Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków

Summary

Celem tego badania jest wykazanie wykonalności separacji opartej na flotacji w celu izolacji, aktywacji i ekspansji pierwotnych ludzkich limfocytów T.

Abstract

Proces izolowania limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w celu założenia hodowli ex vivo jest kluczowy dla badań, testów klinicznych i terapii komórkowych. W tym badaniu przedstawiono prosty, nowatorski protokół izolacji, aktywacji i ekspansji limfocytów T z PBMC ex vivo. W badaniu wykorzystano technologię funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wyporem (BACS) do izolacji i aktywacji limfocytów T. Krótko mówiąc, protokół obejmuje pozytywną selekcję komórek CD3 ⁺ z PBMC pochodzących z leukopaku, a następnie 48-godzinną kostymulację wstępnie sprzężonymi mikropęcherzykami streptawidyny związanymi z anty-CD28 (SAMB) przed transdukcją w 24-dołkowych płytkach. Funkcjonalizowane mikropęcherzyki oferują wyjątkową możliwość aktywowania komórek, prowadząc do proliferacyjnych fenotypów, które pozwalają na ekspansję przy minimalnym wyczerpaniu. Technika ta zapewnia zmniejszone wyczerpanie, ponieważ mikropęcherzyki kostymulujące pozostają wyporne i wracają na wierzch pożywki hodowlanej, skracając w ten sposób czas, w którym rozprężające się komórki stykają się z czynnikami kostymulującymi. Wyniki wskazują, że wyizolowane i wyhodowane limfocyty T otrzymują wystarczającą stymulację, aby aktywować i proliferować, ale nie w stopniu, który prowadzi do nadmiernej aktywacji, co z kolei prowadzi do wyczerpania, o czym świadczy obecność nadmiernej ilości PD-1.

Introduction

Obecnie na całym świecie prowadzonych jest ponad 500 badań klinicznych nad terapią komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T, a na rynku dostępne są cztery produkty terapii komórkowej CAR-T¹. Jednak nadal istnieje wiele potrzeb w zakresie badań i produkcji komórek CAR-T, które należy zaspokoić, aby poprawić skuteczność, skalowalność i długoterminowy sukces tych potencjalnie leczniczych terapii^2,3,4,5. Adoptywne badania kliniczne i produkcja komórek CAR-T rozpoczynają się od izolacji limfocytów T z prób....

Protocol

1. Izolacja limfocytów T za pomocą mikropęcherzyków za pomocą selekcji pozytywnej

UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje podejście do pozytywnej selekcji CD3⁺ na małą skalę przy użyciu SAMB.

1. Inkubować 3 x 10⁸ komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 ml buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3 (OKT3) w stężeniu 25 ng przeciwciała na 1 milion komórek (25 ng / M). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Dodać mikropęcherzyki streptawidyny (SAMB) w stosunku 0,5 (ilość SAMB):1 (ilość komórek) zgodnie ze stężenie....

Results

T limfocyty zostały wyizolowane z zakupionych PBMC i posiane do aktywacji zgodnie z opisem w protokole. Ujemne próbki kontrolne (zakupione PBMC) nie były aktywowane. Te próbki kontrolne zostały włączone w celu wykazania wpływu, jaki proces aktywacji mikropęcherzyków wywarł na próbki eksperymentalne w porównaniu z nietkniętymi i niestymulowanymi kontrolami limfocytów T, zapewniając, że zaobserwowane markery aktywacji były wynikiem dodanych czynników aktywacji i nie były nieodłącznie związane z samymi komórkami T. Zgodnie .......

Discussion

Opisany protokół pozwala na izolację limfocytów T z próbek PBMC oraz aktywację zawieszonych limfocytów T w pożywkach hodowlanych z mikropęcherzykami. Metoda ta opiera się na funkcjonalizowanych mikropęcherzykach, których naturalna wyporność daje wyjątkową możliwość wprowadzenia sygnałów kostymulujących do komórek i aktywacji ich, gdy są zawieszone w pożywce hodowlanej, zmniejszając w ten sposób ekspozycję rozszerzających się komórek na długotrwałą stymulację; taka nadmierna stymulacja może skutkować zwiększoną ekspresją .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-dołkowe płytki	VWR	76081-560
Biotyna anty-ludzka CD28 (28.2) Przeciwciało	Biolegend	302904
Biotyna anty-ludzka CD3 (OKT3) Przeciwciało	Biolegend	317320
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190-136
Suplement GlutaMAX	Thermofisher	35050061
Ludzki rekombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Cząsteczka lentiwirusowa rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normalne ludzkie PBMC	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicylina/Streptomycyna 100X do hodowli tkankowej	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polibren Odczynnik do infekcji / transfekcji	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS: 28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Plasma Plasma Inaktywowana	termicznie Innowacyjne badania	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX, HEPES	Gibco	72400047
zestaw mikropęcherzyków streptawidyny (zawiera bufor separacyjny Akadeum)	Akadeum	11110-000