Method Article

Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków

DOI:

10.3791/64573

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania jest wykazanie wykonalności separacji opartej na flotacji w celu izolacji, aktywacji i ekspansji pierwotnych ludzkich limfocytów T.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces izolowania limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w celu założenia hodowli ex vivo jest kluczowy dla badań, testów klinicznych i terapii komórkowych. W tym badaniu przedstawiono prosty, nowatorski protokół izolacji, aktywacji i ekspansji limfocytów T z PBMC ex vivo. W badaniu wykorzystano technologię funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wyporem (BACS) do izolacji i aktywacji limfocytów T. Krótko mówiąc, protokół obejmuje pozytywną selekcję komórek CD3 + z PBMC pochodzących z leukopaku, a następnie 48-godzinną kostymulację wstępnie sprzężonymi mikropęcherzykami streptawidyny związanymi z anty-CD28 (SAMB) przed transdukcją w 24-dołkowych płytkach. Funkcjonalizowane mikropęcherzyki oferują wyjątkową możliwość aktywowania komórek, prowadząc do proliferacyjnych fenotypów, które pozwalają na ekspansję przy minimalnym wyczerpaniu. Technika ta zapewnia zmniejszone wyczerpanie, ponieważ mikropęcherzyki kostymulujące pozostają wyporne i wracają na wierzch pożywki hodowlanej, skracając w ten sposób czas, w którym rozprężające się komórki stykają się z czynnikami kostymulującymi. Wyniki wskazują, że wyizolowane i wyhodowane limfocyty T otrzymują wystarczającą stymulację, aby aktywować i proliferować, ale nie w stopniu, który prowadzi do nadmiernej aktywacji, co z kolei prowadzi do wyczerpania, o czym świadczy obecność nadmiernej ilości PD-1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie na całym świecie prowadzonych jest ponad 500 badań klinicznych nad terapią komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T, a na rynku dostępne są cztery produkty terapii komórkowej CAR-T1. Jednak nadal istnieje wiele potrzeb w zakresie badań i produkcji komórek CAR-T, które należy zaspokoić, aby poprawić skuteczność, skalowalność i długoterminowy sukces tych potencjalnie leczniczych terapii2,3,4,5. Adoptywne badania kliniczne i produkcja komórek CAR-T rozpoczynają się od izolacji limfocytów T z próbki krwi obwodowej, a następnie stymulacji, transdukcji i ekspansji izolowanych komórek. Parametry takie jak regeneracja limfocytów T, czystość i sygnały aktywacji/wyczerpania wymagają starannego rozważenia przy wyborze technik izolacji i stymulacji komórek do badań i produkcji komórek CAR-T3,4,6. Co ważne, poprawa trwałości terapeutycznej terapii komórkami CAR-T poprzez zminimalizowanie przeszkód biologicznych wynikających z obecnych procesów produkcyjnych, takich jak wyczerpanie limfocytów T, jest niezbędna do zwiększenia skuteczności terapeutycznej6,7.

Jako alternatywę dla tradycyjnych metod izolacji komórek, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS), tutaj pokazano sortowanie komórek aktywowane wyporem (BACS) z mikropęcherzykami do izolacji komórek T. Separacja mikropęcherzyków wykorzystuje pływające, puste w środku mikrosfery (mikropęcherzyki) do wiązania celów i unoszenia ich na powierzchni próbek płynów8,9. Poprzez funkcjonalizację mikropęcherzyków przeciwciałami (tj. Anty-CD3), pożądane populacje limfocytów T mogą być pozytywnie wybrane z próbek krwi obwodowej. Następnie w pracy wykazano zastosowanie innej populacji mikropęcherzyków funkcjonalizowanych przeciwciałami (tj. anty-CD28) do kostymulacji i aktywacji pozytywnie wybranych limfocytów T w zawiesinie. Mikropęcherzyki oferują prosty i wysoce regulowany przepływ pracy izolacji i aktywacji, który generuje limfocyty T gotowe do zawieszonej hodowli komórkowej i dalszych zastosowań, takich jak modyfikacja genetyczna i ekspansja. Co najważniejsze, aktywacja komórek za pomocą mikropęcherzyków sprzyja powściągliwej stymulacji komórek, aby zapobiec nadmiernemu wyczerpaniu limfocytów T7.

