Artykuł metodologiczny

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64572

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Dysfunkcja metaboliczna komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest kluczowym czynnikiem patogennym chorób siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i proliferacyjna witreoretinopatia (PVR). Ponieważ RPE są wysoce aktywnymi metabolicznie komórkami, zmiany w ich statusie metabolicznym odzwierciedlają zmiany w ich zdrowiu i funkcjonowaniu. Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozwala na analizę kinetyczną w czasie rzeczywistym dwóch głównych szlaków bioenergetycznych, glikolizy i mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), poprzez kwantyfikację odpowiednio wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR). Poniżej przedstawiono zoptymalizowany protokół przeprowadzania respirometrii o wysokiej rozdzielczości na pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE). Protokół ten zawiera szczegółowy opis etapów związanych z tworzeniem profili bioenergetycznych RPE w celu określenia ich podstawowych i maksymalnych zdolności OXPHOS i glikolitycznych. Wystawienie H-RPE na działanie różnych iniekcji leków ukierunkowanych na maszynerię mitochondrialną i glikolityczną skutkuje zdefiniowanymi profilami bioenergetycznymi, na podstawie których można obliczyć kluczowe parametry metaboliczne. Protokół ten podkreśla wzmocnioną odpowiedź BAM15 jako środka rozprzęgającego w porównaniu z p-trifluorometoksyfenylohydrazonem cyjanku karbonylu (FCCP) w celu wywołania maksymalnej zdolności oddychania u RPE. Protokół ten może być wykorzystany do badania statusu bioenergetycznego RPE w różnych stanach chorobowych i testowania skuteczności nowych leków w przywracaniu podstawowego statusu metabolicznego RPE.

Wprowadzenie

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) istnieją jako monowarstwa pigmentowanych komórek nabłonkowych, strategicznie rozmieszczonych pomiędzy fotoreceptorami a śródbłonkiem nabłonka naczyniówki. RPE są wysoce aktywne metabolicznie z wieloma funkcjami, w tym (1) fagocytozą zrzucanych krążków fotoreceptorów, (2) recyklingiem pigmentu wzrokowego w celu utrzymania cyklu widzenia, (3) transportem składników odżywczych, metabolitów, jonów i wody, (4) absorpcją światła, (5) ochroną przed fotooksydacją, (6) wydzielaniem niezbędnych czynników wspierających integralność siatkówki oraz (7) tworzeniem zewnętrznej bariery krew-siatkówka1. Zwyrodnienie RPE wiąże się z dysfunkcją metaboliczną i defektami mitochondrialnymi, co prowadzi do chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i proliferacyjna witreoretinopatia (PVR)2.

Dwa kluczowe szlaki bioenergetyczne to glikoliza, która zachodzi w cytoplazmie, oraz fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS), która zachodzi w mitochondriach. Podczas glikolizy jedna cząsteczka glukozy jest przekształcana w dwie cząsteczki pirogronianu i produkcję netto dwóch cząsteczek trifosforanu adenozyny (ATP). W przeciwieństwie do glikolizy, OXPHOS wytwarza znacznie wyższe poziomy ATP (~32-38 cząsteczek ATP na cząsteczkę glukozy). Warto zauważyć, że OXPHOS zużywa tlen i wymaga do zaistnienia funkcjonalnych mitochondriów, podczas gdy glikoliza zachodzi w cytoplazmie i nie wymaga tlenu.

Przed wprowadzeniem technik opartych na fluorescencji lub fosforescencji do badania oddychania mitochondrialnego, poziomy tlenu były mierzone w permeabilizowanych zawiesinach komórkowych w komorach wyposażonych w elektrodę tlenową typu Clarka3. Chociaż elektroda Clarka jest znacznie tańsza niż respirometria oparta na fluorescencji i działa w komórkach nieprzylegających, jest stosunkowo mało przepustowa, a każdy przebieg oddechowy trwa około 15-20 minut i wymaga znacznie większej ilości komórek dla każdej próbki3. W ten sposób technika respirometrii oparta na fluorescencji w dużej mierze zastąpiła elektrodę Clarka i stała się popularną techniką w dziedzinie metabolizmu i badań mitochondrialnych.

Ten protokół opisuje technikę respirometrii opartej na fluorescencji o wysokiej przepustowości, wysokiej rozdzielczości, która kinetycznie mierzy OXPHOS i glikolityczne profile bioenergetyczne żywych komórek. Ponieważ proces OXPHOS zużywa tlen, profil bioenergetyczny OXPHOS jest tworzony poprzez mapowanie zmian wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w czasie4. W tej technice dwa fluorofory są osadzone w tulei wkładu czujnika, która jest połączona z wiązkami światłowodów, które emitują światło, wzbudzając fluorofory. Zmiany w emisji fluoroforów są mierzone przez bardzo czułe czujniki fluorescencyjne i przesyłane przez wiązkę światłowodową w celu przekształcenia w OCR readout5. Fluorofor zostaje wygaszony przez tlen, umożliwiając w ten sposób określenie zewnątrzkomórkowego poziomu tlenu w pożywce testowej, znane jako strumień tlenu lub OCR. Drugi fluorofor to sonda czujnika pH wrażliwa na zmiany wypływu protonów, który jest przekształcany w miarę szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR). Podczas pomiarów wiązki światłowodowe z wbudowanymi fluoroforami są obniżane do 200 μm nad monowarstwą ogniwa, tworząc przejściową mikrokomorę, która umożliwia szybkie odczyty w czasie rzeczywistym. Po wykryciu 10% zmiany poziomu tlenu lub protonów czujniki są podnoszone do góry, co pozwala na zmieszanie większej objętości mediów z przejściowymi mediami w mikrokomorach, przywracając wartości OCR i ECAR z powrotem do wartości wyjściowych. Każdy wkład czujnika jest wyposażony w cztery porty, które umożliwiają sekwencyjne podawanie do czterech związków na studzienkę podczas testu. Pomiary mogą być zbierane przed i po wstrzyknięciu związków w każdym porcie, ujawniając kluczowe informacje o statusie metabolicznym komórek.

