Celem tego badania jest wykazanie wykonalności separacji opartej na flotacji w celu izolacji, aktywacji i ekspansji pierwotnych ludzkich limfocytów T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proces izolowania limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w celu założenia hodowli ex vivo jest kluczowy dla badań, testów klinicznych i terapii komórkowych. W tym badaniu przedstawiono prosty, nowatorski protokół izolacji, aktywacji i ekspansji limfocytów T z PBMC ex vivo. W badaniu wykorzystano technologię funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wyporem (BACS) do izolacji i aktywacji limfocytów T. Krótko mówiąc, protokół obejmuje pozytywną selekcję komórek CD3 + z PBMC pochodzących z leukopaku, a następnie 48-godzinną kostymulację wstępnie sprzężonymi mikropęcherzykami streptawidyny związanymi z anty-CD28 (SAMB) przed transdukcją w 24-dołkowych płytkach. Funkcjonalizowane mikropęcherzyki oferują wyjątkową możliwość aktywowania komórek, prowadząc do proliferacyjnych fenotypów, które pozwalają na ekspansję przy minimalnym wyczerpaniu. Technika ta zapewnia zmniejszone wyczerpanie, ponieważ mikropęcherzyki kostymulujące pozostają wyporne i wracają na wierzch pożywki hodowlanej, skracając w ten sposób czas, w którym rozprężające się komórki stykają się z czynnikami kostymulującymi. Wyniki wskazują, że wyizolowane i wyhodowane limfocyty T otrzymują wystarczającą stymulację, aby aktywować i proliferować, ale nie w stopniu, który prowadzi do nadmiernej aktywacji, co z kolei prowadzi do wyczerpania, o czym świadczy obecność nadmiernej ilości PD-1.
Wprowadzenie
Obecnie na całym świecie prowadzonych jest ponad 500 badań klinicznych nad terapią komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T, a na rynku dostępne są cztery produkty terapii komórkowej CAR-T1. Jednak nadal istnieje wiele potrzeb w zakresie badań i produkcji komórek CAR-T, które należy zaspokoić, aby poprawić skuteczność, skalowalność i długoterminowy sukces tych potencjalnie leczniczych terapii2,3,4,5. Adoptywne badania kliniczne i produkcja komórek CAR-T rozpoczynają się od izolacji limfocytów T z próbki krwi obwodowej, a następnie stymulacji, transdukcji i ekspansji izolowanych komórek. Parametry takie jak regeneracja limfocytów T, czystość i sygnały aktywacji/wyczerpania wymagają starannego rozważenia przy wyborze technik izolacji i stymulacji komórek do badań i produkcji komórek CAR-T3,4,6. Co ważne, poprawa trwałości terapeutycznej terapii komórkami CAR-T poprzez zminimalizowanie przeszkód biologicznych wynikających z obecnych procesów produkcyjnych, takich jak wyczerpanie limfocytów T, jest niezbędna do zwiększenia skuteczności terapeutycznej6,7.
Jako alternatywę dla tradycyjnych metod izolacji komórek, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS), tutaj pokazano sortowanie komórek aktywowane wyporem (BACS) z mikropęcherzykami do izolacji komórek T. Separacja mikropęcherzyków wykorzystuje pływające, puste w środku mikrosfery (mikropęcherzyki) do wiązania celów i unoszenia ich na powierzchni próbek płynów8,9. Poprzez funkcjonalizację mikropęcherzyków przeciwciałami (tj. Anty-CD3), pożądane populacje limfocytów T mogą być pozytywnie wybrane z próbek krwi obwodowej. Następnie w pracy wykazano zastosowanie innej populacji mikropęcherzyków funkcjonalizowanych przeciwciałami (tj. anty-CD28) do kostymulacji i aktywacji pozytywnie wybranych limfocytów T w zawiesinie. Mikropęcherzyki oferują prosty i wysoce regulowany przepływ pracy izolacji i aktywacji, który generuje limfocyty T gotowe do zawieszonej hodowli komórkowej i dalszych zastosowań, takich jak modyfikacja genetyczna i ekspansja. Co najważniejsze, aktywacja komórek za pomocą mikropęcherzyków sprzyja powściągliwej stymulacji komórek, aby zapobiec nadmiernemu wyczerpaniu limfocytów T7.