Dla tego badania, cytometria przepływowa była podstawowym narzędziem używanym do analizy sukcesu izolacji, aktywacji i transdukcji funkcjonalizowanych mikropęcherzyków, a także do dostarczania szczegółowych informacji o konkretnych subpopulacjach obecnych podczas faz wzrostu i ekspansji po transdukcji. Oprócz cytometrii przepływowej wykorzystano mikroskopię jasnego pola i fluorescencji, aby potwierdzić zdrowie komórek, morfologię i sukces transdukcji. Opierając się na tych wynikach, technologia i protokół mikropęcherzyków stanowią bardziej dostrajalną i łagodniejszą alternatywę dla tradycyjnych metod izolacji i aktywacji, które są obecnie stosowane; w szczególności komórki aktywowane mikropęcherzykami wykazują znacznie niższą ekspresję markerów wyczerpania limfocytów T niż zwykle obserwowane przy użyciu standardowych narzędzi i zestawów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja limfocytów T za pomocą mikropęcherzyków za pomocą selekcji pozytywnej

UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje podejście do pozytywnej selekcji CD3+ na małą skalę przy użyciu SAMB.

  1. Inkubować 3 x 108 komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 ml buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3 (OKT3) w stężeniu 25 ng przeciwciała na 1 milion komórek (25 ng / M). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Dodać mikropęcherzyki streptawidyny (SAMB) w stosunku 0,5 (ilość SAMB):1 (ilość komórek) zgodnie ze stężeniem SAMB podanym przez producenta.
  3. Mieszać za pomocą komercyjnego rotatora typu end-over-end (EOE) przy 20 obr./min przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej.
  4. Po odwirowaniu, pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z SAMB. Pozostałe niewybrane komórki znajdą się w granulce komórek na dnie probówki. Za pomocą szklanej pipety o średnicy 9 cali włóż końcówkę poniżej warstwy komórek pęcherzykowych na dno probówki, odessaj osad komórek i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieś je do nowej probówki.

2. Kostymulacja (aktywacja) pozytywnie wybranych limfocytów T

  1. Ponownie zawiesić warstwę komórek bąbelkowych pozostałą w oryginalnej probówce w 1 ml kompletnego podłoża z komórek T (lub innego pożądanego podłoża).
  2. Policz komórki w subnatance za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu automatycznego licznika komórek i odejmij tę wartość od początkowej liczby komórek, aby określić liczbę komórek przechwyconych w warstwie komórek bąbelkowych.
  3. Przed tym etapem należy mieszać biotynylowane przeciwciało anty-CD28 z dostępnymi na rynku SAMB przez co najmniej 2 godziny, aby uzyskać sprzężone przeciwciała anty-CD28 SAMB. Skontaktuj się z producentem SAMBs, aby określić ilość przeciwciała anty-CD28 potrzebną do koniugacji. Dodaj sprzężone SAMB anty-CD28 do zawiesiny komórek pęcherzykowych wynikającej z kroku 2.1 w stosunku 1,5 (SAMB anty-CD28):1 (komórki).
  4. Mieszać przy użyciu rotacji EOE przez 15 minut, a następnie dostosować całkowitą objętość do 2 milionów komórek na ml z kompletną pożywką z komórek T lub inną pożądaną pożywką zgodnie z liczbą komórek uzyskaną w kroku 2.2.

3. Ekspansja współstymulowanych komórek w pożywce do hodowli komórkowych

  1. Rozprowadzić 1 ml aktywowanych komórek z kroku 2.4 w stężeniu 2 M/ml na dołek na płytkę 24-dołkową. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Po 24 godzinach dodać 50 U/ml IL-2 i 25 ng/m rozpuszczalnego anty-CD3 (OKT3), aby jeszcze bardziej zachęcić do ekspansji, zgodnie z obliczeniami na podstawie początkowej liczby komórek posianych w dniu 0. Umieścić płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze CO2 i pozostawić do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C.

4. Opcjonalnie: Transdukcja aktywowanych limfocytów T za pomocą lentiwirusa

UWAGA: Podejście użyte tutaj jest zaczerpnięte z Prommersberger et al.10.

  1. Rozmrozić lentiwirusa w temperaturze pokojowej i krótko wymieszać pipetując.
  2. Delikatnie usunąć środkowy natant, 600 μl z każdej studzienki, nie dotykając komórek potomnych, które znajdują się teraz na dnie studzienki lub warstwy pęcherzyków, która pozostała na powierzchni roztworu.
  3. Dodać 5 μg/ml bromku heksadimetryny na studzienkę, aby zwiększyć transdukcję wirusa. Dodaj cząsteczki lentiwirusa przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3 (cząstki lentiwirusa na komórkę).
  4. Odwirować płytkę przez 45 minut przy 800 x g i temperaturze 32 °C, stosując powolne przyspieszanie i bez przerw na zwalnianie. Inkubować komórki przez 4 godziny w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Po 4 godzinach dodać 600 μl dostępnej, świeżej, kompletnej pożywki z limfocytów T i 50 U/ml IL-2 do każdej studzienki i umieścić płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w celu ekspansji limfocytów T.