Badanie tych dwóch odrębnych szlaków metabolicznych może przynieść ważne odkrycia dotyczące statusu metabolicznego RPE po ekspozycji na różne bodźce chorobotwórcze, a tym samym może być wykorzystane do przetestowania skuteczności leków w przywracaniu integralności metabolicznej RPE6,7,8. Pojawienie się wysokoprzepustowej respirometrii i dostępność specyficznych inhibitorów mitochondriów pobudziły więcej badań nad zdefiniowaniem profili bioenergetycznych RPE i identyfikacją defektów metabolizmu i mitochondriów w stanach chorobowych6,7,8,9,10,11,12,13. Respirometria o wysokiej rozdzielczości uwypukliła kluczową rolę metabolicznego przeprogramowania RPE w patologiach siatkówki, takich jak AMD i PVR. Dwie kluczowe cytokiny biorące udział w patogenezie AMD i PVR to transformujący czynnik wzrostu-beta 2 (TGFβ2) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα). Indukcji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) przez TGFβ2 towarzyszy dysfunkcja mitochondriów, supresja OXPHOS i kompensacyjny wzrost pojemności glikolitycznej w RPE6. Ostatnio wykazano, że cytokina prozapalna, TNFα, indukuje znaczną regulację w górę podstawowego OXPHOS i zmniejsza glikolizę w H-RPE7. Podanie fumaranu dimetylu znacząco stłumiło stan zapalny wywołany przez TNFα w H-RPE i przywróciło morfologię mitochondriów oraz podstawowe profile bioenergetyczne7. Rozbieżne profile metaboliczne indukowane przez te dwa czynniki wzrostu stymulują intrygujące pytania mechanistyczne dotyczące udziału przeprogramowania metabolicznego w chorobach siatkówki. Poniższy protokół opisuje etapy oceny OXPHOS i glikolitycznych profili bioenergetycznych w H-RPE przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Protokół

1. Posiewanie H-RPE na płytce do hodowli komórkowej

  1. Rozmrozić H-RPE w kolbie T25 w ludzkim pożywce RPE uzupełnionej suplementami pożywki wzrostowej RPE (4 mM L-glutamina, 25 ng / ml FGF-2, 2% FBS, 30 mg / ml gentamycyny i 15 μg / ml amfoterycyny).
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. Odśwież pożywkę następnego dnia i poczekaj, aż komórki osiągną co najmniej 80% konfluencji, zanim przelejesz w stosunku 1:3 do kolby T75.
  3. Po zlaniu się przejdź, komórki przechodzą za pomocą zestawu odczynników do subkultur składającego się z 0,025% roztworu trypsyny/EDTA, roztworu neutralizującego trypsynę i buforowanej soli fizjologicznej HEPES (pH 7,0-7,6).
    1. Delikatnie spłucz H-RPE 3 ml buforowanego soli fizjologicznej HEPES. Następnie dodać 3 ml trypsyny/EDTA i inkubować (37 °C i 5% CO2 ) przez 5 minut (lub do momentu, gdy komórki oderwą się od dna kolby, jak obserwowano pod mikroskopem). Zneutralizuj trypsynę/EDTA za pomocą 3 ml roztworu neutralizującego trypsynę.
    2. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3,5 minuty, aby uformować osad komórkowy. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.
  4. Zawiesić komórki w ludzkim pożywce RPE do końcowego stężenia 20 000 komórek na 100 μl na studzienkę.
    1. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest jednorodna, używając pipety wielokanałowej, aby ułatwić i zapewnić spójność pipetowania do 96-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej. Oprzyj końcówkę pipety tuż pod okrągłą krawędzią w górnej części studzienki, aby uzyskać równą, jednorodną warstwę komórek.
      UWAGA: Nie jest wymagane powlekanie, ponieważ komórki dobrze przylegają do mikropłytki.
    2. Upewnij się, że cztery narożne studzienki są puste z komórek (tylko 100 μl pożywki), które posłużą jako studzienki korekcyjne tła (Rysunek 1A).
      UWAGA: Mikropłytka jest sformatowana w typową konstrukcję płytki 96-dołkowej; Jednak powierzchnia każdej studzienki wynosi 0,106cm2, czyli o 40% mniej niż w przypadku standardowej płytki 96-dołkowej. Przy tej gęstości komórek komórki powinny być w 100% zlewające się następnego dnia. Zaleca się, aby przed testowaniem zabiegów najpierw przeprowadzić eksperyment optymalizacji gęstości komórek, aby upewnić się, że podstawowe odczyty OCR i ECAR wynoszą odpowiednio około 50-100 pmol/min i 10-20 mpH/min.
  5. Pozostaw płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej (RT) na 1 godzinę przed umieszczeniem jej z powrotem w inkubatorze (5% CO2, 37 °C, nawilżony), aby zminimalizować efekty krawędziowe. Efekty krawędziowe to zmiany objętości nośnika w studzienkach na obrzeżach płytki 96-dołkowej spowodowane parowaniem14.
    UWAGA: Komórki będą przylegać przez noc i utworzą zlewającą się monowarstwę następnego dnia. H-RPE dojrzewają na płytce przez co najmniej 1 miesiąc poprzez odświeżanie połowy pożywki co 2-3 dni.
  6. Zbadaj komórki pod mikroskopem przed zmianą pożywki, aby sprawdzić ich morfologię i poziom pigmentacji. Upewnij się, że komórki zlewają się z charakterystyczną morfologią przypominającą bruk i z czasem nabierają pigmentacji, jak widać na obrazach morfologii w Shu et al.7.

2. Dzień przed przeprowadzeniem testu

  1. Upewnij się, że wkład czujnika jest nawodniony dzień przed testem, wypełniając każdą studzienkę płytki użytkowej 200 μl wody dejonizowanej.
    UWAGA: Pokrywka tabliczki użytkowej zawiera fluorescencyjne biosensory do pomiaru poziomu tlenu i pH dla każdej studzienki. Czujniki są sprzężone z falowodami światłowodowymi, które dostarczają światło o różnych długościach fal wzbudzenia i przesyłają sygnał fluorescencyjny przez filtry optyczne do fotodetektorów.
  2. Umieść wkład czujnika zanurzony w wodzie na tabliczce narzędziowej wraz z ~20 ml kalibru (do rozgrzania do użycia następnego dnia) w wilgotnym piekarniku o temperaturze 37 °C (bez CO2) na noc.
    UWAGA: Kalibert jest zastrzeżonym rozwiązaniem przeznaczonym do kalibracji wkładów czujnikowych i prawdopodobnie ma podobny skład do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Minimalny czas nawodnienia wkładu to 4 godziny, ale najlepsze efekty uzyskuje się przy nawodnieniu przez noc.
  3. Upewnij się, że instrument jest włączony i uruchom oprogramowanie, aby umożliwić ustabilizowanie się przyrządu do 37 °C przez noc (Rysunek 2). Ogólnie rzecz biorąc, instrument można pozostawić włączony nawet wtedy, gdy nie jest używany.