Dla tego badania, cytometria przepływowa była podstawowym narzędziem używanym do analizy sukcesu izolacji, aktywacji i transdukcji funkcjonalizowanych mikropęcherzyków, a także do dostarczania szczegółowych informacji o konkretnych subpopulacjach obecnych podczas faz wzrostu i ekspansji po transdukcji. Oprócz cytometrii przepływowej wykorzystano mikroskopię jasnego pola i fluorescencji, aby potwierdzić zdrowie komórek, morfologię i sukces transdukcji. Opierając się na tych wynikach, technologia i protokół mikropęcherzyków stanowią bardziej dostrajalną i łagodniejszą alternatywę dla tradycyjnych metod izolacji i aktywacji, które są obecnie stosowane; w szczególności komórki aktywowane mikropęcherzykami wykazują znacznie niższą ekspresję markerów wyczerpania limfocytów T niż zwykle obserwowane przy użyciu standardowych narzędzi i zestawów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Izolacja limfocytów T za pomocą mikropęcherzyków za pomocą selekcji pozytywnej
UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje podejście do pozytywnej selekcji CD3+ na małą skalę przy użyciu SAMB.
- Inkubować 3 x 108 komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 ml buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3 (OKT3) w stężeniu 25 ng przeciwciała na 1 milion komórek (25 ng / M). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Dodać mikropęcherzyki streptawidyny (SAMB) w stosunku 0,5 (ilość SAMB):1 (ilość komórek) zgodnie ze stężeniem SAMB podanym przez producenta.
- Mieszać za pomocą komercyjnego rotatora typu end-over-end (EOE) przy 20 obr./min przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej.
- Po odwirowaniu, pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z SAMB. Pozostałe niewybrane komórki znajdą się w granulce komórek na dnie probówki. Za pomocą szklanej pipety o średnicy 9 cali włóż końcówkę poniżej warstwy komórek pęcherzykowych na dno probówki, odessaj osad komórek i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieś je do nowej probówki.
2. Kostymulacja (aktywacja) pozytywnie wybranych limfocytów T
- Ponownie zawiesić warstwę komórek bąbelkowych pozostałą w oryginalnej probówce w 1 ml kompletnego podłoża z komórek T (lub innego pożądanego podłoża).
- Policz komórki w subnatance za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu automatycznego licznika komórek i odejmij tę wartość od początkowej liczby komórek, aby określić liczbę komórek przechwyconych w warstwie komórek bąbelkowych.
- Przed tym etapem należy mieszać biotynylowane przeciwciało anty-CD28 z dostępnymi na rynku SAMB przez co najmniej 2 godziny, aby uzyskać sprzężone przeciwciała anty-CD28 SAMB. Skontaktuj się z producentem SAMBs, aby określić ilość przeciwciała anty-CD28 potrzebną do koniugacji. Dodaj sprzężone SAMB anty-CD28 do zawiesiny komórek pęcherzykowych wynikającej z kroku 2.1 w stosunku 1,5 (SAMB anty-CD28):1 (komórki).
- Mieszać przy użyciu rotacji EOE przez 15 minut, a następnie dostosować całkowitą objętość do 2 milionów komórek na ml z kompletną pożywką z komórek T lub inną pożądaną pożywką zgodnie z liczbą komórek uzyskaną w kroku 2.2.
3. Ekspansja współstymulowanych komórek w pożywce do hodowli komórkowych
- Rozprowadzić 1 ml aktywowanych komórek z kroku 2.4 w stężeniu 2 M/ml na dołek na płytkę 24-dołkową. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po 24 godzinach dodać 50 U/ml IL-2 i 25 ng/m rozpuszczalnego anty-CD3 (OKT3), aby jeszcze bardziej zachęcić do ekspansji, zgodnie z obliczeniami na podstawie początkowej liczby komórek posianych w dniu 0. Umieścić płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze CO2 i pozostawić do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C.
4. Opcjonalnie: Transdukcja aktywowanych limfocytów T za pomocą lentiwirusa
UWAGA: Podejście użyte tutaj jest zaczerpnięte z Prommersberger et al.10.
- Rozmrozić lentiwirusa w temperaturze pokojowej i krótko wymieszać pipetując.
- Delikatnie usunąć środkowy natant, 600 μl z każdej studzienki, nie dotykając komórek potomnych, które znajdują się teraz na dnie studzienki lub warstwy pęcherzyków, która pozostała na powierzchni roztworu.