5. Ekspansja limfocytów T (z lub bez wcześniejszej transdukcji)

  1. Co 2 dni usuwaj połowę pożywki ze środkowego natantu, zastąp ją świeżą, kompletną pożywką z limfocytów T i dodaj IL-2 w stężeniu 50 U/ml.
  2. Policz limfocyty T dwa razy w tygodniu, aby ocenić gęstość komórek. Gdy gęstość komórek przekroczy 2 x 10 6-2,5 x 106 komórek / ml, przenieś komórki do większego naczynia, rozcieńczając je do 5 x 105 komórek / ml.

6. Pobieranie limfocytów T i cytometria przepływowa

  1. Delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki, pipetując w górę i w dół. Usuń całą zawartość studzienki, w tym mikropęcherzyki, i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Przemyć każdą studzienkę 400 μl DPBS bez wapnia i magnezu (−/−) i przenieść roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu separacyjnego.
  4. Wybarwić koktajlem przeciwciał aktywujących i wyczerpujących/barwiących i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przygotuj koktajle barwiące w następujący sposób: koktajl aktywacyjny: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; koktajl wydechowy: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. Dodać 1 ml buforu separacyjnego i delikatnie wymieszać. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wypłukać nadmiar przeciwciał. Całkowicie odessać supernatant.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu separacyjnego i przenieść do odpowiedniego naczynia (np. probówki FACS, płytki 96-dołkowej itp.) w celu analizy cytometrii przepływowej. Zalecany schemat bramkowania analizy cytometrii przepływowej jest szczegółowo opisany w Rysunek 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T limfocyty zostały wyizolowane z zakupionych PBMC i posiane do aktywacji zgodnie z opisem w protokole. Ujemne próbki kontrolne (zakupione PBMC) nie były aktywowane. Te próbki kontrolne zostały włączone w celu wykazania wpływu, jaki proces aktywacji mikropęcherzyków wywarł na próbki eksperymentalne w porównaniu z nietkniętymi i niestymulowanymi kontrolami limfocytów T, zapewniając, że zaobserwowane markery aktywacji były wynikiem dodanych czynników aktywacji i nie były nieodłącznie związane z samymi komórkami T. Zgodnie ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół pozwala na izolację limfocytów T z próbek PBMC oraz aktywację zawieszonych limfocytów T w pożywkach hodowlanych z mikropęcherzykami. Metoda ta opiera się na funkcjonalizowanych mikropęcherzykach, których naturalna wyporność daje wyjątkową możliwość wprowadzenia sygnałów kostymulujących do komórek i aktywacji ich, gdy są zawieszone w pożywce hodowlanej, zmniejszając w ten sposób ekspozycję rozszerzających się komórek na długotrwałą stymulację; taka nadmierna stymulacja może skutkować zwiększoną ekspresją ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy, w momencie składania zgłoszenia, są pracownikami firmy Akadeum Life Sciences, która zajmuje się produkcją i sprzedażą produktów do separacji mikropęcherzyków.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-dołkowe płytkiVWR 76081-560
Biotyna anty-ludzka CD28 (28.2) PrzeciwciałoBiolegend302904
Biotyna anty-ludzka CD3 (OKT3) PrzeciwciałoBiolegend317320
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190-136
Suplement GlutaMAXThermofisher35050061
Ludzki rekombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
Cząsteczka lentiwirusowa rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normalne ludzkie PBMCBioIVTHUMANHLPB-0002562
Penicylina/Streptomycyna 100X do hodowli tkankowejVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polibren Odczynnik do infekcji / transfekcjiMillipore SigmaTR-1003-GCAS: 28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Plasma Plasma Inaktywowanatermicznie Innowacyjne badaniaISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX, HEPESGibco72400047
zestaw mikropęcherzyków streptawidyny (zawiera bufor separacyjny Akadeum)Akadeum11110-000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T Cell IsolationMicrobubble ActivationPeripheral Blood MononuclearT Cell ExpansionBuoyancy Activated Cell SortingCD3 Positive SelectionAnti CD28 MicrobubblesFlow CytometryT Cell ExhaustionActivation Marker CD69

Related Articles