3. Test stresu Mito w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. W dniu testu należy wymienić wodę w tabliczce użytkowej na równą objętość podgrzanego kalibru co najmniej 45 minut przed rozpoczęciem testu.
  2. Przygotować pożywkę do testu warunków skrajnych Mito przy użyciu pożywki bazowej bez czerwieni fenolowej, dodając suplementy, jak pokazano w tabeli 1. Podgrzej media do 37 °C, dostosuj pH do 7,4 i przefiltruj próżniowo media za pomocą filtra górnego z rurką. Aby uruchomić pełną płytkę, przygotuj ~ 25 ml pożywki testowej.
  3. Usunąć pożywkę dla ludzi z RPE i zastąpić ją 180 μl świeżo przygotowanej pożywki testowej (krok 3.2). Przed rozpoczęciem oznaczania umieścić płytkę z kulturą komórkową w nawilżonym piekarniku o temperaturze 37 °C (bez CO2 ) na 1 godzinę.
    UWAGA: Jest to ważne dla odgazowania płytki ogniwa, umożliwiając dyfuzję CO2 . Ponieważ komórki nie znajdują się już w pożywkach wzrostowych i nie znajdują się w inkubatorze z CO2 , ich żywotność pogarsza się z czasem, dlatego należy zadbać o jak najskuteczniejsze przeprowadzenie testu. Należy również zwrócić uwagę na to, aby na płytce do hodowli komórkowej nie było pęcherzyków powietrza; Jeśli są obecne, przebij je pipetą lub igłą.
  4. Każdy wkład czujnika ma cztery porty dostarczania odczynnika na studzienkę do wstrzykiwania związków testowych do studzienek płytki hodowli komórkowej podczas testu (Rysunek 1C, D). Przygotuj ~ 3 ml 10 roztworów leku, rozcieńczając zapasy leków w odpowiednich pożywkach testowych zgodnie z tabelą 2. Na przykład, obciążyć Port A 25 μM oligomycyny rozpuszczonej w pożywce testowej Mito Stress Test, tak aby po wstrzyknięciu objętości leku do studzienki przez przyrząd, końcowe stężenie, na które narażona jest każda komórka, wynosiło 2,5 μM. Odpipetować 20 μL 10x zapasu leku do portu A, 22 μl do portu B i 25 μl do portu C, aby osiągnąć określone końcowe stężenie leku w każdym dołku. W przypadku protokołów wymagających wszystkich czterech portów leku należy odpipetować 28 μl do portu D.
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1B podczas pipetowania leków do portów leku, aby uzyskać informacje o prawidłowej orientacji portów A/B/C/D. Wycięcie na krawędzi wkładu powinno znajdować się w lewym dolnym rogu podczas ładowania portów na lek. Pipetując pod kątem do każdego portu leku, można zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza. Jeśli są jakieś bąbelki, należy uważać, aby przebić je pipetą lub igłą.
  5. Otwórz zakładkę Szablony w oprogramowaniu do analizy, wybierz Mito Stress Test i wypełnij definicje grup.
    1. Wprowadź szczegółowe informacje na temat strategii iniekcyjnej (w tym przypadku jest ona wstępnie wprowadzona jako leki w teście wysiłkowym Mito). Szczegółowe informacje dotyczące różnych grup eksperymentalnych w teście (np. grupa kontrolna lub leczenie). Wprowadź szczegółowe informacje na temat pożywki testowej (dodanie różnych suplementów i ich specyficznych stężeń do podłoża do testu podstawowego), a na koniec dodaj typ komórki.
    2. Kliknij następną zakładkę, Mapa płyt, gdzie różne badane grupy zostaną przypisane do ich konkretnej lokalizacji na 96-dołkowej mapie płytowej. Gdy to zrobisz, kliknij kartę Protokół, aby przejrzeć protokół urządzenia dla domyślnego protokołu testu warunków skrajnych Mito.
      UWAGA: Domyślny szablon testu warunków skrajnych Mito jest gotowy do użycia, ale może być modyfikowany w dowolny sposób, aby dopasować go do projektu eksperymentalnego. Na przykład domyślny czas pomiaru to 3 minuty, ale w razie potrzeby można go zmienić na 5 minut.
  6. Kliknij Uruchom test i włóż wkład czujnika, który jest zanurzony w roztworze kalibru, w tabliczce narzędziowej. Proces ten trwa około 25 minut. Na tym etapie każdy bioczujnik jest kalibrowany niezależnie na podstawie sygnału wyjściowego czujnika zmierzonego w roztworze kalibru o znanym pH i stężeniu tlenu.
    1. Po kalibracji wyjmij tabliczkę użytkową i włóż płytkę do hodowli komórkowej.
      UWAGA: Najpierw równoważy się płytkę do hodowli komórkowej, po czym przyrząd zaczyna mieszać pożywkę testową i mierzyć wartości OCR i ECAR. Ten krok trwa około 1,5 godziny i jest wykonywany wewnątrz urządzenia bez żadnej interwencji ze strony użytkownika. Odczyt bazowy OCR i ECAR ustala się najpierw poprzez mieszanie pożywki testowej przez 3 minuty, a następnie pomiar OCR i ECAR przez 3 minuty. Instrument wykonuje trzy pętle miksowania i mierzenia.
    2. Po pomiarze podstawowym przyrząd automatycznie wstrzykuje roztwór leku Port A do każdej studzienki. Następnie następują trzy pętle mieszania i odmierzania (każda po 3 minuty). Ten sam wzorzec występuje po każdym kolejnym wstrzyknięciu leku (porty B i C).
  7. Po zakończeniu cyklu wyjmij płytkę do hodowli komórek i wkład czujnika. W celu kontroli jakości upewnij się, że wszystkie porty leku we wkładzie czujnika zostały wstrzyknięte, sprawdzając porty, aby sprawdzić, czy nie pozostały żadne resztki leku. Wyrzuć wkład czujnika i tabliczkę użytkową, ponieważ są to przedmioty jednorazowego użytku.
  8. Zbadaj komórki na mikropłytce hodowli komórkowej pod mikroskopem, aby upewnić się, że nadal występuje zlewająca się monowarstwa komórek. Wyrzucić pożywkę do oznaczania i zastąpić ją 60 μl 1x buforu do lizy w każdym dołku.
    UWAGA: Bufor do lizy składa się z 10-krotnego buforu do lizy rozcieńczonego do 1x w wodzie dejonizowanej z dodatkiem 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF).
  9. Owiń krawędzie płytki w Parafilm, aby zapobiec parowaniu, i umieść ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby wspomóc lizę komórek przez noc, przed ilościowym określeniem zawartości białka za pomocą testu BCA.
  10. W celu analizy danych znormalizuj wszystkie dane, dzieląc wartości OCR i ECAR przez mikrogram białka w każdym dołku. Eksportuj generator raportów z testu warunków skrajnych Mito, który wykorzystuje makra programu Excel do automatycznego obliczania parametrów testu warunków skrajnych Mito za pomocą oprogramowania do analizy danych.
    UWAGA: Można to wykorzystać do określenia oddychania podstawowego, maksymalnego oddychania, wolnej pojemności oddechowej, wycieku protonów, produkcji ATP i oddychania niemitochondrialnego. Definicje tych obliczeń znajdują się w tabeli 3.