- Dodać 5 μg/ml bromku heksadimetryny na studzienkę, aby zwiększyć transdukcję wirusa. Dodaj cząsteczki lentiwirusa przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3 (cząstki lentiwirusa na komórkę).
- Odwirować płytkę przez 45 minut przy 800 x g i temperaturze 32 °C, stosując powolne przyspieszanie i bez przerw na zwalnianie. Inkubować komórki przez 4 godziny w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po 4 godzinach dodać 600 μl dostępnej, świeżej, kompletnej pożywki z limfocytów T i 50 U/ml IL-2 do każdej studzienki i umieścić płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w celu ekspansji limfocytów T.
5. Ekspansja limfocytów T (z lub bez wcześniejszej transdukcji)
- Co 2 dni usuwaj połowę pożywki ze środkowego natantu, zastąp ją świeżą, kompletną pożywką z limfocytów T i dodaj IL-2 w stężeniu 50 U/ml.
- Policz limfocyty T dwa razy w tygodniu, aby ocenić gęstość komórek. Gdy gęstość komórek przekroczy 2 x 10 6-2,5 x 106 komórek / ml, przenieś komórki do większego naczynia, rozcieńczając je do 5 x 105 komórek / ml.
6. Pobieranie limfocytów T i cytometria przepływowa
- Delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki, pipetując w górę i w dół. Usuń całą zawartość studzienki, w tym mikropęcherzyki, i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Przemyć każdą studzienkę 400 μl DPBS bez wapnia i magnezu (−/−) i przenieść roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu separacyjnego.
- Wybarwić koktajlem przeciwciał aktywujących i wyczerpujących/barwiących i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przygotuj koktajle barwiące w następujący sposób: koktajl aktywacyjny: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; koktajl wydechowy: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
- Dodać 1 ml buforu separacyjnego i delikatnie wymieszać. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wypłukać nadmiar przeciwciał. Całkowicie odessać supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu separacyjnego i przenieść do odpowiedniego naczynia (np. probówki FACS, płytki 96-dołkowej itp.) w celu analizy cytometrii przepływowej. Zalecany schemat bramkowania analizy cytometrii przepływowej jest szczegółowo opisany w Rysunek 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Limfocyty T wyizolowano z zakupionych PBMC i wysiano w celu aktywacji zgodnie z opisem w protokole. Próbki kontrolne ujemne (zakupione PBMC) nie były aktywowane. Próbki kontrolne te włączono w celu wykazania wpływu procesu aktywacji mikropęcherzykami na próbki doświadczalne w porównaniu z niepoddanymi działaniom i niepobudzonymi kontrolnymi limfocytami T, aby upewnić się, że zaobserwowane markery aktywacji były wynikiem dodanych czynników aktywujących, a nie cechą immanentną samych limfocytów T. Zgodnie ze schematem dośw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany protokół pozwala na izolację limfocytów T z próbek PBMC oraz aktywację zawieszonych limfocytów T w pożywkach hodowlanych z mikropęcherzykami. Metoda ta opiera się na funkcjonalizowanych mikropęcherzykach, których naturalna wyporność daje wyjątkową możliwość wprowadzenia sygnałów kostymulujących do komórek i aktywacji ich, gdy są zawieszone w pożywce hodowlanej, zmniejszając w ten sposób ekspozycję rozszerzających się komórek na długotrwałą stymulację; taka nadmierna stymulacja może skutkować zwiększoną ekspresją ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy, w momencie składania zgłoszenia, są pracownikami firmy Akadeum Life Sciences, która zajmuje się produkcją i sprzedażą produktów do separacji mikropęcherzyków.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-dołkowe płytki | VWR | 76081-560 | |
| Biotyna anty-ludzka CD28 (28.2) Przeciwciało | Biolegend | 302904 | |
| Biotyna anty-ludzka CD3 (OKT3) Przeciwciało | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, bez wapnia, bez magnezu | Gibco | 14190-136 | |
| Suplement GlutaMAX | Thermofisher | 35050061 | |
| Ludzki rekombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Cząsteczka lentiwirusowa rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normalne ludzkie PBMC | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicylina/Streptomycyna 100X do hodowli tkankowej | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polibren Odczynnik do infekcji / transfekcji | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS: 28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Plasma Plasma Inaktywowana | termicznie Innowacyjne badania | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| zestaw mikropęcherzyków streptawidyny (zawiera bufor separacyjny Akadeum) | Akadeum | 11110-000 |
Bibliografia
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
