA (rRNA), przygotowane z ludzkich komórek makrofagów zakażonych wirusem grypy A, zostały pobrane i wykorzystane z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO). Cały proces bioinformatyki od przewidywania do charakterystyki funkcjonalnej circRNA jest podsumowany w Rysunek 1. Każda część rurociągu jest bardziej szczegółowo wyjaśniona w poniższych sekcjach.

1. Przygotowanie, pobieranie i konfiguracja przed analizą danych

UWAGA: Wszystkie pakiety oprogramowania użyte w tym badaniu są darmowe i open-source.

  1. Pobieranie wymaganych narzędzi na platformę Linux
    1. Pobierz i zainstaluj wymagane oprogramowanie i narzędzia wymienione w Tabeli materiałów na wysokowydajnym komputerze z systemem Linux, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez programistę.
      UWAGA: Większość narzędzi i oprogramowania ma własne strony internetowe GitHub lub dokumentację zawierającą instrukcje dotyczące instalacji i korzystania z ich narzędzi (patrz Tabela materiałów).
    2. Pobierz żądane zestawy danych sekwencyjnych RNA do wykrywania i analizy circRNA ze stron internetowych archiwów sekwencji (np. European Nucleotides Archive i Gene Expression Omnibus).
    3. Pobierz genom referencyjny (genomy referencyjne) (format FASA) i pliki adnotacji (format GTF/GFF3), kompatybilne z hostem, z którego przygotowano zestaw danych sekwencyjnych RNA. Genomy referencyjne hosta i pliki adnotacji można zwykle znaleźć w internetowych przeglądarkach genomu, takich jak National Center for Biotechnology Information (NCBI), University of California Santa Cruz (UCSC) i witryny internetowe Ensembl.
  2. Kontrola jakości sekwencjonowania RNA
    1. Wprowadź pliki FASTQ do programu FASTQC, aby określić jakość sekwencji RNA. Jeśli jakość plików FASTQ jest niska (np. 29,30.

2. Przewidywanie i analiza różnicowa ekspresji circRNA za pomocą CIRIquant

UWAGA: Bardziej szczegółowy podręcznik instalacji i przeprowadzania analizy wyrażeń różnicowych można znaleźć w sekcji dostępności kodu w CIRIquant paper31. Dane uzupełniające obejmują również niektóre z podstawowych poleceń używanych w tym protokole.

  1. Prognozy CircRNA
    1. Najpierw zindeksuj genom referencyjny gospodarza za pomocą nakładek BWA i HISAT2. Następnie na terminalu Linux wykonaj polecenia bwa index32 i hisat2-build33 w katalogu genomu referencyjnego hosta, aby go zindeksować.
    2. Następnie przygotuj plik konfiguracyjny YML zawierający nazwę pliku, ścieżkę narzędzi (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), ścieżkę do pobranych plików referencyjnych (pliki FASTA genomu referencyjnego hosta, pliki adnotacji) oraz ścieżkę do plików indeksu z kroku 2.1.1.
    3. Uruchom narzędzie CIRIquant z terminala, używając parametrów domyślnych lub ręcznych. Użytkownik może określić typ biblioteki (stronicowany lub nieniciowy) danych sekwencyjnych RNA podczas wykonywania narzędzia CIRIquant.
      UWAGA: Typ biblioteki danych sekwencyjnych RNA można określić, znając typ używanego zestawu do przygotowania biblioteki. Jeśli tożsamość zestawu do przygotowania biblioteki jest nieznana, do określenia nici danych sekwencyjnych RNA można użyć pakietu bioinformatycznego o nazwie RSeQC36
      4. .
  2. Analiza wyrażeń różnicowych
    UWAGA: Pakiet CIRIquant zawiera prep_CIRIquant, prepDE.py i CIRI_DE_replicate; Dlatego nie są potrzebne żadne dodatkowe pliki do pobrania dla tych trzech narzędzi.
    1. Przygotuj plik tekstowy (.lst) z listą danych zawierającą następujące elementy:
      1. kolumna: Identyfikatory danych sekwencyjnych RNA użytych w kroku 2.1.3
      2. kolumna: ścieżka do plików GTF wyprowadzanych przez CIRIquant
      3. kolumna: grupowanie danych sekwencyjnych RNA, niezależnie od tego, czy jest to grupa kontrolna, czy leczona.
    2. Przykład można znaleźć w tabeli 1 poniżej.
      UWAGA: Nie ma potrzeby umieszczania nagłówków, ponieważ służą one tylko jako odniesienie.
    3. W terminalu systemu Linux uruchom polecenie prep_CIRIquant z plikiem tekstowym (.lst) przygotowanym w kroku 2.2.1 jako danymi wejściowymi. Przebieg spowoduje wygenerowanie listy plików: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv i circRNA_ratio.csv.
    4. Przygotuj drugi plik tekstowy z listą danych zawierającą identyfikatory sekwencji RNA i ścieżkę do ich odpowiednich danych wyjściowych StringTie. Układ pliku musi być podobny do pliku tekstowego w kroku 2.2.1 bez kolumny grupowania.
    5. Uruchom prepDE.py z plikiem tekstowym przygotowanym w kroku 2.2.4 jako danymi wejściowymi do wygenerowania plików macierzy liczby genów.
    6. Wykonaj CIRI_DE_replicate z plikami library_info.csv i circRNA_bsj.csv z kroku 2.2.3 oraz plikiem gene_count_matrix.csv z kroku 2.2.5 jako danymi wejściowymi, aby wyprowadzić końcowy plik circRNA_de.tsv.
  3. Filtrowanie circRNA DE
    1. Użyj R (w terminalu komputerowym lub RStudio) lub dowolnego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych (np. Microsoft Excel), aby otworzyć plik circRNA_de.tsv wygenerowany w kroku 2.2.6 w celu przefiltrowania i określenia liczby circRNA o ekspresji różnicowej (DE).
    2. Przefiltruj circRNA DE zgodnie z kryteriami LogFC > |2| i FDR < 0,05.
    3. Utwórz plik o nazwie DE_circRNAs.txt do przechowywania informacji o circRNA DE.