4. Test stresu glikolitycznego w czasie rzeczywistym przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. Wykonaj glikolityczny test wysiłkowy, wykonując te same czynności, co w teście warunków skrajnych Mito, z wyjątkiem użycia różnych suplementów pożywek testowych i wstrzyknięć leków pokazanych w Tabeli 1 i Tabeli 2.
  2. W celu analizy danych wyeksportuj generator raportów z testu warunków skrajnych glikolitycznych, który wykorzystuje makra programu Excel do automatycznego obliczania parametrów testu warunków skrajnych glikolitycznych z oprogramowania do analizy danych.
    UWAGA: Można to wykorzystać do określenia zakwaszenia nieglikolitycznego, glikolizy, zdolności glikolitycznej i rezerwy glikolitycznej. Definicje tych obliczeń znajdują się w tabeli 3.

5. Test kwantyfikacji białka BCA

UWAGA: Test kwantyfikacyjny białka kwasu bicinchonowego (BCA) (znany również jako test Smitha15) to test kolorymetryczny na bazie miedzi używany do określania całkowitej zawartości białka w próbce. Normalizacja danych OCR i ECAR do mikrograma białka w każdym dołku zapewnia, że różne ilości komórek/białka w każdym dołku nie zniekształcają odczytów. Mechanizm testu BCA opiera się na dwóch reakcjach chemicznych. Po pierwsze, wiązania peptydowe w białkach redukują jony miedziowe (Cu2+) do jonów miedziawych (Cu +), co jest reakcją zależną od temperatury, wspomaganą wyższymi temperaturami (37 do 60 °C). Jeśli jest więcej wiązań peptydowych, ilość Cu2+ jest proporcjonalna do zawartości białka w roztworze16. Reakcja ta powoduje zmianę koloru z zielonego na intensywnie fioletowy roztwór, ze szczytową absorbancją przy 562 nm16. Im wyższa zawartość białka w próbce, tym wyższa absorbancja przy tej długości fali. Zakres roboczy tego zestawu wynosi 20-2 000 μg/ml.

  1. Zestaw do oznaczania BCA zawiera 1 ml podwielokrotności albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2 mg/ml, która służy jako wzorzec odniesienia stężenia białka. Przygotować seryjne rozcieńczenie na klarownej, płaskodennej 96-dołkowej płytce, zaczynając od nierozcieńczonego 2 mg/ml BSA, a następnie zmniejszając stężenie o połowę, rozcieńczając w wodzie dejonizowanej (np. 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/ml itp.). Wykorzystanie znanego stężenia białka pozwala na obliczenie krzywej standardowej, która służy do obliczania zawartości białka w próbkach doświadczalnych. Aby poprawić dokładność obliczonych pomiarów zawartości białka, należy zmierzyć odczyty absorbancji wzorców referencyjnych stężenia białka wraz z próbkami doświadczalnymi dla każdego testu.
  2. Odpipetować 25 μl każdego seryjnego rozcieńczenia BSA w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej.
  3. Odpipetować 25 μl 1x buforu do lizy w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej, aby służyła jako ślepa próba.
  4. Rozmrozić płytkę do hodowli komórkowej do temperatury pokojowej i odpipetować 25 μl każdego lizatu komórkowego w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej.
  5. Przygotuj odczynnik roboczy w stosunku 50:1 odczynników z zestawu BCA A:B. Dokładnie wymieszaj przez wirowanie, aby usunąć wszelkie zmętnienia z odczynnika roboczego, tak aby był to jednorodny zielony roztwór. Dodać 200 μl odczynnika roboczego do każdej studzienki.
  6. Chronić płytkę przed światłem, przykrywając ją folią i inkubować w suszarce o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  7. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm w 96-dołkowym czytniku płytek.
  8. Na potrzeby analizy danych uśrednij wszystkie zduplikowane wartości. Odejmij poziomy absorbancji ślepej próby wyznaczone z 1 studzienki buforowej do lizy od pomiarów wszystkich próbek. Określić krzywą wzorcową, wykreślając absorbancję każdego wzorca BSA do jego znanego stężenia w μg/ml. Użyj równania liniowego wyprowadzonego z krzywej standardowej, aby określić stężenie białka w próbkach doświadczalnych.

Wyniki

Przyrząd jednocześnie mierzy OCR oraz ECAR podczas każdego pomiaru. W przypadku testu stresu mitochondrialnego (Mito Stress Test) obliczenia parametrów opierają się na odczytach OCR (Rycina 3A), natomiast w przypadku testu stresu glikolitycznego (Glycolytic Stress Test) obliczenia parametrów bazują na odczytach ECAR (Rycina 3B). Na Rycini 3 przedstawiono reprezentatywne wykresy krzywej OCR w czasie dla testu stresu mitochondrialnego (Rycina 3C) oraz obliczenia parametrów w formie wykresów słupkowych dla H-RPE (Rycina 3D). Test stresu glikolitycznego przedstawiono jako krzywą ECAR w czasie (Rycina 3E), a obliczenia parametrów wyświetlono na wykresach słupkowych dla H-RPE (Rycina 3F).

Oddychanie podstawowe pozwala zrozumieć zapotrzebowanie energetyczne komórek w warunkach spoczynkowych17. Pierwsza iniekcja leku, oligomycyny (Oligo), która jest inhibitorem syntazy ATP, sprawia, że każdy spadek OCR po pierwszej iniekcji jest miarą oddychania związanego z syntezą ATP18. Jakiekolwiek pozostałe oddychanie podstawowe po kolejnych iniekcjach leków jest uznawane za przeciek protonowy, ponieważ nie jest ono sprzężone z syntezą ATP. Zwiększony przeciek protonowy może wskazywać na zwiększone rozprzęganie mitochondrialne, które jest regulowane przez białka rozprzęgające obecne fizjologicznie, ale wiązane również z takimi patologiami jak otyłość, nowotwory, cukrzyca typu 2 oraz choroby układu sercowo-naczyniowego19. Druga iniekcja polega na podaniu czynnika rozprzęgającego, takiego jak BAM15 lub FCCP, w celu określenia maksymalnego potencjału oddechowego mitochondriów. Czynniki rozprzęgające niszczą gradient protonowy i redukują siłę protonomotoryczną w obrębie wewnętrznej błony mitochondrialnej. Wynikiem jest niehamowany przepływ elektronów przez łańcuch transportu elektronów (ETC), co zwiększa tempo zużycia tlenu i powoduje, że oddychanie mitochondrialne osiąga swoją maksymalną wydajność20. Rezerwowa wydolność oddechowa (SRC) to różnica między oddychaniem maksymalnym a podstawowym, wskazująca na zdolność komórek do reagowania na zmiany zapotrzebowania energetycznego w sytuacjach stresowych, co odzwierciedla kondycję komórek. Co ważne, w przypadku testu Mito Stress Test w H-RPE, BAM15 jest skuteczniejszy niż FCCP w zwiększaniu wydolności oddychania mitochondrialnego (Rycina 4A,B), ponieważ oddychanie maksymalne i rezerwowa wydolność oddechowa są znacznie wyższe przy zastosowaniu 10 µM BAM15 w porównaniu do 500 nM lub 1 µM FCCP. Nie zaobserwowano istotnych różnic między dawkami FCCP. Trzecia i ostatnia iniekcja rotenonu i antymycyny A (Rot/AA) hamuje odpowiednio kompleksy I i III łańcucha ETC, co całkowicie zatrzymuje oddychanie mitochondrialne; każdy pozostały OCR wynika ze źródeł pozamitochondrialnych21.

Podczas glikolizy jedna cząsteczka glukozy jest przekształcana w dwie cząsteczki mleczanu w warunkach beztlenowych. Wyprowadzanie mleczanu z komórki wiąże się z odpływem jednego protonu na każdą cząsteczkę mleczanu, co prowadzi do zakwaszenia przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Strumień produkcji protonów w medium jest mierzony poprzez zmiany ECAR. W pierwszej kolejności ustala się bazowy poziom glikolizy, po czym do medium analitycznego, pozbawionego glukozy, wstrzykuje się glukozę, aby zaindukować glikolizę i tym samym zwiększyć poziom ECAR22. Następnie podaje się oligomycynę, aby wywołać „najwyższy” poziom ECAR, ponieważ hamuje ona mitochondrialną produkcję ATP, zmuszając komórkę do pozyskiwania ATP poprzez glikolizę. Na koniec glikoliza zostaje zatrzymana poprzez dodanie 2DG, który hamuje heksokinazę – pierwszy enzym glikolizy23. Wszelkie pozostałe ECAR wynikają prawdopodobnie z innych źródeł zakwaszenia, takich jak produkcja CO2 w cyklu TCA podczas OXPHOS, i są określane jako nieglikolityczny ECAR. Rezerwę glikolityczną oblicza się jako różnicę między „najwyższym” ECAR a ECAR w obecności glukozy. Wydajność glikolityczna jest sumą glikolizy i rezerwy glikolitycznej.

Eksperyment respirometryczny z mikropłytką do hodowli komórkowych, wkładem z czujnikami; oprogramowanie do analizy danych z testu.
Rycina 1: Komponenty płytki i wkładu z czujnikami. (A) Przedstawiono instrument, oprogramowanie do analizy danych oraz interfejs konfiguracji protokołu. W układzie 96-dołkowej płytki hodowlanej komórki są wysiewane do dołków zaznaczonych na niebiesko, natomiast cztery narożne dołki są zaznaczone na czarno, ponieważ służą one jako dołki korekcyjne tła, zawierające wyłącznie pożywkę (bez komórek). (B) Dla każdego dołka wkładu z czujnikami istnieją cztery porty do podawania leków, przez które można wprowadzić leki A, B, C i D. Objętości do pipetowania do każdego portu są wymienione na podstawie obliczeń dla 10x stężonych roztworów zapasowych leków. (C) Wkład z czujnikami składa się z sond sensorycznych, które są umieszczane bezpośrednio w płytce pomocniczej wypełnionej kalibrantem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przebiegu testu hodowli komórkowej, proces testu BCA, kalibracja czujnika, analiza danych.
Rycina 2: Harmonogram testu. Komórki zostają wysiane na płytce do hodowli komórkowej. Po osiągnięciu odpowiedniego stanu, test obejmuje dwudniową procedurę, po której następuje ilościowe oznaczenie zawartości białka za pomocą testu BCA oraz późniejsza analiza danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy testu stresu mitochondrialnego i glikolitycznego, analiza OCR i ECAR, respiracja, zakwaszenie.
Rycina 3: Reprezentatywne wykresy testu stresu mitochondrialnego (Mito Stress Test) oraz testu stresu glikolitycznego (Glycolytic Stress Test). Na schemacie przedstawiono obliczenia parametrów dla (A) testu stresu mitochondrialnego oraz (B) testu stresu glikolitycznego. Przedstawiono reprezentatywną krzywą zużycia tlenu (OCR) (C) oraz parametry testu stresu mitochondrialnego (D) dla H-RPE. Przedstawiono reprezentatywną krzywą zewnątrzkomórkowego tempa zakwaszania (ECAR) (E) oraz parametry testu stresu glikolitycznego (F) dla H-RPE. Słupki błędów oznaczają średnie ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki testu stresu mitochondrialnego OCR; wykresy porównują stężenia BAM15 i FCCP; analiza oddychania.
Rycina 4: Porównanie BAM15 i FCCP jako czynników odsprzęgających. Test stresu mitochondrialnego na komórkach H-RPE porównujący skuteczność indukowania oddychania maksymalnego przy użyciu 10 µM BAM15, 500 nM FCCP lub 1 µM FCCP, przedstawiający (A) krzywą szybkości zużycia tlenu (OCR) oraz (B) parametry testu stresu mitochondrialnego. Słupki błędów reprezentują średnie ± SEM. **** p ≤ 0.0001; ns, brak istotności statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

TestGlukoza (mM)GlutaMax (mM)Pirogronian sodu (mM)HEPES (mM)
Test stresu mitochondrialnego25211
Test stresu glikolitycznegoProszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.0.5Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.1

Tabela 1: Stężenie suplementów dodanych do pożywek testowych dla testów stresu mitochondrialnego i glikolitycznego.