3. Charakterystyka i adnotacja przewidywanych circRNA DE

  1. Status adnotacji krążków DE
    1. Załaduj plik o nazwie DE_circRNAs.txt w programie RStudio , który składa się z listy circRNA DE przefiltrowanych z kroku 2.3.3. Uwzględnij inne informacje, takie jak pozycje genomowe (Chr, Początek, Koniec), orientacje nici (+ lub -), nazwa genu i typ circRNA. Zanim przejdziesz dalej, przekonwertuj współrzędne początkowe genomu circRNA z CIRIquant na oparte na 0, odejmując 1 parę zasad.
      UWAGA: Pozostałe informacje podane powyżej można uzyskać z plików GTF wyprowadzanych przez CIRIquant (Plik uzupełniający 1).
    2. Określ status adnotacji przewidywanych circRNA DE, pobierając bibliotekę zawierającą pozycje genomowe bazy danych circRNA (np. circBase) zdeponowanych circRNAs.
      UWAGA: Przed dokonaniem porównania upewnij się, że wersja genomu używana do przewidywania circRNA jest identyczna z biblioteką bazy danych circRNA. Używany tutaj plik danych circBase jest swobodnie dostępny w folderze dysku udostępnionym w Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.
    3. Po przygotowaniu obu plików z kroku 3.1.1 i kroku 3.1.2 uruchom skrypt R podany w pliku uzupełniającym 1. Lokalizacje chromosomów circRNA DE są odpytywane do biblioteki przed przypisaniem statusu Adnotacja lub Nieadnotowana.
  2. Charakterystyka krążków DE
    1. Użyj R i innego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby podsumować liczbę circRNA zgodnie z typami circRNA (tj. ekson, intron, międzygenowy i antysensowny) oraz liczbą genów, które circRNA obejmują (1 lub >1) (Plik uzupełniający 1).UWAGA: CIRIquant może wykryć tylko cztery typy circRNA (ekson, intron, międzygenowy i antysensowny). Egzon-intronowe circRNA, znane również jako ElciRNA, nie mogą być wykryte przez CIRIquant.

4. Przewidywanie interakcji circRNA-miRNA za pomocą Circr

UWAGA: Bardziej szczegółowy podręcznik na temat instalacji i używania Circr do analizy interakcji circRNA-miRNA można znaleźć pod adresem: https://github.com/bicciatolab/Circr37.

  1. Przygotowanie plików
    1. Rozpakuj i rozpakuj zawartość pliku Circr.zip po pobraniu go ze strony Circr GitHub za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak "WinRar" lub "7-zip", do nowego katalogu, w którym zostanie przeprowadzona analiza.
    2. Zainstaluj wstępnie wymagane aplikacje (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools i samtools) przed przeprowadzeniem analizy circRNA-miRNA.
    3. Genomy referencyjne i pliki adnotacji dla kilku interesujących organizmów, plik współrzędnych rRNA, zweryfikowany plik interakcji miRNA i pliki circRNA circBase są dostarczane przez autora Circr na stronie Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. Po kliknięciu na pliki pomocnicze w folderze dysku, wybierz folder dla interesującego nas organizmu, folder miRNA oraz plik tekstowy circBase i pobierz go.
    4. Po pobraniu niezbędnych plików w kroku 4.1.3 utwórz nowy katalog o nazwie support_files w katalogu wymienionym w kroku 4.1.1. Następnie rozpakuj i rozpakuj zawartość do katalogu support_files.
    5. Zindeksuj plik genomu referencyjnego interesującego nas organizmu za pomocą polecenia samtools faidx (Plik uzupełniający 1).
    6. Przygotuj plik wejściowy składający się ze współrzędnych interesujących DE circRNA w pliku BED rozdzielanym tabulatorami, jak pokazano w tabeli 2.
      UWAGA: Ponieważ circRNA przewidywane przez CIRIquant nie są oparte na wartości 0, konieczne jest zmniejszenie 1 pz we współrzędnej początkowej (jak wspomniano w kroku 3.1.1) przed konwersją ich do formatu BED. Nagłówki pokazane w Tabeli 2 służą jedynie jako odniesienie i nie są potrzebne w plikach BED.
    7. W tym momencie upewnij się, że oczekiwana struktura drzewa folderów dla analizy Circr jest następująca: Rysunek 2.
  2. Bieganie Circr.py
    1. Wykonaj Circr.py za pomocą Pythona 3 i jako argumenty określ plik wejściowy circRNA, genom FASTA interesującego organizmu, wersję genomu wybranego organizmu, liczbę wątków i nazwę pliku wyjściowego w wierszu poleceń.
    2. Jeśli interesujący go organizm nie znajduje się w folderze dysku wymienionym w kroku 4.1.3 lub jeśli użytkownik woli mieć niestandardowy zestaw plików do uruchomienia analizy, podczas wykonywania Circr.py należy dołączyć dodatkowe polecenia określające lokalizację tych plików.
    3. Po zakończeniu analizy Circr program wyprowadza plik interakcji circRNA-miRNA w formacie csv.
    4. Przefiltruj wyniki interakcji circRNA-miRNA zgodnie z preferencjami użytkownika. W tym badaniu przewidywania są filtrowane za pomocą Rstudio zgodnie z poniższymi kryteriami:
      -Wykrywane przez wszystkie trzy narzędzia programowe
      -Dwa lub więcej miejsc wiązania zgłaszanych zarówno przez Targetscan, jak i miRanda
      -Zidentyfikowane w kolumnach "AGO" lub "validated"
      -Odfiltruj brak interakcji z regionami nasion
    5. Zapisz circRNA, które przekazują przefiltrowane warunki z kroku 4.2.3, do nowego pliku tekstowego o nazwie circRNA_miRNA.txt. Takie filtrowanie może zwiększyć pewność przewidywanych interakcji.

5. Budowa sieci ceRNA

UWAGA: Szczegółowy podręcznik jak korzystać z Cytoscape można znaleźć pod adresem: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ i https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. Pobieranie i przygotowanie
    1. Pobierz najnowszą wersję Cytoscape38 z: https://cytoscape.org/download.html.
    2. Uruchom kreatora instalatora pobranego w kroku 5.1.1 i wybierz lokalizację pliku dla oprogramowania Cytoscape.
    3. Przygotuj plik rozdzielany tabulatorami zawierający interesujące Cię circRNA i ich docelowe miRNA. Pierwsza kolumna składa się z nazwy circRNA; druga kolumna określa typ RNA z pierwszej kolumny; trzecia kolumna to docelowe miRNA; a czwarta kolumna określa typ RNA z trzeciej kolumny. Przykładowy plik przedstawiono w tabeli 3.
  2. Budowa mapy sieci ceRNA
    1. Otwórz oprogramowanie Cytoscape zainstalowane w kroku 5.1.2.
    2. W Cytoscape przejdź do Plik > Importuj > sieć z pliku. Wybierz plik, który został przygotowany w kroku 5.1.3.
    3. W nowej zakładce wybierz pierwszą i drugą kolumnę jako "Węzeł źródłowy" i "Atrybut węzła źródłowego", a trzecią i czwartą kolumnę odpowiednio jako "Węzeł docelowy" i "Atrybut węzła docelowego". Kliknij OK, a sieć pojawi się w prawym górnym rogu Cytoscape.
    4. Aby zmienić styl wizualny sieci, naciśnij przycisk Styl po lewej stronie Cytoscape.
    5. Naciśnij strzałkę po prawej stronie opcji Kolor wypełnienia. Wybierz Typ dla kolumny i Mapowanie dyskretne dla typu mapowania. Następnie wybierz żądany kolor dla każdego z typów RNA.
    6. Po zmianie koloru zmień kształt węzłów, przechodząc do opcji Kształt i wykonując krok 5.2.5.

6. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego

  1. Analiza ontologii genów (GO) i Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG) dla genu rodzicielskiego circRNA
    1. Upewnij się, że clusterProfiler39,40 i org. Hs.eg.db41 pakiety zostały zainstalowane w Rstudio. Organizacja organizacyjna. Hs.eg.db41 package to pakiet adnotacji dla całego genomu tylko dla ludzi. Jeśli organizm będący przedmiotem zainteresowania jest innym gatunkiem, należy zapoznać się z: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. Zaimportuj informacje o DE_circRNA z kroku 2.3.1 do obszaru roboczego Rstudio.
    3. Użyj genu rodzicielskiego circRNA podanego w tym pliku do analizy wzbogacenia w nadchodzących krokach. Jeśli jednak użytkownik chce przekonwertować symbol genu na inne formaty, takie jak identyfikator Entrez, powinien użyć funkcji, takiej jak "bitr".
    4. Używając identyfikatora genu jako danych wejściowych, uruchom analizę wzbogacania GO przy użyciu funkcji enrichGO w pakiecie clusterProfiler39,40 przy użyciu parametrów domyślnych.
    5. Używając identyfikatora genu jako danych wejściowych, uruchom analizę wzbogacania KEGG przy użyciu funkcji enrichKEGG w pakiecie clusterProfiler39,40 przy użyciu parametrów domyślnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w poprzedniej sekcji został zmodyfikowany i skonfigurowany tak, aby pasował do systemu operacyjnego Linux. Głównym powodem jest to, że większość bibliotek modułów i pakietów zaangażowanych w analizę circRNA może działać tylko na platformie Linux. W tej analizie zestawy danych biblioteki sekwencyjnej RNA-seq rybosomalnego RNA (rRNA) pozbawione elementów identyfikacji przygotowane z ludzkich komórek makrofagów zakażonych wirusem grypy A zostały pobrane z bazy danych GEO42 i wykorzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować użyteczność tego protokołu, jako przykład użyto sekwencji RNA z ludzkich komórek makrofagów zakażonych wirusem grypy A. Zbadano funkcjonowanie circRNA jako potencjalne gąbki miRNA w interakcjach gospodarz-patogen oraz ich funkcjonalne wzbogacenie GO i KEGG w organizmie gospodarza. Chociaż w Internecie dostępnych jest wiele narzędzi circRNA, każde z nich jest samodzielnym pakietem, który nie wchodzi ze sobą w interakcje. Tutaj zebraliśmy kilka narzędzi, które są wymagane do przewidywania i kwantyfikacji ci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor chciałby podziękować Tan Ke En i Dr. Cameronowi Brackenowi za ich krytyczną recenzję tego rękopisu. Prace te były wspierane przez granty z Programu Grantów na Badania Podstawowe (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) oraz University of Malaya High Impact Research Grant (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/Odnosząc się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr.
Wyrównywacz BWA Burrows-Wheelerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/odnosi się do sekcji 2.1.1 i 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant i indeksowania genomu
CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/CircrOdnosząc się do sekcji 4. Służy do przewidywania miejsc wiązania miRNA
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantOdnosząc się do sekcji 2.1.3. Aby przewidzieć circRNA,
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerOdnosząc się do sekcji 7. Do wzbogacania funkcjonalnego procesora GO i KEGG
Intel  Procesor Intel(R) Xeon(R) E5-2620 V2 @ 2,10 GHz    Rdzenie: 6-rdzeniowy CPU Pamięć: 65 GB Karta graficzna: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) Specyfikacje używane do uruchomienia całego tego protokołu.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlOdnosi się do sekcji 5.2. Potrzebne do wykreślenia sieci ceRNA
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Odnosząc się do sekcji 1.2.1. Kontrola jakości plików Fastq
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/Odnosi się do sekcji 2.1.1 i 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant i indeksowania genomu
LinuxUbuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) https://releases.ubuntu.com/focal/Potrzebne do uruchomienia całego protokołu. Inne wersje Ubuntu mogą być nadal ważne do realizacji protokołu.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doOdnosząc się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr
Pybedtoolspybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/Potrzebne do manipulacji genomem pliku BED
PythonPython 2.7 i 3.6 lub aboverhttps://www.python.org/downloads/Aby uruchomić niezbędne moduły biblioteczne
RKompleksowa sieć archiwów Rhttps://cran.r-project.org/Do manipulowania ramkami danych
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridOdnosi się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/A workspace do uruchamiania R
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/Odnosząc się do sekcji 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant
StringTieJohns Hopkins University: Center for Computational Biologyhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlOdnosząc się do sekcji 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant
TargetScanGitHubhttps://github.com/nsoranzo/targetscanOdnosząc się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024(2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454(2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081(2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806(2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540(2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659(2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15(2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390(2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721(2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483(2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90(2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834(2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141(2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. Carlson, M. org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0. , Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022).
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178(2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87(2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20(2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), New York, N.Y. 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138(2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1(2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106(2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Koliste RNAekspresja r nicowasekwencjonowanie RNAanaliza bioinformatycznaprzewidywanie circRNAcharakterystyka circRNAanaliza ontologii gen wwzbogacenie KEGGinterakcja circRNA miRNA

Powiązane artykuły