 TestPort APort BPort C
Test stresu mitochondrialnegoOligomycin 2.5 μMFCCP 500 nM LUB BAM15 10 μMRotenone 2 μM ORAZ Antimycin A 2 μM
Test stresu glikolitycznegoGlucose 10 mMOligomycin 2 μM2-Deoxyglucose 50 mM

Tabela 2: Stężenia leków w portach wtryskowych dla testów stresu mitochondrialnego i glikolitycznego. Należy zauważyć, że są to stężenia końcowe, na które wystawione są komórki po wtryśnięciu leków do każdej studzienki. Podczas napełniania portów wtryskowych leki powinny być przygotowane w stężeniu 10-krotnie większym.

Termin Definicja 
Kalibrant Kalibrant jest roztworem służącym do kalibracji wkładu z czujnikiem. Jego skład jest zastrzeżony i zbliżony do składu PBS.
Wkład czujnika Wkład sensora zawiera dwa fluorofory osadzone w tulei wkładu, które są połączone z wiązkami światłowodowymi emitującymi światło wzbudzające fluorofory. Jeden fluorofor mierzy strumień tlenu, a drugi strumień protonów. Każdy wkład sensora jest również wyposażony w 4 porty, co umożliwia sekwencyjną aplikację do 4 związków na dołek podczas analizy.
Płytka pomocnicza Płyta pomocnicza (znana również jako płyta kalibracyjna) służy do kalibracji czujników. Roztwór kalibracyjny umieszcza się w płycie pomocniczej.
Test stresu mitochondrialnegoTest stresu mitochondrialnego (Mito Stress Test) to nazwa analizy, która pozwala na określenie bioenergetycznego profilu oddychania mitochondrialnego poprzez wykreślenie zmian OCR w czasie.
Test stresu glikolitycznego Test stresu glikolitycznego to nazwa analizy, która pozwala na określenie glikolitycznego profilu bioenergetycznego poprzez wykreślenie zmian ECAR w czasie.
Wskaźnik zużycia tlenu (OCR)Współczynnik zużycia tlenu jest miarą strumienia tlenu (pmol/min) i wskazuje stan metaboliczny mitochondriów. 
Wskaźnik zakwaszenia środowiska zewnętrznego (ECAR)Zewnątrzkomórkowy wskaźnik zakwaszenia jest miarą odpływu protonów (mpH/min) i wskazuje na status metaboliczny glikolityczny.
Oprogramowanie Wave Oprogramowanie Wave służy do programowania testu oraz późniejszej analizy danych
Niemitochondrialne zużycie tlenuPomiar minimalnego tempa po wstrzyknięciu rotenonu/antymycyny A
Oddychanie podstawowe(Ostatni pomiar szybkości przed pierwszą injekcją) – (Szybkość oddychania pozimitochondrialnego)
Maksymalne oddychanie(Maksymalna wartość pomiaru szybkości po wstrzyknięciu FCCP) – (Oddychanie pozimitochondrialne)
H+ Przeciek (protonowy)(Minimalna wartość pomiaru po wstrzyknięciu oligomycyny) – (Oddychanie niemitochondrialne)
Produkcja ATP(Ostatni pomiar szybkości przed wstrzyknięciem oligomycyny) – (Minimalny pomiar szybkości po wstrzyknięciu oligomycyny)
Rezerwa wydolności oddechowej(Oddychanie maksymalne) – (Oddychanie podstawowe)
Rezerwa wydolności oddechowej wyrażona w %(Oddychanie maksymalne) / (Oddychanie podstawowe) × 100
Wydajność sprzęgania(Wskaźnik produkcji ATP) / (Wskaźnik oddychania podstawowego) × 100
Glikoliza(Maksymalny pomiar szybkości przed wstrzyknięciem oligomycyny) – (Ostatni pomiar szybkości przed wstrzyknięciem glukozy)
Wydajność glikolityczna(Maksymalny pomiar szybkości po wstrzyknięciu oligomycyny) – (Ostatni pomiar szybkości przed wstrzyknięciem glukozy)
Rezerwa glikolityczna(Wydajność glikolityczna) – (Glikoliza)
Rezerwa glikolityczna wyrażona w %(Wydajność glikolityczna) / (Glikoliza) × 100
Zakwaszenie nieglikolityczneOstatni pomiar szybkości przed wstrzyknięciem glukozy

Tabela 3: Lista definicji kluczowych komponentów testu.

Dyskusja

Ten zoptymalizowany protokół respirometrii H-RPE o wysokiej rozdzielczości obejmuje użycie BAM15 jako rozprzęgacza zamiast powszechnie stosowanego FCCP. Podczas gdy poprzednie badania nad respirometrią RPE w wysokiej rozdzielczości wykorzystywały FCCP 9,24, BAM15 wydaje się indukować bardziej silną indukcję maksymalnych poziomów oddychania w H-RPE w porównaniu z FCCP. Chociaż zarówno FCCP, jak i BAM15 są bezpieczne do stosowania w komórkach, BAM15 ma mniej skutków ubocznych w normalnych komórkach w porównaniu z FCCP lub karbonylocyjankiem-3-chlorofenylohydrazonem (CCCP)25. Kenwood i in. wykazali, że BAM15 depolaryzuje mitochondria bez wpływu na potencjał błony plazmatycznej, indukując w ten sposób utrzymującą się maksymalną szybkość oddychania mitochondrialnego przy niskiej cytotoksyczności26. Z drugiej strony FCCP depolaryzuje zarówno mitochondria, jak i błonę plazmatyczną i wykazuje wyższą cytotoksyczność26.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, w tym zapewnienie, że komórki są prawidłowo posiane w zlewającej się, równej i jednorodnej monowarstwie RPE we wszystkich eksperymentalnych dołkach mikropłytki. Dojrzałe RPE są w dużym stopniu zależne od OXPHOS w zakresie wytwarzania energii, a zatem komórki powinny mieć możliwość dojrzewania przez co najmniej 1 miesiąc, aby zapewnić, że RPE generują odpowiednie podstawowe i maksymalne odczyty OCR podczas testu. Odgazowywanie płytki do hodowli komórkowej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnym piecu (bez CO2 ) przed umieszczeniem jej w przyrządzie ma kluczowe znaczenie dla dokładnych odczytów ECAR, ponieważ CO2 może wpływać na pH podłoża testowego. Ważne jest, aby pamiętać o nawodnieniu wkładu czujnika dzień przed testem, aby upewnić się, że zapewnia on wiarygodne odczyty OCR i ECAR w dniu testu. Należy dołożyć starań, aby prawidłowo rozpuścić leki przeznaczone do wstrzykiwań i podzielić odtworzone zapasy leków na mniejsze objętości do długotrwałego przechowywania, aby zminimalizować cykle zamrażania/rozmrażania. Bardzo ważne jest, aby przygotować 10 razy roztwory leków, które są rozcieńczane w odpowiednich pożywkach testowych (np. rozcieńczonych w pożywce testowej Mito Stress Test dla testu warunków skrajnych Mito), aby uwzględnić rozcieńczenie po wstrzyknięciu leku do każdej studzienki wypełnionej pożywką testową. Z każdym kolejnym wstrzyknięciem leku w każdym dołku znajduje się więcej pożywki, a co za tym idzie, objętości ładowanego leku zwiększają się z każdym wstrzyknięciem i należy zachować ostrożność, aby przestrzegać objętości określonych w protokole. Ważne jest, aby po zakończeniu eksperymentu przeprowadzić kontrolę jakości poprzez zbadanie wkładu czujnika, aby upewnić się, że nie jest widoczne żadne pozostałości leku i obserwację płytki hodowli komórkowej pod mikroskopem, aby upewnić się, że pozostaje zlewająca się i jednorodna monowarstwa komórkowa.

Modyfikacje tego protokołu obejmują wstrzykiwanie różnych leków do portów i określanie, w jaki sposób te leki wpływają na odczyty OCR i ECAR. Jedną z popularnych modyfikacji jest wstrzyknięcie eksperymentalnego leku z wyboru jako Port A przed wstrzyknięciem zwykłych leków Mito lub Glycolytic Stress Test. Ten rodzaj protokołu zapewnia wgląd w to, w jaki sposób ostre wstrzyknięcie wybranego leku wpływa na późniejsze parametry OXPHOS i glikolityczne. Inne modyfikacje obejmują badanie różnych typów komórek; wymaga to wstępnego rozwiązywania problemów związanych z optymalną gęstością komórek wysiewu i optymalizacją pożywki testowej poprzez zapewnienie, że podstawowe odczyty mieszczą się w zakresie 50-100 pmol/min dla OCR i 10-20 mpH/min dla ECAR. Optymalne stężenia leków podawanych do wstrzykiwań należy określić dla każdego nowego badanego typu komórek, obserwując reakcje OCR i ECAR na seryjne rozcieńczanie leków.

Kluczowym ograniczeniem protokołu jest to, że żywotność komórek zmniejsza się z czasem, ponieważ komórki nie znajdują się w inkubatorze CO2 w swoich normalnych pożywkach wzrostowych, a zatem test powinien zostać zakończony w ciągu 3-4 godzin, aby zapewnić maksymalną żywotność komórek. Co więcej, narażenie na toksyny mitochondrialne wstrzykiwane do każdej studzienki może z czasem jeszcze bardziej zmniejszyć żywotność komórek. Po zakończeniu testu komórki muszą zostać poddane lizie w celu oceny zawartości białka w celu normalizacji odczytów OCR i ECAR, a zatem te same komórki nie mogą być pobrane do kolejnych testów biologii molekularnej.

Alternatywą dla konika morskiego do profilowania bioenergetycznego są Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 i Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k to zamknięty dwukomorowy respirometr, który wykorzystuje polarograficzne elektrody tlenowe typu S1 Clarka. Podczas gdy Oroboros O2k wykonuje bardzo czułe pomiary strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym, urządzenie jest pracochłonne, ponieważ operator musi ręcznie wstrzyknąć każdy lek30. BaroFuse to nowatorski wielokanałowy system perfuzji mikroprzepływowej, który wykorzystuje ciśnienie gazu, aby umożliwić wiele równoległych eksperymentów perfuzyjnych i jest połączony z systemem detekcji tlenu do pomiaru OCR. Zaletą tego systemu hodowli przepływowej jest to, że funkcja i żywotność tkanek są zachowane, w przeciwieństwie do konika morskiego, w którym żywotność komórek zmniejsza się wraz z dłuższymi testami. Resipher wykorzystuje bardzo czułe optyczne czujniki tlenu do pomiaru OCR, podczas gdy komórki znajdują się na 96-dołkowej płytce w inkubatorze, umożliwiając w ten sposób ciągłe pomiary OCR przez kilka tygodni lub miesięcy. Warto zauważyć, że instrumenty te nie mierzą ECAR, a zatem konik morski ma tę przewagę, że umożliwia jednoczesną eksplorację zarówno OXPHOS, jak i glikolizy.

Badanie w czasie rzeczywistym profili bioenergetycznych OXPHOS i glikolizy staje się kluczowym czynnikiem w charakterystyce zdrowia i funkcji RPE. Respirometria o wysokiej rozdzielczości umożliwia skuteczne porównywanie stanu metabolicznego prawidłowego i chorego RPE, otwierając w ten sposób nowe możliwości badań przesiewowych skuteczności leków w chorobach siatkówki, takich jak AMD i PVR. Przyszłe kierunki respirometrii w wysokiej rozdzielczości na RPE obejmują optymalizację protokołu badania profili bioenergetycznych dla wysoce spolaryzowanych monowarstw RPE hodowanych na filtrach transwell. Calton i in. (2016) z powodzeniem osiągnęli to, przecinając trójkątny przekrój spolaryzowanej monowarstwy RPE wyhodowanej na filtrach transwell31. Dalsze rozszerzanie metodologii obejmuje badanie profili bioenergetycznych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych (iPSC-RPE), wyizolowanych od pacjentów z różnymi chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki32. Zbadanie, w jaki sposób patogenne cytokiny zaangażowane w AMD i PVR wpływają na dynamiczną naturę metabolizmu RPE, może ujawnić podatności metaboliczne, które mogą pomóc w identyfikacji nowych celów leczniczych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez granty z: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); Program stypendialny podoktorancki Fundacji BrightFocus w zakresie badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej (M2021010F, D.Y.S.); Departament Obrony, Program Badań nad Wzrokiem Kręgosłupa w ramach Nagrody nr VR180132 (M.S.-G. i L.A.K.); National Eye Institute of the National Institutes of Health w ramach Nagrody nr R01EY027739 (L.A.K.). Podziękowania są skierowane do darczyńców M2021010F Badań nad Zwyrodnieniem Plamki Żółtej, programu Fundacji BrightFocus, za wsparcie tych badań. Schematy zostały stworzone za pomocą Biorender.com

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Deoksy-D-glukozaSigma D8375-5GRozpuszczony w pożywce do oznaczania glikolitycznego z postaci proszku i użyty w teście stresu glikolitycznego (wstrzyknięcie portu C)
96 Well Non-Treated Plate, 5 sztuk w opakowaniu, sterylna229597BCA VWR Test 96-dołkowa
Antymycyna A z  Streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor kompleksu III łańcucha transportu elektronów (część wstrzyknięcia leku Port C wraz z rotenonem)
BAM15SigmaSML1760-5MGŚrodek rozprzęgający stosowany do testu warunków skrajnych Mito (wstrzyknięcie portu B)
Test BCAThermoFisher23225Aby określić całkowitą zawartość białka w każdym dołku
Roztwór CalibrantSeahorse Bioscience 100840-000Roztwór używany do kalibracji sond wkładu czujnika
Bufor do lizy komórek 10xCell Signaling Technologies9803SRozcieńczyć 10x bufor do lizy komórek do 1x roztworu za pomocą wody dejonizowanej i dodać 1 mM PMSF przed użyciem
Roztwór D-(+)-glukozySigmaG8644-100MLSuplement, który należy dodać do pożywki testowej Mito Stress Test, a także stosować w teście stresu glikolitycznego (wstrzyknięcie portu A)
DMSO, Klasa hodowli komórkowejSigma-aldrichD4540-100MLDo odtwarzania wszystkich leków mitochondrialnych z wyjątkiem 2DG
FCCPSigmaC2920-10MGŚrodek rozprzęgający stosowany do testu warunków skrajnych Mito (wstrzyknięcie portu B)
GlutaMAXGibco35050061Suplement, który należy dodać do podłoża testowego zarówno dla testów warunków skrajnych Mito, jak i glikolitycznych
Roztwór HEPESSigmaH0887-100MLSuplement, który należy dodać do pożywki testowej zarówno dla mito, jak i glikolitycznych testów warunków skrajnych
H-RPE – Ludzkie komórki nabłonka barwnikowego siatkówkiLonza194987Pierwotne ludzkie płodowe komórki RPE
Oligomycyna - CAS 1404-19-9 - CalbiochemSigma495455-10MGInhibitor syntazy ATP stosowany w teście wysiłkowym Mito (wstrzyknięcie do portu A) i teście stresu glikolitycznego (wstrzyknięcie do portu B)
ParafilmBemisPM996Aby uszczelnić płytkę po lizie komórek, aby zapobiec parowaniu w zamrażarce
Inhibitor proteazy fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)Gold Biotechnology Inc50-153-2823Stosowany w 1 mM do roztworu 1x bufor do lizy komórek
ReagentPack  Odczynniki do subkultur, 100 mlLonzaCC-5034Odczynniki pasażujące do pierwotnych ludzkich płodowych komórek RPE. Każdy zestaw zawiera 100 ml trypsyny/EDTA, roztwór neutralizujący trypsynę, buforowany rotenon soli fizjologicznej HEPES
SigmaR8875-1GInhibitor kompleksu I łańcucha transportu elektronów (część iniekcji leku Port C wraz z antymycyną A)
RtEGM Pożywka do wzrostu komórek nabłonkowych z pigmentem siatkówki BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) i suplementy RtEGMTM SingleQuots (00195407)Lonza195409Pożywka dla pierwotnych komórek RPE ludzkiego płodu
Analizator Seahorse XFe96Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczościAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Zawiera 96-dołkową mikropłytkę do hodowli komórek konika morskiego, wkład czujnika i roztwór kalibru
Roztwór pirogronianu soduSigmaS8636-100MLSuplement, który należy dodać do pożywki testowej Mito Stress Test
Steriflip-GP Sterylny filtr górny w probówce wirówkowej, objętość procesowa 50 ml, 0,22 i mikro; m wielkość porówMillipore-SigmaSCGP00525 Jednostka filtrująca górna rurka do sterylnej filtracji podłoża testowego
Czytnik płytek Synergy H1BioTekCzytnik płytek do pomiaru absorbancji przy długości fali 562 nm do testu BCA
Pożywka bazowa XF bez czerwieni fenolowej Agilent103335-100Pożywka bazowa do przeprowadzania testu konika morskiego

Bibliografia

  1. He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
  2. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271(2020).
  3. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
  4. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850(2018).
  5. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  6. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701(2021).
  7. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786(2022).
  8. Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640(2018).
  9. Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
  10. Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641(2019).
  11. Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319(2016).
  12. Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062(2021).
  13. Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212(2019).
  14. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
  17. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245(2021).
  18. Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
  19. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
  20. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  21. Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
  22. Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916(2014).
  23. Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213(2020).
  24. Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).
  25. Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948(2022).
  26. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  27. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  28. Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210(2016).
  29. Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716(2021).
  30. Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864(2022).
  31. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
  32. Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320(2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nab onek pigmentowy siatk wkiprofilowanie bioenergetyczneszybko zu ycia tlenuszybko zakwaszenia zewn trzkom rkowegotest stresu mitochondrialnegotest stresu glikolitycznegofunkcja mitochondrialnadysfunkcja metabolicznaBAM15 czynnik rozprz gaj cy
Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.